跌打片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

單秀明，楊 曉，邱學(xué)偉

(山東省青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266071)

跌打片質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

單秀明，楊 曉，邱學(xué)偉

(山東省青島市食品藥品檢驗(yàn)研究院，山東 青島 266071)

目的建立跌打片成分定性、定量分析方法以提高其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

跌打片；質(zhì)量控制；薄層色譜法；高效液相色譜法

跌打片是中藥復(fù)方制劑，由三七、續(xù)斷、血竭等24味中藥組方，具有活血化瘀、消腫止痛的功效，臨床上用于跌打損傷、筋斷骨折、瘀血腫痛、閃腰岔氣等[1]。該制劑現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中只有性狀、顯微鑒別和檢查，但無(wú)薄層鑒別及含量測(cè)定項(xiàng)。為更好地控制該制劑的內(nèi)在質(zhì)量，現(xiàn)建立了鑒別三七、續(xù)斷、血竭等8味藥材的薄層色譜（TLC）法，測(cè)定君藥續(xù)斷中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量的高效液相色譜（HPLC）法，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

島津LC-20AT型高效液相色譜儀，包括真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器及 LC solution色譜工作站；BP211D型電子天平（Sartorius公司）；HHW-4型雙顯恒溫水浴鍋（金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠）；AUTO Science AS10200BT型超聲波清洗器（杭州匯爾儀器設(shè)備有限公司）；硅膠G預(yù)制薄層板（德國(guó) MN，批號(hào) 707183）。三七對(duì)照藥材（批號(hào) 120941-200506）、人參皂苷Rb1對(duì)照品（批號(hào)110704-200420）、三七皂苷 R1對(duì)照品（批號(hào)110745-200415）、人參皂苷 Rg1對(duì)照品（批號(hào)110703-200424）、續(xù)斷對(duì)照藥材(批號(hào)121033-200608）、川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品（批號(hào)110708-200505）、芍藥苷對(duì)照品(批號(hào)110736-200732)、血竭對(duì)照藥材（批號(hào)120906-200308）、枳實(shí)對(duì)照藥材（批號(hào) 120936-200404）、骨碎補(bǔ)對(duì)照藥材（批號(hào)121169-200503）、柚皮苷（批號(hào) 110722-200610）、橙皮苷（批號(hào)110721-200512）、新橙皮苷（批號(hào)111857-201102），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；跌打片（批號(hào)為 0804001，0804002，0804003，天津中新藥業(yè)有限公司）；乙腈為色譜純，水為純凈水，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC鑒別

三七、續(xù)斷：取本品15片，除去糖衣，研細(xì)，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液洗滌2次，每次20 mL，正丁醇液再用正丁醇飽和的水 20 mL洗滌，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，得供試品溶液。另取三七、續(xù)斷對(duì)照藥材各0.2 g[1-2]，分別加甲醇20 mL，同法得對(duì)照藥材溶液。取人參皂苷Rb1對(duì)照品、人參皂苷Rg1對(duì)照品、三七皂苷R1對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL各含1 mg的混合溶液，作為對(duì)照品溶液。取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取處方中除去三七的其他藥味，按處方比例制成缺三七的陰性對(duì)照樣品；再取處方中除去續(xù)斷的其他藥味，按處方比例制成缺續(xù)斷的陰性對(duì)照樣品；按供試品溶液的制備方法分別制成陰性對(duì)照品溶液。依據(jù) 2010年版《中國(guó)藥典（一部）》附錄ⅥB方法，吸取供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各1～5 μL，對(duì)照藥材溶液與對(duì)照品溶液各1 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液為展開(kāi)劑[3-4]，展開(kāi)，取出，晾干，噴以 10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光及紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)或熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾(見(jiàn)圖1A及圖1B)。

血竭：取本品10片，除去糖衣，研細(xì)，加乙醚10 mL，密塞，超聲處理5 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液[5-6]。另取血竭對(duì)照藥材0.1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。取處方中除去血竭的其他藥味，按處方比例制成缺血竭的陰性對(duì)照樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠 G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(19∶1)為展開(kāi)劑[4，7]，展開(kāi)，取出，晾干，噴以2%香草醛硫酸乙醇溶液（1→10），105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的主斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾(見(jiàn)圖2)。

白芍、赤芍、牡丹皮：取本品10片，除去糖衣，研細(xì)，加甲醇50 mL，加熱回流1 h，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次30 mL，合并正丁醇液，用正丁醇飽和的水洗滌2次，每次30 mL，棄去水液，正丁醇液回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，置中性氧化鋁柱（100～200目，5 g，內(nèi)徑1～1.5 cm）上，用甲醇50 mL洗脫，收集洗脫液，回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液[3-4]。另取芍藥苷對(duì)照品，加甲醇制成每1 mL含1 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取處方中除去牡丹皮、白芍、赤芍的其他藥味，按處方比例制成缺牡丹皮、白芍、赤芍的陰性對(duì)照樣品，同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。吸取上述3種溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（40∶5∶10∶0.2）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾(見(jiàn)圖3)。

圖1 三七及續(xù)斷薄層色譜圖

圖2 血竭薄層色譜圖

圖3 牡丹皮、白芍、赤芍薄層色譜圖

枳實(shí)、骨碎補(bǔ)：取本品2片，除去糖衣，研細(xì)，加甲醇15 mL，加熱回流1 h，放冷，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取枳實(shí)對(duì)照藥材0.02 g、骨碎補(bǔ)對(duì)照藥材0.04 g，同法分別制成對(duì)照藥材溶液。取橙皮苷對(duì)照品、新橙皮苷對(duì)照品、柚皮苷對(duì)照品，分別加甲醇制成每1 mL各含0.05 mg的溶液，作為對(duì)照品溶液[8-9]。再取處方中除去枳實(shí)、骨碎補(bǔ)的其他藥味，按處方比例制成缺枳實(shí)、骨碎補(bǔ)的陰性對(duì)照樣品。同供試品溶液的制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。吸取上述7種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一聚酰胺薄膜上，以三氯甲烷-丙酮-甲醇(5∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以三氯化鋁試液，置紫外光燈(365 nm)下檢視[3]。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材和對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性無(wú)干擾(見(jiàn)圖4)。

圖4 枳實(shí)、骨碎補(bǔ)薄層色譜圖

2.2 川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件[1，10-11]

色譜柱：KromasilTMC18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-水，梯度洗脫，0～20 min流動(dòng)相A 20%→40%、流動(dòng)相B 80%→60%，20～35 min流動(dòng)相 A 20%、流動(dòng)相 B 80%；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：212 nm；柱溫：35℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.2.2 溶液制備

精密稱(chēng)取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品適量，加甲醇溶解制成每1 mL含川續(xù)斷皂苷Ⅵ70 μg，即得對(duì)照品溶液。取本品20片，除去糖衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)，取0.15 g，精密稱(chēng)定，置25 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率 300 W，頻率40 kHz）30 min，放冷，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方比例取除續(xù)斷的其余藥材，按供試品制備工藝、供試品溶液的制備方法，得陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

專(zhuān)屬性考察：照擬訂色譜條件，分別精密吸取2.2.2項(xiàng)下3種溶液各20 μL，注入液相色譜儀。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照品溶液色譜相應(yīng)位置有一相同的色譜峰，而陰性樣品溶液色譜則無(wú)此峰，說(shuō)明其他組分對(duì)待測(cè)成分的測(cè)定無(wú)干擾。色譜圖見(jiàn)圖5。

線(xiàn)性關(guān)系考察：精密稱(chēng)取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品18.57 mg，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為對(duì)照品溶液，各進(jìn)樣5，10，15，20，25，30，35 μL，注入高效液相色譜儀，依法測(cè)定，記錄色譜圖。以對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度（X）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性回歸方程為 Y=14 579 X-756.24，r= 0.999 9（n=7）。結(jié)果表明，川續(xù)斷皂苷Ⅵ進(jìn)樣量在 0.347 3～2.430 8 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好線(xiàn)性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品溶液 20 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次。結(jié)果的 RSD為0.13%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品（批號(hào)為 084001）溶液20 μL，在相同的色譜條件下于0，3，7，10，13，15 h時(shí)測(cè)定。結(jié)果的RSD為0.87%（n=6），表明供試品溶液于15 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

圖5 高效液相色譜圖

重復(fù)性試驗(yàn)：稱(chēng)取樣品（批號(hào)為084001）共6份，精密稱(chēng)定，依法測(cè)定川續(xù)斷皂苷Ⅵ含量。結(jié)果的 RSD為0.95%（n=6），表明方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的同一批樣品（批號(hào)為084001）20片，除去糖衣，精密稱(chēng)定，研細(xì)。精密稱(chēng)取3組（每組3份）已知含量的供試品粉末0.05，0.07，0.09 g，分別加入一定量川續(xù)斷皂苷Ⅵ對(duì)照品，按擬訂色譜條件測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 川續(xù)斷皂苷Ⅵ加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3批跌打片樣品(批號(hào)為0804001，0804002，0804003），依法測(cè)定，結(jié)果3批樣品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量分別為每片4.1，4.0，4.0 mg。

3 討論

關(guān)于展開(kāi)劑的選擇，分別選用三氯甲烷-乙酸乙酯-甲醇-水（15∶40∶22∶10）10℃以下放置的下層溶液[3]、正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5）[3]、三氯甲烷-甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液[4]3種不同的展開(kāi)劑，經(jīng)過(guò)大量試驗(yàn)，最終選擇三氯甲烷 -甲醇-水（13∶7∶2）10℃以下放置的下層溶液作為展開(kāi)劑，分離效果較好，陰性無(wú)干擾，且可同時(shí)鑒別三七、續(xù)斷2味藥材，避免造成結(jié)果誤判。

通過(guò)對(duì)比試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)濕度應(yīng)在60%以下，且相對(duì)濕度越低,三七皂苷R1與川續(xù)斷皂苷Ⅵ分離效果越好。三七、續(xù)斷供試品點(diǎn)樣量為 5 μL時(shí)，更易觀察到三七皂苷R1的斑點(diǎn)；點(diǎn)樣量為1 μL時(shí)，供試品中川續(xù)斷皂苷Ⅵ的理論含量與續(xù)斷對(duì)照藥材基本相當(dāng)，更便于川續(xù)斷皂苷Ⅵ斑點(diǎn)的觀察。故建議操作者根據(jù)樣品實(shí)際情況，在同一薄層板上采用不同點(diǎn)樣量試驗(yàn)。

血竭為進(jìn)口貴重藥材，由于進(jìn)口藥材來(lái)源有限，中藥材市場(chǎng)常有偽劣品出現(xiàn)[5]。為有效控制跌打片中血竭的投料質(zhì)量，建立了以2%香草醛硫酸乙醇溶液（1→10）為顯色劑的薄層色譜定性研究方法。結(jié)果表明，經(jīng)顯色的供試品溶液色譜圖中血竭的特征斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾，明顯優(yōu)于其他方法[1]，快速、有效、靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)。

白芍、赤芍和牡丹皮的鑒別試驗(yàn)結(jié)果表明，三者均可檢出丹皮酚，且除去上述藥材所得到的陰性對(duì)照品溶液的色譜圖對(duì)丹皮酚的檢出存在干擾。為初步控制3味藥材的投藥質(zhì)量，最終以芍藥苷作為對(duì)照品，對(duì)處方中白芍、赤芍、牡丹皮投藥情況進(jìn)行定性考察，具有一定的實(shí)際意義。

枳實(shí)、骨碎補(bǔ)的TLC鑒別試驗(yàn)中，采用聚酰胺薄膜作為薄層板，以三氯甲烷-丙酮 -甲醇(5∶1∶1)為展開(kāi)劑[1]，對(duì)同時(shí)鑒別枳實(shí)、骨碎補(bǔ)中的橙皮苷、新橙皮苷與柚皮苷等活性成分有良好的色譜分離效果，明顯優(yōu)于其他方法[4]。分離效果好、靈敏度高、專(zhuān)屬性強(qiáng)。

關(guān)于含量測(cè)定中流動(dòng)相的選擇，最初以乙腈-水（30∶70）為流動(dòng)相，由于本組方藥味多，干擾嚴(yán)重，未取得滿(mǎn)意的分離效果。根據(jù)樣品的分離情況，參照文獻(xiàn)[1，10-11]，最終選擇梯度洗脫，分離效果良好。

[1]WS3-B-3001-98，衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑（第15冊(cè)）·跌打片[S].

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Study on the Quality Standard of Dieda Tablets

Shan Xiuming,Yang Xiao,Qiu Xuewei
(Qingdao Institute for Drug and Food Control,Qingdao,Shandong,China 266071)

Objective To establish the qualitative and quantitative methods to improve its quality standard of Dieda Tablets.Methods TLC was applied to the identification of Notoginseng Radix et Rhizoma,Dipsaci Radix,Draconis Sanguis,Paeonia Radix Alba,Paeonia Radix Rubra,Moutan cortex,Aurantii Fructus ImmaTurus and Drynaria Rhizoma;HPLC was applied to determinte asperosaponin VI;the analytical column was KromasilTMC18column(150 mm×4.6 mm,5μm);the mobile phase was acetonitrile-water at the flow rate of 1.0 mL/min;the detection wavelength was 212 nm;and the column temperature was 35℃.Results The spots in the TLC were clear and could be well separated,the blank test showed that other medicine herbs had not interference with the main one;The calibration curve of asperosaponin VI showed good linearity in the range of 0.347 3-2.430 8 μg(r=0.999 9).The average recovery was 99.14%,RSD was 1.34%(n=9).Conclusion The established methods are accurate,reliable,specific and with good reproducibility.It can be used for the quality control of the Dieda Tablets.

Dieda Tablets;quality standard;TLC;HPLC

R286.0；R284.1

A

1006-4931(2015)19-0041-03

單秀明（1970-），女，大學(xué)本科，主管藥師，主要從事中成藥質(zhì)量控制研究，（電子信箱）shanxium＠163.com。

2014-10-27；

2015-03-20)

方法 采用薄層色譜（TLC）法，建立跌打片中三七、續(xù)斷、血竭、白芍、赤芍、牡丹皮、枳實(shí)和骨碎補(bǔ)的定性分析方法；采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定川續(xù)斷皂苷Ⅵ的含量，色譜柱為KromasilTMC18柱(150 mm×4.6 mm，5 βm)，流動(dòng)相為乙腈-水(梯度洗脫)，流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)212 nm，柱溫35℃。結(jié)果TLC鑒定組成斑點(diǎn)清晰，陰性無(wú)干擾；川續(xù)斷皂苷Ⅵ進(jìn)樣量在0.347 3～2.430 8 βg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線(xiàn)性關(guān)系（r=0.999 9），平均加樣回收率為99.14%，RSD為1.34%（n=9）。結(jié)論該法準(zhǔn)確可靠、專(zhuān)屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，能有效地控制跌打片的內(nèi)在質(zhì)量。