高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠胰島IRc/IRS-1低表達(dá)*

謝 敏 李 競(jìng) 高 凌 徐曉藝 李 錚

高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗小鼠胰島IRc/IRS-1低表達(dá)*

謝 敏 李 競(jìng)#高 凌 徐曉藝 李 錚

目的：觀察高脂飲食誘導(dǎo)的胰島素抵抗模型小鼠胰島上胰島素受體(IRc)/胰島素受體底物-1(IRS-1)表達(dá)的變化。方法：20只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為高脂飼料模型組和普通飼料對(duì)照組，每組各10只。喂養(yǎng)20周后，觀察兩組小鼠大體情況，稱量體重(BW)，酶法測(cè)空腹血糖(FBG)，酶聯(lián)免疫法測(cè)空腹胰島素(FIns)濃度，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)；HE染色觀察胰島組織學(xué)變化；免疫組織化學(xué)染色分析胰島IRc/IRS-1的表達(dá)。比較兩組各檢測(cè)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果：模型組FBG、HOMA-IR明顯高于對(duì)照組(P均<0.01)；胰島邊界欠完整，內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，伴炎性細(xì)胞浸潤；IRc/IRS-1的表達(dá)較對(duì)照組明顯降低(P均<0.05)。結(jié)論：高脂飲食可成功誘導(dǎo)小鼠外周胰島素抵抗，且胰島上IRc/IRS-1的表達(dá)降低。

高脂飲食；胰島素抵抗；胰島素受體；胰島素受體底物-1

胰島素抵抗是2型糖尿病主要病理生理機(jī)制之一，同時(shí)對(duì)代謝綜合征的形成也起關(guān)鍵作用。胰島素抵抗的機(jī)制十分復(fù)雜，通常根據(jù)胰島素的作用環(huán)節(jié)，分別在胰島素受體前、受體及受體后三個(gè)水平上進(jìn)行探討，近年研究認(rèn)為胰島素抵抗主要是因受體后信號(hào)傳導(dǎo)障礙所致[1]。既往有研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，在動(dòng)物和人的α細(xì)胞和β細(xì)胞上存在胰島素受體及其下游的信號(hào)通路，即胰島素受體(Insulin Receptor，IRc)/胰島素受體底物-1(Insulin Receptor Substrate-1,IRS-1)，但對(duì)其在胰島中的信號(hào)傳導(dǎo)研究較少。本研究采用高脂飲食喂養(yǎng)小鼠誘導(dǎo)胰島素抵抗模型，觀察其胰島IRc/IRS-1表達(dá)水平的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：昆明小鼠，SPF級(jí)，雄性，3-4周齡，體重28-32g，購自武漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，質(zhì)量合格證號(hào)：SCXK(鄂)2008-0004。飼養(yǎng)于武漢大學(xué)人民醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，SPF級(jí)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組，每組10只：對(duì)照組采用普通飼料喂養(yǎng)，脂肪占總熱量的10%；模型組所喂飼料中脂肪占總熱量的60%。兩組小鼠均分籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水，光照時(shí)間為每日8∶00 至20∶00，共飼養(yǎng)20 周。

1.1.2 主要試劑與儀器：胰島素放射免疫測(cè)定試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技有限公司，E-EL-M0054)，IRc抗體(美國abcam公司，ab60946)，IRS-1抗體(美國abcam公司，ab52167)，戊巴比妥鈉、4%中性甲醛、無水乙醇、二甲苯、PBS緩沖液、EDTA抗原修復(fù)液(武漢谷歌生物科技公司)，BSA(美國Sigma公司)。

血糖儀與血糖試紙(穩(wěn)豪，美國強(qiáng)生)，分析天平(CP124S，德國Sartorius)，稱量器(MP2001，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，病理切片機(jī)(RM2016，上海徠卡儀器有限公司)，酶標(biāo)儀(Victor3 1420 Multilable Counter，美國Perkin Elmer)，倒置熒光顯微鏡(IX51，日本奧林巴斯)。

1.2 檢測(cè)指標(biāo)和方法

1.2.1 小鼠大體情況及體重：喂養(yǎng)20周后，觀察小鼠毛色及精神狀況，觀測(cè)墊料潮濕程度(評(píng)估尿量)，并稱量?jī)山M小鼠體重。

1.2.2 空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FIns)和胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)：兩組小鼠喂養(yǎng)20周后禁食12h，用3%戊巴比妥鈉(50mg/kg)腹腔注射麻醉后，將尾尖剪去5mm，自尾根部向尾尖端按摩至血液流出；取血液按血糖儀操作說明測(cè)定FBG。之后，用左手拇、食指抓住小鼠雙耳及頸后皮膚，小指固定尾部，中指將小鼠左側(cè)前肢輕壓在胸骨心臟部位，無名指按在腹部,使左側(cè)眼球突出；以彎頭鑷摘去眼球，將頭向下倒置，血液自眼眶流出，留取血液靜置30min后，4℃，10 000rpm離心20min，吸取上層血清，用放射免疫分析法檢測(cè)FIns，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。HOMA-IR=(FBG×FIns)/22.5，其中FBG單位為mmol/L，F(xiàn)Ins單位為mU/L，HOMA-IR>2.7為胰島素抵抗模型制作成功[5]。

1.2.3 胰腺HE染色：眼框取血后斷椎處死小鼠，開腹，在脾、胃之間和十二指腸彎處分離并取出胰腺，放入4%中性甲醛(用pH 7.0-7.2的磷酸緩沖液配制)中固定48h后酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟包埋，連續(xù)切片(約4μm)，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察胰島形態(tài)和組織學(xué)變化。

1.2.4 IRc/IRS-1測(cè)定：將上述石蠟包埋胰腺組織切片，進(jìn)行脫蠟、脫水，3%過氧化氫避光室溫靜置30min后沖洗，進(jìn)行抗原修復(fù)；將稀釋一抗(1∶100)滴于切片上，室溫過夜孵育；沖洗，自然干燥后加入二抗，室溫孵育30min，用PBS反復(fù)沖洗3次；滴加堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈酶卵白素工作液，室溫孵育；沖洗，滴加顯色劑，顯微鏡下觀察并及時(shí)用自來水沖洗以終止反應(yīng)；最后用自來水沖洗，復(fù)染、脫水、透明、封片。IRc/IRS-1陽性表達(dá)區(qū)域?yàn)辄S色。采用OLYMPUS IX51顯微鏡進(jìn)行圖像采集，IPP6.0圖像分析系統(tǒng)檢測(cè)圖片中陽性染色區(qū)域的平均光密度值(MOD)。每只小鼠取3張切片，每張切片選取3-6個(gè)胰島進(jìn)行觀察，取其平均值為該只小鼠IRc/IRS-1的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 兩組小鼠體重和一般情況比較

造模前，兩組小鼠皮毛光澤度好，精神良好。造模后，模型組小鼠毛發(fā)暗黃，精神煩躁，攝食增加，飲水增多，尿量增多；體重較對(duì)照組有所增加，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(63.75±6.30g vs 58.88±7.59g，t=-1.617，P>0.05)。

2.2 兩組小鼠FBG、FIns和HOMA-IR比較

20周后，模型組小鼠FBG和HOMA-IR明顯高于對(duì)照組(t=-5.142， -4.674，P均<0.01)，兩組FIns水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-1.927，P>0.05)。見表1。

2.3 兩組小鼠胰島形態(tài)比較

對(duì)照組小鼠胰島大小不等，分布均勻，界限清晰，未見炎性細(xì)胞和水腫。模型組小鼠胰島邊界欠完整，內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，胰腺組織血管內(nèi)有炎性細(xì)胞浸潤(見圖1)。

2.4 兩組小鼠胰島IRc、IRS-1表達(dá)比較

IRc、IRS-l僅在胰島細(xì)胞中表達(dá)。模型組小鼠IRc 、IRS-1在胰島的中心及周邊均有減少(圖2)，半定量分析顯示,模型組小鼠IRc 、IRS-1的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(t= 3.534，4.025，P<0.05或P<0.01，見表2)。

表1 兩組小鼠FBG、FIns和HOMA-IR比較均=10)

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.01

表2 兩組胰島細(xì)胞IRc、IRS-1表達(dá)量比較均=10)

注：與對(duì)照組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

[本文圖1、圖2見封2]

3 討 論

胰島素抵抗作為2型糖尿病、高血壓、脂代謝紊亂、微量蛋白尿、多囊卵巢綜合征、高凝血癥等代謝綜合征共同的發(fā)病基礎(chǔ)而備受重視[6]，但胰島素抵抗的發(fā)生機(jī)制十分復(fù)雜，從胰島素合成、與細(xì)胞表面的胰島素受體結(jié)合、到胰島素最終生理效應(yīng)的實(shí)現(xiàn)等一系列過程都與其相關(guān)。目前的研究認(rèn)為2型糖尿病的受體前水平缺陷不是胰島素抵抗的主要原因，胰島素受體和受體后缺陷才是重要原因[1,7]。

早在1985年，Van Schravendijk等[8]就采用放射性配基法確定了分離純化的α細(xì)胞和β細(xì)胞上均存在IRc。隨后Harbeck等[9]發(fā)現(xiàn)，胰島β細(xì)胞上存在胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，且認(rèn)為β細(xì)胞的IRS-1與磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)介導(dǎo)的胰島素分泌有關(guān)，IRS-2與β細(xì)胞自身的生長、生存和功能有關(guān)[10]。而Araujo等[4]通過熒光雙標(biāo)染色觀察到胰島α細(xì)胞與β細(xì)胞一樣，也表達(dá)IRC、IRS-1和IRS-2蛋白，并證實(shí)胰島素能通過IRS-1途徑抑制胰島α細(xì)胞胰高血糖素的表達(dá)和釋放。

在本實(shí)驗(yàn)中高脂飼料喂養(yǎng)20周小鼠的FBG和HOMA-IR明顯高于對(duì)照組，同時(shí)，胰島IRc、IRS-1表達(dá)陽性，且模型組小鼠胰島中心及周邊區(qū)域IRc 、IRS-1的表達(dá)較對(duì)照組小鼠明顯降低，表明α細(xì)胞和β細(xì)胞都出現(xiàn)了IRc 和IRS-1表達(dá)下調(diào)。

綜上，高脂飼料喂養(yǎng)20周可致小鼠外周胰島素抵抗，驗(yàn)證了高脂飲食與肥胖、胰島素抵抗的關(guān)系。胰島IRc 和IRS-1表達(dá)下調(diào)與胰島α細(xì)胞和β細(xì)胞的胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙有關(guān)。提示可通過上調(diào)胰島IRc/IRS-1通路來減少胰島素抵抗的發(fā)生，為代謝性疾病治療提供新的方向。

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本文第一作者簡(jiǎn)介：

謝 敏(1989—),女,漢族,碩士研究生,研究方向:2型糖尿病及其并發(fā)癥

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8 Van Schravendijk CF, Foriers A, Hooghe-Peters EL, et al. Pancreatic hormone receptors on islet cells[J]. Endocrinology,1985,117(3):841-848.

9 Harbeck MC, Louie DC, Howland J, et al. Expression of insulin receptor mRNA and insulin receptor substrate 1 in pancreatic islet beta-cells[J]. Diabetes,1996,45(6):711-717.

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Low Expression of Islet IRc/IRS-1 in High-fat Diet induced Insulin Resistance Mice

XIE Min,LI Jing#,GAO Ling,XU Xiao-yi,LI Zheng

Department of Endocrinology, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060, China；#

Objective: To observe high-fat diet induced insulin resistance mice model and the expression of islet insulin receptor( IRc)/insulin receptor substrate-1(IRS-1).Method: 20 male KM mice were randomly divided into two groups,which were fed with normal diet (control group) and high-fat diet (model group) respectively.Feeding 20 weeks later,the weight,fasting blood glucose, serum insulin levels and HOMA-IR were detected and the pancreatic tissue was observed through tissue slice with HE. Immunohistochemical staining was used to detect the expression of IRc and IRS-1.Results: The fasting blood glucose and HOMA-IR were significantly higher in model group than control group(P<0.01).Islet area was significantly less in model group than control group(P<0.05),and islet boundary was incomplete, internal structure of islet disorder, with inflammatory cells infiltration.The expression of the IRc and IRS-1 significant decreased in model group(P<0.05).Conclusion: High-fat diet can induce insulin resistance of mice and decrease the expression of islet IRc/IRS-1.

High-fat diet;Insulin resistance;Insulin receptor;Insulin receptor substrate-1

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81170767)

武漢大學(xué)人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，武漢 430030；#

，E-mail: lijing7823@hotmail.com

本文2014-09-12收到，2014-12-02修回

R587.1

A

1005-1740(2015)01-0001-03