小立碗蘚GPX家族的功能分化與催化特性研究

王　煒,楊志靈,楊海靈

(北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院,北京 100083)

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小立碗蘚GPX家族的功能分化與催化特性研究

王煒,楊志靈,楊海靈*

(北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院,北京 100083)

摘要:谷胱甘肽過氧化物酶(GPX)在植物抵抗氧化脅迫中發(fā)揮重要作用。該研究從小立碗蘚(Physcomitrellapatens)基因組中挖掘到3個GPX基因,分別命名為PpGPX1、PpGPX2和PpGPX3。其中PpGPX1和PpGPX3只含有1個外顯子,而PpGPX2含有6個外顯子。表達模式分析發(fā)現(xiàn)PpGPX1和PpGPX2在檢測的所有條件下均表達,而PpGPX3在檢測的所有條件下均不表達。蛋白亞細胞定位分析發(fā)現(xiàn),PpGPX1蛋白定位在細胞質,而PpGPX2蛋白定位在葉綠體。在大腸桿菌中表達并純化了PpGPX1和PpGPX2蛋白,酶學性質分析發(fā)現(xiàn),PpGPX1和PpGPX2蛋白均只能利用Trx電子供體系統(tǒng),而不能利用GSH電子供體系統(tǒng);PpGPX2蛋白對過氧化物底物的催化活性和催化效率均高于PpGPX1。基因結構、表達模式、亞細胞定位和蛋白酶學性質的差異預示小立碗蘚GPX基因家族成員發(fā)生了功能分化,將PpGPX2蛋白的Pro158、Phe167和Phe172氨基酸殘基均突變?yōu)锳la,發(fā)現(xiàn)突變體蛋白對底物催化活性降低,說明這3個氨基酸位點對PpGPX2蛋白具有重要催化活性。

關鍵詞:谷胱甘肽過氧化物酶;小立碗蘚;功能分化;亞細胞定位;酶學性質分析

植物在受到干旱、低溫、高鹽、除草劑、病菌侵害等生物及非生物脅迫時,體內的活性氧(reactive oxygen species,ROS)含量會明顯上升,過多的活性氧積累會對植物的核酸、脂質、蛋白等生物大分子造成損傷[1]。植物在長期進化過程中,產生了一系列的酶促及非酶促機制來清除體內過剩的活性氧,例如抗壞血酸過氧化物酶(APX)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase,GPX)等酶促反應系統(tǒng),及谷胱甘肽、類胡蘿卜素、維生素E等非酶促反應系統(tǒng)[2]。谷胱甘肽過氧化物酶作為一種重要的活性氧清除劑,能夠直接與過氧化氫(H2O2)、叔丁基過氧化氫(tBOOH)和枯烯氫過氧化物(COOH)等發(fā)生反應,從而清除體內多余的活性氧,在植物抵御生物及非生物脅迫過程中發(fā)揮重要的作用[3]。例如,擬南芥AtGPX3基因的缺失突變體表現(xiàn)出活性氧清除能力和耐旱能力降低等表型[4];敲除AtGPX8基因后,在paraquat(一種除草劑)的處理下,擬南芥幼苗根部生長慢于野生型,而過表達植株根部生長快于野生型[5]。

以往對植物GPX的研究主要集中在擬南芥[4-5]、水稻[6-7]、楊樹[8]、胡楊[9]、番茄[10]、甘藍型油菜[11]、百脈根[12]、鹽芥[13]、香蕉[14]等被子植物,而對植物中另一大類群-苔蘚植物的研究相對較少。小立碗蘚是目前完成全基因組測序的唯一苔蘚類植物,在分類上屬于葫蘆蘚科小立碗蘚屬,是典型的早期陸地苔蘚植物[15],作為植物分子生物學研究極具前景的模式植物已日益受到人們的重視。本研究以小立碗蘚為研究材料,從小立碗蘚基因組中挖掘到3個GPX基因,并對其序列特征、基因結構、表達模式、蛋白亞細胞定位、蛋白結構、蛋白生化性質及關鍵氨基酸位點進行了詳細的比較研究,揭示了小立碗蘚GPX基因家族的功能分化和分子特征。

1材料和方法

1.1實驗材料

實驗材料小立碗蘚(Physcomitrellapatens)由北京大學郭紅衛(wèi)教授惠贈。

1.2小立碗蘚GPX基因的鑒定

以擬南芥(Arabidopsisthaliana)GPX蛋白序列(GenBank登錄號NP_198297.2)為模板,在Phytozome網(wǎng)站(http://www.phytozome.org)中,應用Blast工具檢索小立碗蘚全基因組數(shù)據(jù)庫,搜索得到小立碗蘚GPX基因,將其所編碼的蛋白在NCBI網(wǎng)站進行保守結構域分析(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi),以確定其含有GPX結構域。

1.3小立碗蘚GPX的系統(tǒng)發(fā)生分析

將搜索得到的小立碗蘚GPX蛋白序列與其他陸地植物GPX蛋白序列通過Muscle(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle)進行序列比對,并進行手工校對,將比對結果導入MEGA5.05軟件,使用Neighbour-joining模型構建系統(tǒng)進化樹,Bootstrap設為1 000。

1.4小立碗蘚GPX基因的克隆

在BCDATG固體培養(yǎng)基培養(yǎng)小立碗蘚[16],培養(yǎng)條件為18 h光照、6 h暗培養(yǎng),培養(yǎng)溫度25 ℃。培養(yǎng)60 d后,用Aurum Total RNA Kits(Bio-Rad Laboratories)提取植株總RNA。將提取的RNA用無RNase的DNase I(Promega)處理后,用RNA PCR Kit(AMV) version 3.0 (TaKaRa)反轉錄成cDNA。根據(jù)小立碗蘚PpGPX1、PpGPX2和PpGPX3基因序列分別設計引物對PpGPX1-EX1/2、PpGPX2-EX1/2和PpGPX3-EX1/2(表1),引物均由Invitrogen公司合成,以小立碗蘚cDNA為模板分別進行PCR擴增。PCR反應程序為94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,55 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,35個循環(huán);最后72 ℃延伸3 min。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并用DNA純化回收試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)回收目的條帶,將純化產物連接入pEASY-T3載體(北京全式金生物),將連接產物轉化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞,在含有X-gal/IPTG/Amp的LB平板上挑取多個陽性克隆進行雙向測序。最終得到測序正確的PpGPX/pEASY-T3重組質粒。

1.5小立碗蘚GPX基因的表達模式分析

選擇培養(yǎng)60 d后生長狀況良好的小立碗蘚,分別用0.5% H2O2、150 mmol/L NaCl、1 mmol/L水楊酸、0.1%莠去津和1 mmol/L CDNB噴灑。H2O2和莠去津處理12 h,其余方式每種處理24 h,每種處理設置3個重復。處理后的植株提取總RNA,用無RNase的DNaseI處理后反轉錄成cDNA。根據(jù)小立碗蘚基因序列設計3對引物(PpGPX1-SP1/2、PpGPX2-SP1/2和PpGPX3-SP1/2,表1),進行PCR擴增,以小立碗蘚Actin基因為內標(GenBank登錄號XM_001783849)。PCR反應程序為94 ℃預變性3 min;94 ℃變性30 s,60 ℃退火40 s,72 ℃延伸1 min,循環(huán)數(shù)分別設置24、26、28和30;最后72 ℃延伸3 min。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測并測序確定。

1.6小立碗蘚GPX蛋白的亞細胞定位分析

以小立碗蘚cDNA為模板,利用引物PpGPX1-SL1/2和PpGPX2-SL1/2分別進行PCR擴增。PCR產物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測,并用DNA純化回收試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術有限公司)回收目的條帶,將純化產物連接入pEASY-T3載體(北京全式金生物),將構建好的重組質粒轉化大腸桿菌Trans-T1感受態(tài)細胞,挑選多個陽性克隆進行測序。將測序正確的重組質粒用限制性內切酶BamHⅠ和MluⅠ(NEB)酶切,將酶切后的DNA片段分別連接到pPSN轉基因載體[17],并將轉基因重組質粒轉入事先制備好的擬南芥原生質體。原生質體的制備及轉化參考Sang-Dong Yoo等[18]的方法。轉化1 d后,用激光共聚焦顯微鏡(Olympus FV1000 MPE)進行觀察。GFP激發(fā)光波長為488 nm,葉綠體激發(fā)光波長為543 nm。

1.7小立碗蘚PpGPX1和PpGPX2蛋白結構模擬

目前,在植物中只有楊樹PtGPX5蛋白的X射線衍射晶體結構得到解析,因此我們以PtGPX5蛋白的晶體結構為模板,使用InsightII軟件中的Homology模塊對PpGPX1和PpGPX2的蛋白結構進行模擬。首先用Align 2D程序進行序列比對,然后使用Modeler程序進行蛋白質三維結構的模擬,利用profile-3D程序對所有模擬的結構進行校驗,選擇校驗值最高的蛋白結構。

1.8小立碗蘚PpGPX1和PpGPX2蛋白的表達和純化

將PpGPX1/pEASY-T3和PpGPX2/pEASY-T3重組質粒用限制性內切酶BamHⅠ和NotⅠ(NEB)酶切,目的片段經(jīng)DNA純化回收試劑盒回收后連接到改造過的pET30a蛋白表達載體中[19],使表達蛋白在N端含有6×His標簽。將構建好的重組質粒轉化大腸桿菌Tuner(DE3)感受態(tài)細胞,測序確定菌中質粒序列的正確性。在定點突變實驗中,PpGPX2的Pro159、Phe167和Phe172殘基分別用Ala替換,通過DNA測序確定所需要的位點進行了正確的突變,然后將突變后的PpGPX2基因克隆到改造后的pET30a蛋白表達載體中并轉化Tuner(DE3)感受態(tài)細胞。挑取陽性克隆菌在LB液體培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng),將菌體1:100稀釋后,繼續(xù)培養(yǎng)至OD600≈0.5。加入終濃度為0.05 mmol/L IPTG誘導GPX蛋白表達。37 ℃誘導過夜后,離心收集菌體(1 000 r/min,3 min,4 ℃)。用緩沖液A(20 mmol/L磷酸鈉、0.5 mol/L NaCl和20 mmol/L咪唑,pH 7.4)重懸菌體,冰上超聲破碎裂解。將破碎液(10 000 r/min,10 min,4 ℃)離心,離心后上清和沉淀各取50 μL進行SDS-PAGE檢測(SDS-PAGE檢測采用12%分離膠和5%濃縮膠),剩余上清置于緩沖液A預平衡后的鎳離子親和層析柱(GE Healthcare Bio-Sciences)進行純化。雜蛋白用緩沖液A洗滌,目的蛋白用緩沖液B(20 mmol/L磷酸鈉、0.5 mol/L NaCl和500 mmol/L咪唑,pH 7.4)洗脫。

表1　本研究中使用的引物

1.9小立碗蘚PpGPX1和PpGPX2蛋白酶學性質測定及動力學分析

小立碗蘚GPX蛋白的生化性質測定參照Zhao等[3]的方法,通過檢測340 nm波長處NADPH吸光度(A340)的降低來測定過氧化物酶活性,所有的反應都在25 ℃進行。反應體系包括:150 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0,7.5 mmol/L EDTA,1 mmol/L H2O2,不同濃度的GPX蛋白及電子供體系統(tǒng)。電子供體系統(tǒng)包括Trx電子供體系統(tǒng)(0.2 mmol/L NADPH,9 μmol/LE.coliTrx,0.5 μmol/LE.coliTrx reductase)和GSH電子供體系統(tǒng)(0.2 mmol/L NADPH,2 mmol/L GSH和1.5 U谷胱甘肽過氧化物酶)。當測定GPX蛋白對tBOOH或COOH的活性時,將反應體系中的H2O2替換為叔丁基過氧化氫(tBOOH)或異丙基苯過氧化氫(COOH)。對照反應用等量的緩沖液B來替代GPX蛋白溶液,其他成分不變,每個反應設3次獨立重復實驗。

動力學分析通過測量GPX蛋白在不同濃度的Trx和H2O2條件下的催化活性進行分析。在分析GPX蛋白對Trx的動力學時,固定H2O2的濃度為1.0 mmol/L,通過測量Trx濃度范圍為0.5～25 μmol/L時,GPX蛋白在不同Trx濃度下的催化活性獲得。在分析GPX蛋白對H2O2的動力學時,固定Trx濃度為5.0 μmol/L,通過測量Trx濃度范圍為0.005～1.0 mmol/L時,GPX蛋白在不同Trx濃度下的催化活性獲得。檢測的結果通過Hyper32程序(http://homepage.ntlworld.com/john.easterby/hyper32.html.)進行非線性回歸分析。

2結果與分析

2.1小立碗蘚GPX基因家族的挖掘和系統(tǒng)發(fā)育分析

從小立碗蘚基因組中挖掘到3個可能的GPX基因,分別命名為PpGPX1、PpGPX2和PpGPX3,通過CDD保守結構域分析發(fā)現(xiàn),3個基因編碼的蛋白均具有GPX蛋白結構域,證明得到的基因為GPX基因。PpGPX1基因編碼170個氨基酸的蛋白,預測分子量為19.1 kD;PpGPX2基因編碼247個氨基酸的蛋白,預測分子量為26.8 kD;PpGPX3基因編碼184個氨基酸的蛋白,預測分子量為20.8 kD。將3個基因的cDNA序列和基因組序列進行比較以鑒定其基因結構,發(fā)現(xiàn)PpGPX1和PpGPX3基因都只含有1個外顯子,而PpGPX2基因有6個外顯子(圖1)。

將小立碗蘚和蕨類植物江南卷柏(Selaginellamoellendorffii)、裸子植物油松(Pinustabuliformis)、單子葉植物水稻(Oryzasativa)、雙子葉植物毛果楊(Populustrichocarpa)和擬南芥(Arabidopsisthaliana)的GPX蛋白序列進行序列相似性分析(圖2),結果發(fā)現(xiàn),這些GPX間具有比較高的序列相似性,蛋白序列相似性范圍為39.6%～99.3%。將小立碗蘚與其他陸地植物的GPX進行系統(tǒng)發(fā)生關系分析,發(fā)現(xiàn)小立碗蘚GPX在最基部聚成一枝(圖4),說明小立碗蘚GPX基因家族在陸地植物分化的早期就產生了。

2.2小立碗蘚GPX基因表達模式分析

通過半定量RT-PCR檢測小立碗蘚GPX基因在正常生長以及H2O2、NaCl、水楊酸、莠去津和CDNB等脅迫下的表達模式,發(fā)現(xiàn)PpGPX1和PpGPX2在24～30個PCR擴增循環(huán)時,在不同生長條件下均表達,而PpGPX3在檢測的所有樣品中均不表達(圖3)。為了進一步確認PpGPX3基因的表達模式,用PpGPX3基因序列檢索NCBI中的小立碗蘚EST數(shù)據(jù)庫(含有382 587條小立碗蘚EST序列),未搜到任何匹配的EST序列,因此推測PpGPX3基因可能不表達,或可能在特定的發(fā)育時期或誘導條件下表達。

圖1　小立碗蘚GPX基因的基因結構

圖2　植物GPX蛋白序列比對

圖3　小立碗蘚GPX基因在不同脅迫條件下的表達

2.3小立碗蘚PpGPX1和PpGPX2蛋白的亞細胞定位分析

為了研究小立碗蘚PpGPX1和PpGPX2蛋白的亞細胞定位,構建了PpGPX1和PpGPX2的C末端與綠色熒光蛋白eGFP相連的融合蛋白表達質粒,在擬南芥原生質體中瞬時表達后,用激光共聚焦顯微鏡進行觀察。結果發(fā)現(xiàn),PpGPX2-eGFP融合蛋白的綠色熒光與葉綠體自發(fā)熒光重疊,表明PpGPX2蛋白能夠定位到葉綠體。而PpGPX1-eGFP融合蛋白則與單獨表達eGFP時的熒光定位相似,說明PpGPX1定位到細胞質(圖5)。

圖4　植物GPX基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

圖6　小立碗蘚PpGPX1和PpGPX2蛋白三維結構的模擬

圖5　小立碗蘚GPX蛋白在擬南芥原生質體中的亞細胞定位

2.4小立碗蘚PpGPX1和PpGPX2蛋白結構模擬

目前,在植物中只有楊樹PtGPX5蛋白的X射線衍射晶體結構得到解析,因此我們以PtGPX5蛋白的晶體結構為模板,使用InsightⅡ軟件對小立碗蘚PpGPX1和PpGPX2的蛋白結構進行模擬(圖6,A),以profile-3D程序對模擬得到的結構進行校驗,校驗后得到的2個蛋白所有位點的校驗值均為正值,表明模擬所得到的結果具有較高的可信度(圖6,B)。PpGPX1和PpGPX2都含有4個α螺旋和6個β折疊,其中4個β折疊構成反向平行的β片層結構,將2個蛋白結構進行疊加,發(fā)現(xiàn)2個蛋白結構十分保守,除了loop區(qū)域有一些差異外,其余部分幾乎完全重疊。

2.5小立碗蘚PpGPX1和PpGPX2蛋白的表達純化及酶學性質分析

PpGPX2定位到葉綠體,其在N端含有一段信號肽,在植物細胞中加工成為成熟蛋白時,信號肽會被切除。為研究PpGPX1和PpGPX2蛋白的性質,將PpGPX1和去掉信號肽的PpGPX2在大腸桿菌中進行原核表達。在37 ℃誘導條件下,2個蛋白均能以可溶性蛋白的形式表達。經(jīng)過鎳離子親和層析純化后得到純度較高的蛋白,SDS-PAGE檢測結果顯示,純化蛋白的分子量大小與預測相一致(圖7)。

先前的研究發(fā)現(xiàn),植物GPX能夠利用Trx和GSH還原系統(tǒng)還原過氧化物[8,20]。本研究分別以Trx和GSH作為還原劑檢測PpGPX1和PpGPX2蛋白對H2O2、tBOOH和COOH的催化活性。當用GSH電子供體系統(tǒng)時,PpGPX1和PpGPX2對3種底物均沒有催化活性,而應用Trx電子供體系統(tǒng)時,2個蛋白對3種底物均有催化活性(表2)。同一蛋白對3種底物的活性沒有明顯的差別,而2個蛋白之間的催化活性不同,PpGPX2蛋白對3種過氧化物底物的活性均高于PpGPX1蛋白,說明小立碗蘚GPX家族不同成員的活性產生了分化。

分別以Trx和H2O2作為電子供體和過氧化物底物對PpGPX1和PpGPX2進行酶促動力學分析(表3)。結果表明,小立碗蘚GPX蛋白對Trx的Km值大于對H2O2的Km值,說明小立碗蘚GPX蛋白對H2O2的親和力高于對Trx的親和力(親和力越大Km值越小)。PpGPX2對Trx的親和力是PpGPX1的5.5倍,而對H2O2的親和力PpGPX1高于PpGPX2,PpGPX2對Trx和H2O2的催化效率均高于PpGPX1。

2.6小立碗蘚GPX蛋白關鍵氨基酸位點功能分析

根據(jù)先前的分子對接實驗[21],楊樹PtGPX5的Pro81、Phe90和Phe95氨基酸殘基可能在PtGPX5與Trx的互作中發(fā)揮作用。通過序列比對發(fā)現(xiàn),這3個氨基酸在小立碗蘚中分別為Pro159、Phe167和Phe172氨基酸殘基(圖2)。由于PpGPX2蛋白的催化活性和對Trx的親和力都高于PpGPX1蛋白,所以選擇PpGPX2蛋白研究這3個位點在小立碗蘚GPX中的作用。根據(jù)序列比對結果,在PpGPX2中這3個位點分別對應Pro158、Phe167和Phe172。將這3個氨基酸殘基分別突變?yōu)锳la后發(fā)現(xiàn),與野生型PpGPX2蛋白相比,3個突變體蛋白對3種過氧化物底物的活性均發(fā)生了不同程度的降低,其中PpGPX2(F172A)突變體蛋白對3種底物的催化活性下降最多,對H2O2、tBOOH和COOH的活性分別下降了84.8%、87.3%和88.3%。動力學分析得出PpGPX2(F172A)突變體蛋白對Trx和H2O2的kcat/Km值降低至野生型的15.80%和4.69%。這些結果說明Pro158、Phe167和Phe172氨基酸位點對于PpGPX2的催化具有重要作用。

圖7　純化的小立碗蘚GPX蛋白SDS-PAGE電泳

蛋白名稱ProteinnameKmTrx/(mmol·L-1)kcatTrx/(S-1)(kcat/Km)Trx/(L·mmol-1·S-1)KmH2O2/(mmol·L-1)kcatH2O2/(S-1)(kcat/Km)H2O2/(L·mmol-1·S-1)PpGPX112.140±0.5801.3310.1100.003±0.0010.13644.445PpGPX22.189±0.1750.7100.3240.005±0.0010.24654.348PpGPX2(F167A)0.411±0.1680.1160.3010.002±0.0000.10555.095PpGPX2(F172A)0.668±0.3070.0340.0510.007±0.0010.0152.548PpGPX2(P158A)2.911±0.7700.4030.1390.010±0.0010.10710.637

表2　小立碗蘚GPX蛋白對不同底物的催化活性

3討論

GPX作為一種清除活性氧的關鍵酶,在植物抵御外界生物及非生物脅迫的過程中發(fā)揮著重要的作用。以往對GPX的研究主要集中于擬南芥、水稻、楊樹、胡楊、番茄、甘藍型油菜、百脈根、鹽芥、香蕉等被子植物,而對植物中另一大類群-苔蘚植物的研究相對較少,本實驗對苔蘚植物小立碗蘚GPX家族進行了深入的功能分化與分子特性研究,對于了解小立碗蘚抗氧化脅迫的機制具有重要的意義。

雖然小立碗蘚GPX家族成員間有較高的序列相似性,但它們在基因結構、表達模式、蛋白亞細胞定位和蛋白酶學功能方面均有差異。例如,PpGPX1和PpGPX3都只有1個外顯子,而PpGPX2有6個外顯子;PpGPX1和PpGPX2在檢測的所有生長條件下均表達,而PpGPX3在所有檢測的生長條件下均不表達;PpGPX1蛋白定位到細胞質,而PpGPX2蛋白定位到葉綠體;PpGPX2蛋白對H2O2、tBOOH和COOH的催化活性及催化效率均高于PpGPX1蛋白。基因結構、表達模式、蛋白亞細胞定位和蛋白酶學功能方面的差異表明,小立碗蘚GPX家族成員間已經(jīng)發(fā)生了廣泛的功能分化。

根據(jù)先前的研究,在動物和真菌中,GPX蛋白可以利用Trx電子供體系統(tǒng)和GSH電子供體系統(tǒng)進行過氧化物催化反應[22-23];水稻、油松、楊樹等高等植物則只能利用Trx電子供體系統(tǒng),不能使用GSH電子供體系統(tǒng)[20,24-25]。本研究利用Trx電子供體系統(tǒng)和GSH電子供體系統(tǒng)對小立碗蘚PpGPX1和PpGPX2蛋白進行酶學性質檢測,結果發(fā)現(xiàn),小立碗蘚GPX蛋白也只能利用Trx電子供體系統(tǒng)在催化反應中進行電子傳遞,而不能利用GSH電子供體系統(tǒng),說明陸地植物GPX是Trx依賴的過氧化物酶。

先前的研究表明,植物GPX蛋白通過兩步反應完成一次催化循環(huán),首先GPX蛋白與過氧化物底物反應,將過氧化物還原,自身變?yōu)檠趸瘧B(tài),然后通過Trx電子供體系統(tǒng)將GPX蛋白還原,在這一反應過程中GPX蛋白和Trx蛋白會發(fā)生直接的相互作用[26]。根據(jù)先前的分子對接實驗[21],楊樹PtGPX5的Pro81、Phe90和Phe95氨基酸殘基可能在PtGPX5與Trx的互作中發(fā)揮作用。將楊樹PtGPX5蛋白第90位的Phe突變?yōu)镚lu后,PtGPX5突變體蛋白對Trx的親和力明顯下降[27]。根據(jù)序列比對分析,楊樹PtGPX5的Pro81、Phe90和Phe95氨基酸位點分別對應PpGPX2的Pro158、Phe167和Phe172氨基酸位點。通過蛋白的定點突變分析發(fā)現(xiàn),將PpGPX2的Pro158、Phe167和Phe172氨基酸殘基均突變?yōu)锳la后,3個突變體的催化活性均明顯降低,其中PpGPX2(F172A)突變體蛋白對H2O2、tBOOH和COOH的活性分別降低為原來的15.2%、12.7%和11.7%,說明這3個位點,尤其是第172位的Phe對小立碗蘚GPX蛋白的催化功能具有重要作用。

本研究通過整合序列分析、基因表達模式分析、蛋白亞細胞定位分析、蛋白質結構模擬、蛋白酶學性質分析及關鍵氨基酸位點的研究,對苔蘚植物小立碗蘚GPX家族的功能分化及分子特性進行了深入的研究,為了解小立碗蘚抵抗氧化脅迫的機制提供了一定的信息。

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(編輯:宋亞珍)

Functional Divergence and Catalytic Properties of Glutathione

Peroxidase Family fromPhyscomitrellapatens

WANG Wei,YANG Zhiling,YANG Hailing*

(College of Life Sciences and Biotechnology,Beijing Forestry University,Beijing 100083,China)

Abstract:In plants,glutathione peroxidase (GPX) plays important roles in protecting cells against oxidative stress.In this study,threeGPXs(PpGPX1/2/3) were identified from thePhyscomitrellapatensgenome.PpGPX1 andPpGPX3 only had one exon,whilePpGPX2 had six exons.Semiquantitative RT-PCR analysis revealed thatPpGPX1 andPpGPX2 were expressed in all tested conditions.However,PpGPX3 transcripts were not detected in any tested conditions.By transiently expressing C-terminal eGFP-GPX fusions inArabidopsisprotoplasts,we found that PpGPX1 and PpGPX2 were localized to cytoplasm and chloroplast,respectively.PpGPX1 and PpGPX2 were then over-expressed inE.coliand purified using a Ni Sepharose High Performance column.Enzymatic analysis found thatP.patensGPXs showed enzymatic activity towards peroxide substrates using Trx as electron donor,but not GSH.PpGPX2 showed higher catalytic activity and catalytic efficiency towards peroxide substrates than that of PpGPX1.The differences of gene structures,gene expression,protein subcellular localization and enzymatic characteristics amongP.patensGPXs indicating functional divergence.The function of Pro158,Phe167 and Phe172 of PpGPX2 were examined by site-directed mutagenesis.The mutant proteins showed decreased catalytic activity which indicated that these three residues were important for enzymatic activity.

Key words:glutathione peroxidase;Physcomitrellapatens;functional divergence;subcellular localization;enzymatic characterization

中圖分類號:Q786;Q789

文獻標志碼:A

作者簡介:王煒(1989-),男,在讀碩士研究生,主要從事蛋白質結構與生化性質研究。E-mail:wangw1989@163.com*通信作者:楊海靈,博士,教授,主要從事植物蛋白質結構與功能研究。E-mail:yhailing77@163.com

基金項目:國家自然科學基金(31270641)

收稿日期:2014-09-02;修改稿收到日期:2014-12-22

文章編號:1000-4025(2015)01-0001-09

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2015.01.0001