荔枝古樹胚性愈傷組織LcCu/Zn-SOD3基因啟動(dòng)子的克隆及功能驗(yàn)證

練從龍,盧秉國(guó),賴鐘雄,馮　新,林玉玲,陳裕坤,張梓浩

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所,福州 350002)

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荔枝古樹胚性愈傷組織LcCu/Zn-SOD3基因啟動(dòng)子的克隆及功能驗(yàn)證

練從龍,盧秉國(guó),賴鐘雄*,馮新,林玉玲,陳裕坤,張梓浩

(福建農(nóng)林大學(xué) 園藝植物生物工程研究所,福州 350002)

摘要:以荔枝古樹“宋荔”胚性愈傷組織為材料,采用接頭染色體步移法,分離獲得LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子片段長(zhǎng)度為1 426 bp,命名為ProLcCSD3(GenBank登錄號(hào):KF672186.1)。生物信息學(xué)分析表明,該啟動(dòng)子含有多個(gè)逆境應(yīng)答元件、激素應(yīng)答元件、胚乳特異表達(dá)元件,且可能受WRKY和MYB等轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控。通過雙酶切方法,以ProLcCSD3替換載體pCAMBIA1301上的CaMv35S啟動(dòng)子,構(gòu)建了重組質(zhì)粒p1301-proLcCSD3-GUS,并成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105和GV3101。注射煙草的瞬時(shí)表達(dá)分析表明,該啟動(dòng)子片段可以驅(qū)動(dòng)下游報(bào)告基因表達(dá)。轉(zhuǎn)化擬南芥分析表明,該啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的下游GUS可以在擬南芥的根、莖、葉中表達(dá),且可響應(yīng)NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和損傷等非生物脅迫。研究表明,荔枝古樹LcCu/Zn-SOD3可能參與多種非生物脅迫應(yīng)答和激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。

關(guān)鍵詞:荔枝古樹;胚性愈傷組織;Cu/Zn-SOD3;啟動(dòng)子;功能驗(yàn)證

荔枝(LitchichinensisSonn.)屬無患子科(Sapindaceae)荔枝屬(Litchi),是熱帶亞熱帶地區(qū)風(fēng)光的代表性樹種,也是重要的經(jīng)濟(jì)樹種。古樹被譽(yù)為“活化石”,具有較高的觀賞、經(jīng)濟(jì)、文化價(jià)值,同時(shí)也是一座優(yōu)良種源基因庫(kù)[1]?！卫蟆鳛槔笾艠涞拇硇云贩N,位于福州西禪寺,歷經(jīng)千年,可能是國(guó)內(nèi)最高齡的古荔之一[2]?！卫蟆瘧{借頑強(qiáng)的生命力經(jīng)歷4次枯榮到目前仍長(zhǎng)勢(shì)良好,且每年仍可結(jié)出沉甸甸的果實(shí),其強(qiáng)大的生命力可算是生命的奇跡[3]。體現(xiàn)了其自身強(qiáng)大的環(huán)境適應(yīng)能力,也代表著荔枝整個(gè)生命的長(zhǎng)期演化過程。超氧化物歧化酶(SOD)抗性基因作為抗氧化系統(tǒng)的第一道防線,具有防御氧毒性、清除體內(nèi)氧自由基等作用,在植物抗氧化、抗逆等方面起著關(guān)鍵的作用[4],可能在維持“宋荔”整個(gè)生長(zhǎng)過程中活性氧的代謝平衡,防止其衰老而歷經(jīng)千年中起重要作用。

啟動(dòng)子作為基因表達(dá)的重要調(diào)控元件,是轉(zhuǎn)錄的調(diào)控中心,指導(dǎo)著RNA聚合酶與DNA模板的正確結(jié)合,并通過活化RNA聚合酶,募集相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子形成特異性的轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合體,進(jìn)而決定轉(zhuǎn)錄的方向和效率[5];同時(shí),啟動(dòng)子作為精確調(diào)控基因表達(dá)的“開關(guān)”,直接控制著下游基因的表達(dá),其含有的順式元件也直接反映了該基因的生物學(xué)功能。因此,通過對(duì)SOD基因啟動(dòng)子進(jìn)行研究,分析其調(diào)控元件,可為SOD基因的研究奠定一定的基礎(chǔ)。許珊珊[6]對(duì)‘宋荔’SOD基因的克隆與表達(dá)進(jìn)行了較為全面的研究。因此,本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上,采用接頭染色體步移法分離獲得荔枝古樹SOD基因家族LcCu/Zn-SOD3基因的啟動(dòng)子,并通過轉(zhuǎn)化煙草和擬南芥對(duì)其功能進(jìn)行初步驗(yàn)證分析,為進(jìn)一步深入研究SOD在荔枝古樹中的時(shí)空表達(dá)特性、生物學(xué)功能以及抗逆轉(zhuǎn)基因研究奠定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1供試材料

‘宋荔’胚性愈傷組織,采自福州西禪寺‘宋荔’的花藥誘導(dǎo)而成,由福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所保存。

1.2方法

1.2.1荔枝基因組DNA的提取及檢測(cè)采用改良CTAB法[7]提取‘宋荔’基因組DNA,并經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。

1.2.2荔枝LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子的克隆及測(cè)序利用接頭染色體步移法對(duì)荔枝LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子進(jìn)行克隆。參照Genome WalkingTMUniversal kit(Clonetech)試劑盒說明進(jìn)行操作,步驟如下:首先,對(duì)檢驗(yàn)合格的荔枝基因組DNA分別進(jìn)行DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ 4種平末端限制酶酶切并純化;然后,將荔枝基因組DNA的4種酶切產(chǎn)物分別與試劑盒中的Genome WalkerTMAdaptors連接構(gòu)建4種Genome Walker文庫(kù);最后,以構(gòu)建好的4種文庫(kù)為模板,在LcCu/Zn-SOD3基因組序列(KF672186)靠近5端處設(shè)計(jì)的兩條反向互補(bǔ)引物分別與接頭引物AP1、AP2引物配對(duì),進(jìn)行兩輪的巢式PCR。PCR體系及two-step cycle程序詳見Genome WalkingTMUniversal kit(Clonetech)說明書。其中所用引物有AP1、AP2、LcCSD3-GSP1和LcCSD3-GSP2(表1)。

1.2.3目的片段的回收、TA克隆與測(cè)序?qū)CR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖(1.0%)電泳檢測(cè),割膠回收目的片段。將目的片段克隆至pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a并進(jìn)行培養(yǎng)。最后,PCR菌檢后挑取陽性克隆,送華大基因公司測(cè)序。

1.2.4荔枝LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子的序列分析首先,利用Neural Network Promoter Prediction(http://www.fruitfly.org/seq_tools/pro moter.html)在線軟件分析該啟動(dòng)子可能的核心啟動(dòng)子區(qū)域及轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn);其次,使用PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)并結(jié)合PLACE(http://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/signalup.html)在線軟件分析該啟動(dòng)子序列潛在的順式作用元件。

表1　啟動(dòng)子克隆及載體構(gòu)建引物

1.2.5荔枝LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子瞬時(shí)表達(dá)載體的構(gòu)建首先,克隆帶酶切位點(diǎn)的目的片段BamHⅠ-proLcCSD3-NcoⅠ。在啟動(dòng)子上游引物引入BamHⅠ(5′-GGATCC-3′)酶切位點(diǎn),下游引入NcoⅠ(5′-CCATGG-3′)酶切位點(diǎn),所設(shè)計(jì)引物見表1的proLcCSD3-F和proLcCSD3-R。以含有該啟動(dòng)子序列的質(zhì)粒為模板,利用高保真酶KOD-Plus-Neo(Code:KOD041)進(jìn)行PCR,獲得目的片段后割膠回收,測(cè)序正確后,將該回收產(chǎn)物命名為BamHⅠ- proLcCSD3-NcoⅠ。

其次,構(gòu)建p1301-proLcCSD3-GUS重組質(zhì)粒。利用Thermo公司的FastDigestBamHⅠ和FastDigestNcoⅠ雙酶切pCAMBIA1301和回收產(chǎn)物BamHⅠ-proLcCSD3-NcoⅠ,并分別回收pCAMBIA1301的大片段和BamHⅠ-proLcCSD3-NcoⅠ酶切的目的片段。將回收的兩條片段進(jìn)行連接,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌,菌液鑒定,提取該重組質(zhì)粒,并進(jìn)行雙酶切和特異引物PCR的雙重鑒定,將構(gòu)建成功質(zhì)粒命名為p1301-proLcCSD3-GUS。

最后,將重組質(zhì)粒p1301-proLcCSD3-GUS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105和GV3101。取5 μL重組質(zhì)粒于100 μL的農(nóng)桿菌中,充分混勻,通過凍融法轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌[8],并進(jìn)行菌檢。

1.2.6荔枝LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草的瞬時(shí)表達(dá)鑒定以不攜帶任何載體的空菌株EHA105為陰性對(duì)照、CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的pCAMBIA1301的EHA105菌株為陽性對(duì)照,和攜帶目的質(zhì)粒的陽性EHA105分別通過注射法注入煙草葉片[9],3 d后用打孔器取下煙草葉片的注射部位進(jìn)行GUS組織化學(xué)染色[10]鑒定。

1.2.7荔枝LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化擬南芥的功能鑒定以Columbia野生型擬南芥植株為陰性對(duì)照,以CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)GUS基因的pCAMBIA1301的GV3101菌株為陽性對(duì)照和攜帶目的質(zhì)粒的陽性GV3101分別通過花絮浸染法轉(zhuǎn)化擬南芥[11]。即將待轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌GV3101單菌落于含str+kan各100 mg/L的50 mL YEB中,28 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng);離心,收集菌體,重懸于5% 蔗糖懸浮液中,懸浮液濃度調(diào)至OD600為0.8左右;選取花蕾期的擬南芥,將花蕾浸泡到重懸液中數(shù)秒;培養(yǎng)室下黑暗保濕培養(yǎng)1 d,之后正常光照生長(zhǎng),直至開花收種。

1.2.8T1代轉(zhuǎn)基因擬南芥篩選將存放在4 ℃冰箱的T0代擬南芥種子先采用75%的乙醇處理1 min,后用10%的NaClO處理10 min,期間不斷振蕩,最后用無菌水漂洗種子數(shù)次進(jìn)行消毒。將消毒后的種子平鋪在含有潮霉素的MS固體培養(yǎng)基上,4 ℃春化2 d后移至培養(yǎng)箱中正常光照萌發(fā)。待長(zhǎng)出2片真葉后,將植株移至營(yíng)養(yǎng)土中正常光照生長(zhǎng)。

1.2.9轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS組織化學(xué)染色分析和DNA水平檢測(cè)選取部分經(jīng)潮霉素篩選的轉(zhuǎn)化植株,于GUS 染色液中過夜染色后,加入75% 乙醇70 ℃水浴脫色至無色后,觀察拍照[10]。之后,每種轉(zhuǎn)基因株系分別隨機(jī)選取經(jīng)GUS染色驗(yàn)證成功的8株植株,進(jìn)行DNA水平的鑒定,即提取植物總DNA,采用相應(yīng)啟動(dòng)子的載體構(gòu)建引物進(jìn)行目的片段的PCR驗(yàn)證。

1.2.10轉(zhuǎn)基因擬南芥不同株系脅迫處理選取經(jīng)GUS染色和DNA水平鑒定轉(zhuǎn)化成功的轉(zhuǎn)ProLcCSD3擬南芥株系,待其蓮座葉片完全展開而還未抽薹時(shí),分別進(jìn)行200 mmol/L NaCl、15% PEG-6000模擬干旱、100 μmol/L ABA、50 μmol/L MeJA和針刺葉片的損傷處理,分別在處理后的0、6和24 h取樣,同一單株的取樣根據(jù)擬南芥生長(zhǎng)特點(diǎn)取大小、長(zhǎng)勢(shì)相同的靠基部相對(duì)較大的葉片。其中NaCl和模擬干旱處理采用澆灌法,即在營(yíng)養(yǎng)缽上分別注入等體積配置好的溶液;ABA和 MeJA處理采用葉片噴施,即在處理的葉面上均勻的噴灑配置好的液體,并以水噴灑處理為對(duì)照,覆蓋保鮮膜;損傷處理采用針刺造成葉片上等量的多個(gè)小孔傷害。最后,將采取的樣本進(jìn)行GUS熒光定量活性分析[12]。

2結(jié)果與分析

2.1荔枝LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子的克隆

啟動(dòng)子克隆結(jié)果表明,從限制性內(nèi)切酶EcoRⅤ和StuⅠ酶切的文庫(kù)中,分別獲得長(zhǎng)度約1 100 bp和1 500 bp的擴(kuò)增條帶(圖1)。測(cè)序所得實(shí)際長(zhǎng)度分別為1 062 bp和1 491 bp,DNAMEN軟件比對(duì)分析表明其為同一條序列。取1 491 bp長(zhǎng)片段,經(jīng)拼接和NCBI Blast比對(duì)顯示所得序列即為L(zhǎng)cCu/Zn-SOD3的啟動(dòng)子序列,命名為ProLcCSD3(GenBank登入號(hào):KF672186)。因此,獲得LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子長(zhǎng)度為1 426 bp。

2.2荔枝LcCu/Zn-SOD3基因啟動(dòng)子的序列結(jié)構(gòu)分析

Neural Network Promoter Prediction預(yù)測(cè)表明,該啟動(dòng)子可能存在的核心啟動(dòng)子區(qū)域有3處,分值分別為0.88、0.85和0.80,分別位于第-782～-733 bp、-418～-369 bp和-93～-44 bp之間(將起始密碼子ATG中的A定義為位+1),而可能的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)為T和A。PlantCARE順式元件分析表明(圖2),該序列存在大量的調(diào)控元件,其中核心元件TATA-Box和CAAT-Box最為豐富,此外,還存在多個(gè)光響應(yīng)元件Box 4、Box I、I-box、Sp1 和3-AF1 binding site;激素應(yīng)答元件CE3、GARE-motif和TCA-element;胚乳表達(dá)響應(yīng)元件Skn-1_motif和GCN4_motif;環(huán)境脅迫中的厭氧誘導(dǎo)響應(yīng)元件ARE和GC-motif、熱壓響應(yīng)元件HSE、防御與脅迫響應(yīng)元件TC-rich repeat、干旱誘導(dǎo)響應(yīng)元件MBS和晝夜節(jié)律元件circadian;以及一些功能未知的相關(guān)元件。其中MBS元件為干旱誘導(dǎo)下的MYB結(jié)合位點(diǎn)。此外,PLACE軟件分析表明該啟動(dòng)子還存在WBOX和WRKY71OS元件。

圖1　荔枝LcCu/Zn-SOD3基因啟動(dòng)子

2.3荔枝LcCu/Zn-SOD3基因啟動(dòng)子載體構(gòu)建

重組質(zhì)粒雙酶切和目的序列的PCR雙重鑒定分析(圖3)表明,所切下的小片段及特異引物PCR所得條帶與目地啟動(dòng)子長(zhǎng)度一致,說明p1301-pro-LcCSD3-GUS重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。重組質(zhì)粒p1301-proLcCSD3-GUS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105和GV3101的PCR檢測(cè)均得到與該啟動(dòng)子大小一致的條帶,說明p1301-proLcCSD3-GUS重組質(zhì)粒已分別成功地轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105和GV3101,可用于后續(xù)試驗(yàn)。

圖2　PlantCARE預(yù)測(cè)LcCu/Zn-SOD3

圖3　p1301-proLcCSD3-GUS載體構(gòu)建凝膠成像圖

2.4荔枝LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化煙草的功能鑒定

GUS組織化學(xué)染色如圖4所示,陰性對(duì)照的葉片未能染色,而注射目的啟動(dòng)子ProLcCSD3和陽性對(duì)照的CaMv35S驅(qū)動(dòng)GUS的葉片均染成藍(lán)色,但ProLcCSD3驅(qū)動(dòng)下的染色程度不及CaMv35S啟動(dòng)子。該結(jié)果表明ProLcCSD3啟動(dòng)子具有驅(qū)動(dòng)下游GUS基因表達(dá)能力,即具有啟動(dòng)子活性,但其活性不及CaMv35S啟動(dòng)子。

2.5荔枝LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子轉(zhuǎn)化擬南芥T1代篩選及鑒定

潮霉素篩選結(jié)果表明:轉(zhuǎn)化成功的擬南芥小苗根系生長(zhǎng)良好且植株長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較強(qiáng)。擬南芥小苗GUS組織化學(xué)染色分析(圖5)顯示,ProLcCSD3驅(qū)動(dòng)的GUS在轉(zhuǎn)基因擬南芥的根、莖和葉中均有表達(dá)。進(jìn)一步DNA水平上的PCR鑒定結(jié)果(圖6)表明,隨機(jī)選取的8株轉(zhuǎn)基因擬南芥株系均為陽性植株。

2.6荔枝LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子響應(yīng)非生物脅迫分析

轉(zhuǎn)基因擬南芥植株在不同非生物脅迫處理下的

圖4　組織化學(xué)染色法檢測(cè)GUS酶活性

GUS熒光活性變化分析如圖7。首先,從圖中可看出在水處理下,其GUS活性變化不顯著,因此,可排除ABA和MeJA處理時(shí)水成分的影響。分析轉(zhuǎn)ProLcCSD3株系在各非生物脅迫下GUS活性變化,表明LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子可響應(yīng)NaCl、PEG-6000、ABA、MeJA和損傷等非生物脅迫。其中在NaCl、PEG-6000和ABA處理6 h時(shí)其GUS活性即顯著升高,可達(dá)到未處理的1.7～3.2倍,而在24h時(shí)均又下降;MeJA和損傷脅迫處理6 h時(shí)其活性變化不明顯,而在處理24 h時(shí)其GUS活性顯著升高,約為未處理的2～3倍,且兩者的表達(dá)模式相近。

圖6　轉(zhuǎn)基因擬南芥株系DNA水平驗(yàn)證

圖7　轉(zhuǎn)基因擬南芥不同脅迫處理下GUS活性分析

圖5　轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的GUS組織化學(xué)染色

圖8　轉(zhuǎn)基因擬南芥不同株系GUS活性差異分析

此外,進(jìn)一步分析(圖8)發(fā)現(xiàn),不同的轉(zhuǎn)基因株系葉片中的GUS活性差異較大,表明在轉(zhuǎn)ProLcCSD3的擬南芥不同株系中,其ProLcCSD3驅(qū)動(dòng)下游GUS的活性存在差異,這可能是該啟動(dòng)子插入擬南芥基因組中的位置不同所致。

3討論

3.1荔枝古樹胚性愈傷組織LcCu/Zn-SOD3參與環(huán)境脅迫的調(diào)控

荔枝胚性愈傷組織LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性受不同環(huán)境因素的誘導(dǎo)。順式元件預(yù)測(cè)分析表明該啟動(dòng)子含有光、熱壓、厭氧、防御與脅迫、干旱和晝夜節(jié)律等響應(yīng)元件,說明該啟動(dòng)子可能響應(yīng)光、熱、厭氧、干旱和晝夜等的誘導(dǎo)。本研究對(duì)轉(zhuǎn)LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子的擬南芥植株進(jìn)行NaCl、PEG-6000和損傷脅迫的結(jié)果驗(yàn)證了該啟動(dòng)子對(duì)鹽、干旱和損傷逆境下的響應(yīng)。這與以往NaCl、干旱等逆境脅迫均誘導(dǎo)Cu/Zn-SOD基因表達(dá)的研究相符[13-14]。因此,該研究表明LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子在逆境脅迫下,可通過響應(yīng)相應(yīng)的逆境順式元件調(diào)控其下游基因的表達(dá),從而調(diào)整植株對(duì)逆境的耐受能力。

3.2荔枝古樹胚性愈傷組織LcCu/Zn-SOD3參與激素脅迫調(diào)控

荔枝胚性愈傷組織LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子響應(yīng)外源激素脅迫。PlantCARE順式元件分析表明,該啟動(dòng)子含有參與ABA、赤霉素和水楊酸應(yīng)答元件。表明該啟動(dòng)子在上述激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中可能發(fā)揮了一定作用。Mundy等[15]指出一些基因的表達(dá)可能是外源激素直接作為反式作用因子與這些調(diào)控元件結(jié)合來調(diào)控的。ABA[16]、赤霉素[17]和水楊酸[18]等均在植物的抗旱、抗鹽、抗低溫等逆境方面起到一定調(diào)控作用。其中,茉莉酸甲酯作為一種揮發(fā)性化合物,可以從植物的氣孔進(jìn)入植物體內(nèi),在細(xì)胞質(zhì)中被酯酶水解為茉莉酸,實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)距離的信號(hào)傳導(dǎo)和植物間的交流,誘導(dǎo)鄰近植物產(chǎn)生誘導(dǎo)防御反應(yīng)[19],并可以產(chǎn)生與機(jī)械損傷和昆蟲取食相似的效果[20]。同樣,在本研究對(duì)轉(zhuǎn)LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子的擬南芥植株進(jìn)行ABA和MeJA脅迫的結(jié)果驗(yàn)證了該啟動(dòng)子對(duì)ABA和MeJA激素的響應(yīng)。因此,該研究也表明該啟動(dòng)子在外源激素脅迫下,可通過響應(yīng)相應(yīng)的激素順式元件調(diào)控LcCu/Zn-SOD3基因的表達(dá)。

綜上,本研究主要通過對(duì)LcCu/Zn-SOD3啟動(dòng)子進(jìn)行克隆和功能分析,即在啟動(dòng)子研究的水平初步鑒定了LcCu/Zn-SOD3基因功能,為進(jìn)一步對(duì)該基因的轉(zhuǎn)基因抗逆性研究奠定一定的基礎(chǔ)。此外,MBS、WBOX和WRKY71OS等順式元件的存在,暗示荔枝胚性愈傷組織LcCu/Zn-SOD3基因的調(diào)控可能還受MYB和WRKY轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。其中,MYB轉(zhuǎn)錄因子作為植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一,參與植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)[21],尤其在干旱脅迫下,大部分MYB轉(zhuǎn)錄因子均與ABA相關(guān),且MYB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)ABA的調(diào)控存在誘導(dǎo)型、介導(dǎo)型和依賴型三種方式[22]。本試驗(yàn)所得的啟動(dòng)子中,也正含有一個(gè)干旱誘導(dǎo)的MBS元件和ABA響應(yīng)的CE3元件,那么該兩個(gè)元件是否也協(xié)同作用以及作用的方式有待進(jìn)一步研究。WRKY轉(zhuǎn)錄因子能夠與W-box發(fā)生特異性作用,調(diào)節(jié)啟動(dòng)子中含有W-box元件的基因表達(dá)[23],從而參與各種防御反應(yīng),調(diào)節(jié)植物的生長(zhǎng)發(fā)育等[24]。同時(shí),以往的研究也表明WRKY轉(zhuǎn)錄因子還受外源激素如水楊酸[25]、赤霉素[26]、脫落酸[27]和茉莉酸甲酯[28]等脅迫。因此,以上的前人研究成果也為進(jìn)一步深入研究該啟動(dòng)子的功能及上游調(diào)控因子的調(diào)控方式等提供新的思路。

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(編輯:宋亞珍)

Cloning and Functional Analysis ofLcCu/Zn-SOD3 Promoter

from Embryogenic Callus of the Ancient Litchi Tree

LIAN Conglong,LU Bingguo,LAI Zhongxiong*,FENG Xin,

LIN Yuling,CHEN Yukun,ZHANG Zihao

(Institute of Horticultural Biotechnology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China)

Abstract:In this experiment,the 1 426 bp promoter fragment ofLcCu/Zn-SOD3 from embryogenic callus of the ancient litchi tree ‘Songli’ which namedProLcCSD3(GenBank:KF672186.1) was cloned by means of adapter chromosome walking method.The bioinformatics analysis showed that ProLcCSD3 contains a number of environmental stress response elements,hormone response elements,endosperm expression elements and also might be regulation by MYB and WRKY transcription factors.A novel plant expression vector p1301-proLcCSD3-GUS was constructed with ProLcCSD3 replace 35S promoter in the pCAMBIA1301 vector by using the double-digested method and then transferred intoAgrobacteriumstrain EHA105 and GV3101.Furthermore,transformation analysis showed that ProLcCSD3 has promoter activity by the infection of tobacco leaves and could drive the downstream reporterGUSgene expression in the roots,stems and leaves byAgrobacterium-mediated transformation ofArabidopsis.And stress treatments showed that ProLcCSD3 could response to some abiotic stresses,such as NaCl,PEG-6000,ABA,MeJA and wounding.Our results demonstrated thatLcCu/Zn-SOD3 might response to abiotic stresses and participate in the signal transduction pathways of hormones in the ancient litchi tree.

Key words:the ancient litchi tree;embryogenic callus;Cu/Zn-SOD3;promoter;functional analysis

中圖分類號(hào):Q785;Q786

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A

作者簡(jiǎn)介:練從龍(1988-),男,碩士,主要從事花卉與景觀園藝生物技術(shù)研究。E-mail:770379183@qq.com*通信作者:賴鐘雄,博士,研究員,博士生導(dǎo)師,主要從事園藝植物生物技術(shù)與遺傳資源。E-mail:laizx01@163.com

基金項(xiàng)目:福建省農(nóng)業(yè)科技平臺(tái)(2008N2001);國(guó)家科技支持計(jì)劃項(xiàng)目(2007BAD07B01)

收稿日期:2014-08-07;修改稿收到日期:2014-11-09

文章編號(hào):1000-4025(2015)01-0016-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0016