發(fā)菜耐旱相關(guān)蛋白NXL-01的基因克隆與表達(dá)分析

梁文裕,楊　佳,吳詩(shī)杰,焦廣飛,王淑萍,徐婷婷

(1 寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,銀川 750021;2 福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,福州 350002)

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發(fā)菜耐旱相關(guān)蛋白NXL-01的基因克隆與表達(dá)分析

梁文裕1,楊佳1,吳詩(shī)杰1,焦廣飛2,王淑萍1,徐婷婷1

(1 寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,銀川 750021;2 福建農(nóng)林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,福州 350002)

摘要:在發(fā)菜耐旱差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,發(fā)現(xiàn)假定蛋白(Hypothetical protein NXL-01)在干旱脅迫條件下表達(dá)量逐漸增加。根據(jù)已知氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆NXL-01基因,長(zhǎng)度為327 bp(GenBank登錄號(hào)為HM854288)。生物信息學(xué)分析表明,該基因具有較高保守性,蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α螺旋和隨機(jī)卷曲構(gòu)成,是親水性的膜外蛋白,有5個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn),1個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn)。將NXL-01基因在大腸桿菌中表達(dá),獲得預(yù)期大小的重組蛋白(12.4 kD)。RT-PCR分析表明,NXL-01 mRNA在干旱脅迫條件下表達(dá)量逐漸增加,與NXL-01蛋白的表達(dá)趨勢(shì)一致。

關(guān)鍵詞:發(fā)菜;假定蛋白NXL-01;干旱脅迫;基因克隆;原核表達(dá)

干旱是影響植物的最主要非生物脅迫因素之一。植物對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)根本上決定于基因的時(shí)空表達(dá)與調(diào)節(jié)[1-3]。這些基因至少可分為兩類,一類是用于防止細(xì)胞脫水的結(jié)構(gòu)基因,另一類是脅迫誘導(dǎo)的與基因表達(dá)和信號(hào)傳導(dǎo)有關(guān)的調(diào)節(jié)基因。這些干旱脅迫誘導(dǎo)基因產(chǎn)物不僅通過(guò)重要代謝蛋白保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu),而且起調(diào)節(jié)信號(hào)傳導(dǎo)和基因表達(dá)的作用。隨著分子生物學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展,人們對(duì)植物抗旱相關(guān)基因表達(dá)的研究越來(lái)越集中到特異基因的分離克隆及其在干旱脅迫過(guò)程中的特異表達(dá)[4-5]方面。

發(fā)菜(Nostocflagelliforme)是一種分布于干旱半干旱荒漠草原地區(qū)的陸生固氮念珠藻,在結(jié)構(gòu)和生理上表現(xiàn)出強(qiáng)烈的旱生生態(tài)適應(yīng)性[6-8]。在發(fā)菜耐旱蛋白質(zhì)組學(xué)研究中,獲得了大量差異表達(dá)的蛋白,其中假定蛋白(hypothetical protein NXL-01)在2-DE圖譜上顯示的分子量為12.2 kD,pI為4.59,它在干旱脅迫條件下表達(dá)量明顯高于吸水條件下的表達(dá)量[6]。這種變化表明該蛋白可能在發(fā)菜耐旱機(jī)制中具有重要作用。本研究根據(jù)串聯(lián)質(zhì)譜分析所得的肽段氨基酸序列,設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物克隆NXL-01基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,研究其原核表達(dá)和干旱脅迫下轉(zhuǎn)錄水平變化,為進(jìn)一步研究發(fā)菜NXL-01結(jié)構(gòu)及其在干旱防御和脅迫應(yīng)答等方面的功能提供依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

發(fā)菜采自寧夏香山發(fā)菜自然生長(zhǎng)地,人工模擬發(fā)菜生長(zhǎng)環(huán)境進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為溫度(25±2) ℃,光周期為12 h光照/12 h黑暗,光照強(qiáng)度為200 μmol·m-2·s-1。每天供水1次,供水量一致,使發(fā)菜充分吸脹。培養(yǎng)30 d后測(cè)定光合速率和呼吸速率,確保處于正常生長(zhǎng)狀態(tài)(與野生狀態(tài)對(duì)照)。樣品處理:發(fā)菜藻體充分吸水4 h(4HAR),藻體含水量為(835±10)%;發(fā)菜藻體充分吸水4 h后干旱脅迫48 h(48HAD),藻體含水量為(9.5±2)%。將樣品立即放入液氮中冷凍后置于-80 ℃冰箱中備用。

1.2方法

1.2.1發(fā)菜NXL-01基因PCR擴(kuò)增發(fā)菜基因組DNA提取參考梁文裕等的方法[6]。

根據(jù)NXL-01的MALDI-TOF-TOF/MS肽質(zhì)量指紋圖譜測(cè)定的部分氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,上游引物為P1(5′-ATGAGTAACCC(C/A)CT(T/A)GTACA-3′),下游引物為P2[5′-(C/T)TA(C/T)(G/A)CAGAA(G/C)T(T/A)CTGCGAT-3′]。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性8 min,94 ℃變性 50 s,49 ℃退火50 s,72 ℃復(fù)性1 min,35個(gè)循環(huán);最后72 ℃延伸10 min。

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳后,回收純化連接到pMD18-T載體上,然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞,挑取陽(yáng)性克隆,PCR檢測(cè)后送至天根公司測(cè)序。

1.2.2序列分析將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行BLAST檢索,進(jìn)行基因確認(rèn)。運(yùn)用DNAMAN軟件對(duì)基因序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列與其他物種進(jìn)行同源性比較分析。運(yùn)用DNAstar 6.0軟件對(duì)氨基酸序列進(jìn)行分析。利用瑞士生物信息學(xué)研究所(Swiss Institute of Bioinformatics,SIB)ProtScale程序Kyte和Doolittle算法,對(duì)發(fā)菜NXL-01氨基酸序列做親/疏水性分析。利用DNAMAN、PBILLYON-GERLAND信息庫(kù)、SWISS MODEL網(wǎng)站和DNAStar軟件對(duì)Hypothetical protein NXL-01二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用丹麥科技大學(xué)(DTU)TMHMM Server v.2.0程序進(jìn)行NXL-01序列跨膜區(qū)分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/;參數(shù)選擇:Extensive with graphics)。利用丹麥科技大學(xué)(DTU)NetPhos 2.0 Server程序?qū)XL-01做磷酸化位點(diǎn)分析(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)。

用BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切純化的PCR產(chǎn)物和pET-28a載體,回收酶切產(chǎn)物,連接目的基因與載體片段,轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞,Kan抗性篩選陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒酶切鑒定,鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21感受態(tài)細(xì)胞,以終濃度為1 mmol·L-1IPTG誘導(dǎo)NXL-01表達(dá)。12.5% SDS-PAGE電泳檢測(cè)并分析。

1.2.4發(fā)菜總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄發(fā)菜總RNA提取、去除基因組DNA和總RNA純度測(cè)定等參照Liang[6]的方法。將去除基因組DNA的RNA直接作為反轉(zhuǎn)錄模板,反應(yīng)體系25 μL。反應(yīng)體系包含RNA模板10 μL,DEPC水5 μL,6個(gè)堿基的隨機(jī)引物pd(N)6(20 μmol/L)1 μL,混勻后于70 ℃反應(yīng)5 min,冰浴5 min,再依此加入5×MMLV RT Buffer 5 μL,dNTP(10 mmol/L)2 μL,RNase Inhibitor HPRI 1 μL,MMLV RNase H 1 μL。混勻后于42 ℃反轉(zhuǎn)錄1 h。反應(yīng)產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)或-20 ℃長(zhǎng)期保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5NXL-01表達(dá)的RT-PCR分析利用OMIGA2軟件設(shè)計(jì)發(fā)菜NXL-01引物。上游引物RT-P1(5′-AAGTTCTGCGATAATGTTG-3′),下游引物RT-P2(5′-GAGCAGTGGCTGAAGTAGT-3′),16s rRNA的p1(5′-CTGACACTGAGGGACGAA-3′)和p2(5′-CGGGACTTAACCCAACATT-3′)為內(nèi)標(biāo)基因的上下游引物。

提取吸水和干旱脅迫條件下發(fā)菜總RNA,按照前述反轉(zhuǎn)錄方法分別合成cDNA后進(jìn)行RT-PCR。先取不同的cDNA各1 μL,以16s rRNA基因作為內(nèi)標(biāo),根據(jù)其RT-PCR產(chǎn)物亮度調(diào)節(jié)需要加入cDNA模板的量,然后再根據(jù)確定的cDNA模板量進(jìn)行NXL-01的RT-PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增條件為94 ℃預(yù)變性5 min,94 ℃變性50 s,55 ℃退火50 s,72 ℃延伸1 min,共進(jìn)行28個(gè)循環(huán),72 ℃延伸10 min。

1.3數(shù)據(jù)處理

將所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行方差分析,檢驗(yàn)結(jié)果的差異顯著性。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)菜NXL-01基因的PCR擴(kuò)增及目的片段的克隆

將以發(fā)菜總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增的產(chǎn)物經(jīng)1%(W/V)瓊脂糖凝膠電泳鑒定,得到一條長(zhǎng)與預(yù)期大小相符的DNA擴(kuò)增片段(圖1)。

用DNA膠回收試劑盒回收目的片段連接到pMD18-T載體上,轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5a,挑選陽(yáng)性單菌落進(jìn)行PCR鑒定,擴(kuò)增產(chǎn)物在500 bp處出現(xiàn)特異性條帶,表明外源目的片段已成功克隆(圖2)。

2.2發(fā)菜NXL-01基因序列測(cè)定及同源分析

為進(jìn)一步鑒定所得到的DNA片段是否確為NXL-01基因,運(yùn)用pMD18-T載體通用引物對(duì)目的DNA片段進(jìn)行雙向測(cè)序。結(jié)果表明,目的DNA片段大小為327 bp。把測(cè)序結(jié)果提交NCBI進(jìn)行BLAST檢索,確定獲得了發(fā)菜NXL-01基因編碼序列,GenBank登錄號(hào)為HM854288(圖3)。

由NXL-01基因序列所推譯的氨基酸序列表明NXL-01包含108個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)DNAstar 6.0分析表明NXL-01分子量為11.765 kD,等電點(diǎn)為4.42,帶電荷總氨基酸為29.63%,極性氨基酸占25.00%,疏水氨基酸占37.96%,酸性氨基酸和堿性氨基酸分別占17.59%和10.19%。在Hypothetical protein NXL-01中含量豐富的氨基酸(頻率)分別為Ala(13.89%)、Leu(11.11%)、Glu(10.19%)、Arg(9.26%)、Asp(7.41%)、Ser(7.41%)、Val(7.41%)。

應(yīng)用DNAMAN軟件將發(fā)菜NXL-01基因核苷酸序列和氨基酸序列與GenBank中收錄的相關(guān)序列進(jìn)行BLAST比較,發(fā)現(xiàn)發(fā)菜NXL-01基因具有較高保守性,與點(diǎn)形念珠藻(N.punctiformePCC73102)假定的保守蛋白基因核苷酸相似性達(dá)93%,氨基酸相似性達(dá)92%;與泡沫節(jié)球藻(NodulariaspumigenaCCY 9414)假定保守蛋白基因核苷酸相似性達(dá)81.7%,氨基酸相似性為81.5%;與多變魚腥藻(AnanaenavariabilisATCC 29413)基因核苷酸相似性為78.3%,氨基酸相似性為80.6%;與念珠藻(Nostocsp.PCC 7120)基因核苷酸相似性為77.4%,氨基酸相似性達(dá)79.6%。而與顫藻(Oscillatoriasp.PCC 6506)基因核苷酸序列和氨基酸相似性最低,分別為59.3%和62.0%(圖4)。

圖1　NXL-01基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2　NXL-01基因重組質(zhì)粒陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子

2.3發(fā)菜NXL-01的疏水性、跨膜區(qū)、磷酸化位點(diǎn)分析及二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

對(duì)發(fā)菜NXL-01氨基酸序列疏水性分析表明,在第101位的Glu親水性最強(qiáng),第12位的Gly疏水性最強(qiáng)。從整體來(lái)看,親水性氨基酸主要分布在肽鏈的中部,且多于疏水性氨基酸。整個(gè)多肽鏈表現(xiàn)為親水性,表明NXL-01是親水性蛋白。

利用丹麥科技大學(xué)(DTU)的CBS服務(wù)器上的TMHMM Server v.2.0程序進(jìn)行蛋白序列跨膜區(qū)分析。結(jié)果表明,NXL-01為膜外蛋白。

利用NetPhos 2.0 Server程序?qū)Φ鞍仔蛄兄械腟er、Thr和Tys 3種氨基酸殘基可成為磷酸化位點(diǎn)作出預(yù)測(cè)。結(jié)果表明,發(fā)菜NXL-01有5個(gè)Ser磷酸化位點(diǎn),分別位于第68、71、76、77、107位。有1個(gè)Thr磷酸化位點(diǎn),位于106位。

運(yùn)用DNAMAN軟件、PBILLYON-GERLAND信息庫(kù)、SWISS MODEL網(wǎng)站和DNAStar軟件對(duì)NXL-01二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析表明,4種方法預(yù)測(cè)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中,雖然不同結(jié)構(gòu)的氨基酸數(shù)目和百分比有一定差異,但這主要是由于方法和原理不同所導(dǎo)致的。綜合分析認(rèn)為,發(fā)菜NXL-01二級(jí)結(jié)構(gòu)主要是由α螺旋和隨機(jī)卷曲構(gòu)成(表1)。

2.4NXL-01在E.coli中的表達(dá)

以質(zhì)粒pMD18-T-NXL-01為模板,PCR擴(kuò)增NXL-01基因。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物回收純化,用BamHⅠ和XhoⅠ進(jìn)行雙酶切后,與同樣經(jīng)BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切的質(zhì)粒pET28a(+)相連接,獲得NXL-01基因表達(dá)載體pET28a-NXL-01。將重組質(zhì)粒pET28a-NXL-01轉(zhuǎn)化到大腸桿菌培養(yǎng),通過(guò)卡納青霉素抗性挑選陽(yáng)性克隆,提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR和雙酶切驗(yàn)證。pET28a-NXL-01經(jīng)雙酶切后,在380 bp處出現(xiàn)1條特異條帶,與預(yù)期片段大小一致(圖5)。測(cè)序結(jié)果表明插入的DNA片段就是NXL-01基因。

將pET28a-NXL-01陽(yáng)性質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到BL21感受態(tài)細(xì)胞中,并以IPTG誘導(dǎo)NXL-01蛋白表達(dá),12.5% SDS-PAGE電泳,結(jié)果表明有大量外源蛋白表達(dá)(圖6),參照蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn),外源蛋白分子量約為12.4 kD,與預(yù)測(cè)的NXL-01分子量相同。經(jīng)凝膠掃描測(cè)定,IPTG誘導(dǎo)5 h后外源蛋白約占細(xì)菌蛋白總量的68.7%。

圖3　發(fā)菜NXL-01的核苷酸序列(上行)及推導(dǎo)氨基酸序列(下行)

圖4　NXL-01核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

分析方法Methodα螺旋αhelixβ折疊βstrands轉(zhuǎn)角Turn隨機(jī)卷曲RandomcoilDNAMAN76*(70.37%)**3(2.78%)029(26.86%)PBILLYON-GERLANDHopfield(HNN)79(73.15%)0029(26.85%)SWISSMODEL84(77.78%)2(1.85%)022(20.37%)DNAStar(Garnier-Robson)81(75.00%)1(0.93%)13(12.04%)13(12.04%)

注:*.氨基酸數(shù)目;**.占全部氨基酸的百分比。

Note:*.Amount of amino acid;**.Amino acid in total percentage.

圖5　重組表達(dá)載體pET28a-NXL-01酶切分析

圖6　NXL-01蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的

圖7　干旱脅迫條件下發(fā)菜NXL-01的

2.5發(fā)菜干旱脅迫條件下NXL-01基因表達(dá)特征

提取不同干旱條件下發(fā)菜總RNA,并進(jìn)行定量。取等量總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,并取等量反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,最后取等量PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳分析。結(jié)果(圖7)表明,在干旱脅迫條件下表達(dá)量明顯高于充分吸水時(shí)的表達(dá)量(P<0.05),這與NXL-01在干旱脅迫下的表達(dá)趨勢(shì)基本一致。

3討論

對(duì)某一新蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析是研究蛋白質(zhì)最基本和最常用的方法,多數(shù)情況下可以發(fā)現(xiàn)該蛋白的同源性或其擁有的家族成員,并且可以通過(guò)已知功能的其它成員對(duì)所關(guān)注蛋白功能、進(jìn)化速度等做出合理推斷[9-10]。本研究根據(jù)干旱脅迫條件下差異表達(dá)的NXL-01氨基酸序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物,成功克隆發(fā)菜中NXL-01基因。同源性比較發(fā)現(xiàn)發(fā)菜NXL-01基因具有較高保守性,與點(diǎn)形念珠藻(N.punctiformePCC 73102)假定的保守蛋白基因核苷酸相似性達(dá)93.3%,氨基酸相似性達(dá)91.7%。生物信息學(xué)分析表明NXL-01是一種親水性膜外蛋白,其Ser有5個(gè)磷酸化位點(diǎn),Thr有1個(gè)磷酸化位點(diǎn)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明發(fā)菜NXL-01主要由α螺旋和隨機(jī)卷曲構(gòu)成。這為進(jìn)一步研究發(fā)菜NXL-01結(jié)構(gòu)及其在發(fā)菜干旱防御和脅迫應(yīng)答以及提高發(fā)菜抗旱機(jī)制等方面奠定了基礎(chǔ)。此外,本研究構(gòu)建了發(fā)菜NXL-01高效表達(dá)載體,5 h的表達(dá)量占可溶性蛋白65 %以上,且以可溶性蛋白的形式存在,為今后利用工程菌大量生產(chǎn)NXL-01提供了試驗(yàn)依據(jù)。

蛋白質(zhì)(酶)是基因表達(dá)的產(chǎn)物,蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的發(fā)揮是多個(gè)因素綜合作用的結(jié)果。發(fā)菜NXL-01的表達(dá)與其生長(zhǎng)發(fā)育和所處的環(huán)境密切相關(guān)。發(fā)菜生長(zhǎng)于極端干旱的環(huán)境中,其風(fēng)干含水量在7.3%～11.2%之間,飽和含水量在616%～1 258.4%之間,相對(duì)含水量極低,只有1%左右,與其他旱生植物相比,對(duì)極端干旱環(huán)境具有更強(qiáng)的適應(yīng)能力[11]。此外,發(fā)菜在干旱脅迫條件下,新陳代謝減弱,光合活性降低,固氮能力下降,而恢復(fù)吸水時(shí),光合活性和固氮能力升高[12-14]。本研究表明,NXL-01 mRNA在干旱脅迫條件下表達(dá)量逐漸增加,與NXL-01的2-DE的結(jié)果一致[6],這一結(jié)果暗示NXL-01在發(fā)菜耐旱作用中可能發(fā)揮了重要作用。然而,發(fā)菜在其生長(zhǎng)發(fā)育和耐旱過(guò)程中,NXL-01究竟是單獨(dú)起到抗逆作用還是與其他因素相互影響共同抵御干旱環(huán)境的,仍需要深入研究。

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(編輯:宋亞珍)

Clone and Expression of Hypothetical Protein NXL-01 Related

to Drought-tolerant inNostocflagelliforme

LIANG Wenyu1,YANG Jia1,WU Shijie1,JIAO Guangfei2,WANG Shuping1,XU Tingting1

(1 School of Life Sciences,Ningxia University,Yinchuan 750021,China;2 College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Abstract:Nostocflagelliformeis a kind of terrestrial nitrogen-fixing cyanobacteria being strong drought ecological adaptability.An unknown protein related to drought-tolerant,named hypothetical protein NXL-01,has been discovered by the proteomic analysis under drought stress.NXL-01 gene was cloned by designed degeneracy primers based on identified amino acid sequences.A full length of 327 bp DNA was obtained(GenBank access number:HM854288).Bioinformatics analysis showed that theNXL-01 gene was highly conservative.The secondary structure of NXL-01 was made up of α helix and random coil.It was a hydrophilic outside membrane protein with five Ser phosphorylation sites and one Thr phosphorylation site.NXL-01 was expressed inE.coli,and a 12.4 kD heterologous protein was observed.RT-PCR showed that mRNA level ofNXL-01 gradually increased,consistent with the expression trend of NXL-01 inN.flagelliformeunder drought stress.

Key words:Nostocflagelliforme;hypothetical protein NXL-01;drought stress;gene clone;prokaryotic expression

*通信作者:易自力,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事生物質(zhì)能源研究。E-mail:yizili889@163.com

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:梁文裕(1969-),男,博士,教授,主要從事植物資源及植物分子生物學(xué)的研究。E-mail:liangwy2009@163.com 黃麗芳(1976-),女,碩士,助理研究員,主要從事生物新能源品種選育與栽培技術(shù)研究。E-mail:hlf20060829@163.com

基金項(xiàng)目:國(guó)家自然科學(xué)基金(31360054;31060038) 863課題(2011AA10020901);美國(guó)孟德?tīng)柹锛夹g(shù)公司合作項(xiàng)目(SR0373)

收稿日期:2014-07-23;修改稿收到日期:2014-11-03 2014-08-06;修改稿收到日期:2014-11-03

文章編號(hào):1000-4025(2015)01-0044-06 1000-4025(2015)01-0050-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0044 10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0050