藏藥二十味肉豆蔻丸中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定*

康新莉，顧 健，譚 睿

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031；2.西南民族大學(xué)民族醫(yī)院研究院，四川 成都 610051)

藏藥二十味肉豆蔻丸中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定*

康新莉1，顧 健2，譚 睿1

（1.西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川 成都 610031；2.西南民族大學(xué)民族醫(yī)院研究院，四川 成都 610051)

目的建立二十味肉豆蔻丸中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定方法。方法采用反相高效液相色譜法，色譜柱為Global Chromatography C18柱（250 mm×4.6 mm，5 βm），流動(dòng)相為甲醇-乙腈-0.5%磷酸水溶液（29∶2∶69），流速1 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)403 nm。結(jié)果羥基紅花黃色素A進(jìn)樣量在0.16～1.28 βg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好（r=0.999 8，n=6）；平均加樣回收率為101.48%，RSD=2.56%（n=6）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，重復(fù)性好，可作為藏藥二十味肉豆蔻丸中羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定方法。

二十味肉豆蔻丸；羥基紅花黃色素A；含量測(cè)定；高效液相色譜法

二十味肉豆蔻丸為經(jīng)典藏藥復(fù)方，主要由肉豆蔻、沉香、丁香、降香、藏茴香、余甘子等20味藏藥材組方，原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有性狀描述和簡(jiǎn)單的理化鑒別，無(wú)法有效控制藥品質(zhì)量[1]。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道的該藥含量測(cè)定僅局限于肉豆蔻中的有效成分，但由于該復(fù)方藥味較多，化學(xué)成分復(fù)雜，有必要對(duì)其他主藥進(jìn)行質(zhì)量控制[2-8]。本試驗(yàn)中建立了測(cè)定方中主藥紅花所含羥基紅花黃色素A含量的反相高效液相色譜(RP-HPLC)法，為其質(zhì)量控制提供了可靠依據(jù)。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent公司），包括四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、DAD檢測(cè)器、工作站；Sartorius BS110型電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；KQ5200DE型超聲波清洗儀（上海昆山超聲波儀器廠）。羥基紅花黃色素A對(duì)照品（批號(hào)為111637-201206，中國(guó)食品藥品檢定研究院）；甲醇、乙腈（色譜純，Sigma公司），水為超純水（自制），其他試劑為分析純；二十味肉豆蔻丸（西藏自治區(qū)藏醫(yī)院，批號(hào)為120905；西藏昌都地區(qū)藏醫(yī)院，批號(hào)為120401；西藏日喀則地區(qū)藏醫(yī)院，批號(hào)為120115；四川省甘孜藏族自治州藏醫(yī)院，批號(hào)為120718；西藏神猴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)為 20120509，20130421，20140615；西藏金珠雅礱藏藥有限公司，批號(hào)為120101，120603，140523)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[9-12]

色譜柱：Global Chromatography C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-乙腈-0.5%磷酸水溶液（29∶2∶69）；檢測(cè)波長(zhǎng)：403 nm；柱溫：30℃；流速：1 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

精密稱取羥基紅花黃色素A對(duì)照品8.04 mg，加25%甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，搖勻，制成每1 mL中含羥基紅花黃色素A 0.804 mg的溶液，作為對(duì)照品貯備液。取本品約10 g，精密稱定，精密加入25%甲醇100 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率120 W，頻率40 kHz）30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方組成比例，稱取除紅花的方中其他藥材適量，與供試品溶液制備方法同法制備溶液，作為陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

陰性干擾試驗(yàn)：精密吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。色譜圖見(jiàn)圖1?？梢?jiàn)，供試品溶液色譜中，在與羥基紅花黃色素A對(duì)照品溶液色譜相同保留時(shí)間處有色譜峰出現(xiàn)，而陰性對(duì)照品溶液色譜則無(wú)此峰，說(shuō)明樣品中其他成分對(duì)羥基紅花黃色素A的測(cè)定無(wú)干擾。

線性關(guān)系考察：分別精密量取對(duì)照品貯備液0.1，0.2，0.4，0.6，0.7，0.8 mL，加25%甲醇稀釋定容于5 mL容量瓶中，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積。以色譜峰面積(Y)為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y=2 213.5 X-7.976，r=0.999 8（n=6）。結(jié)果表明，羥基紅花黃色素 A進(jìn)樣量在0.16～1.28 μg范圍內(nèi)與峰面積具有良好的線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積的 RSD=1.86%（n=6），表明儀器精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：精密稱取同一樣品（西藏昌都地區(qū)藏醫(yī)院，批號(hào)為120401）6份，依法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。結(jié)果平均含量的 RSD=1.90%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

圖1 高效液相色譜圖

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品（西藏昌都地區(qū)藏醫(yī)院，批號(hào)為120401）溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時(shí)依法進(jìn)樣。結(jié)果峰面積的 RSD=1.11%（n=7），表明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密稱取已知含量的樣品（西藏昌都地區(qū)藏醫(yī)院，批號(hào)為120401）6份，每份約1.00 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，分別加入0.48 mg羥基紅花黃色素A對(duì)照品，并加入25%甲醇10 mL，按供試品溶液制備方法制備溶液，依法進(jìn)樣測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 羥基紅花黃色素A加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.4 樣品含量測(cè)定

取10批樣品，依法制備供試品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以峰面積計(jì)算羥基紅花黃色素A的含量。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

本試驗(yàn)中以羥基紅花黃色素A為含量考察指標(biāo)，分別以水、25%甲醇、50%甲醇、80%甲醇、甲醇為溶劑，超聲30 min進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，25%甲醇的提取含量較高，故選作樣品的提取溶劑；同時(shí)，對(duì)樣品提取方式及時(shí)間進(jìn)行了系列考察，結(jié)果顯示，回流和超聲對(duì)提取率的影響不大，且超聲提取操作比較簡(jiǎn)便，且30 min基本上可將羥基紅花黃色素A提取完全，故選用超聲提取30 min作為提取方法。

選擇流動(dòng)相時(shí)，對(duì)比了不同流動(dòng)相的分離效果及峰對(duì)稱因子、理論板數(shù)等，如甲醇 -乙腈-0.5%磷酸水（26∶2∶72）、甲醇-乙腈-0.7%磷酸水溶液（26∶2∶72）、甲醇-乙腈-1.0%磷酸水溶液（26∶2∶72）、甲醇-乙腈 -0.5%磷酸水溶液（29∶2∶69），結(jié)果表明，以甲醇-乙腈 -0.5%磷酸水溶液（29∶2∶69）為主流動(dòng)相時(shí)，主峰峰形較好且保留時(shí)間短、分離度好，且方中其他成分對(duì)羥基紅花黃色素A的含量測(cè)定無(wú)干擾。

藏藥二十味肉豆蔻丸所含藥味較多，成分復(fù)雜，本試驗(yàn)中僅對(duì)10批樣品進(jìn)行含量測(cè)定，存在一定的局限性。綜合考慮，暫定二十味肉豆蔻丸中每1 g含羥基紅花黃色A（C27H32O16）應(yīng)不得少于0.45 mg。

總之，本試驗(yàn)中所建立的含量測(cè)定方法不僅操作簡(jiǎn)單、準(zhǔn)確，且重復(fù)性好，可用于二十味肉豆蔻丸的質(zhì)量控制。

[1]WS3-BC-0164-95，中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·藏藥(第一冊(cè))[S].

[2]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M].北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：142-143.

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[5]譚 銳，張 良.藏藥二十味肉豆蔻丸中丁香酚的HPLC測(cè)定[J].中國(guó)藥事，2003，17（4）：224-225.

[6]陳常蓮，胡斯樂(lè).HPLC測(cè)定蒙藥德都紅花七味丸中羥基紅花黃色素A的含量[J].中國(guó)中藥雜志，2012，37(23)：3 673-3 675.

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Content Determination of Hydroxysaffor Yellow A in Tibetan Medicine Ershiwei Roudoukou Pills

Kang Xinli1,Gu jian2,Tan Rui1
(1.Southwest Jiaotong University,Chengdu,Sichuan,China 610031; 2.Southwest University for Nationalities,Chengdu,Sichuan,China 610051)

Objective To establish a method for the content determination of the hydroxysaffor yellow A in Ershiwei Roudoukou Pills.Methods The determination was performed by HPLC method on Global Chromatography C18column（250 mm×4.6 mm,5 μm）at the wavelength of 403 nm using methanol-acetonirile-0.5% phosphoric acid-water(29∶2∶69)as the mobile phase.The column temperature was 30℃ and the flow rate was 1.0 mL/min.Results The linear rang of hydroxysaffor yellow A was 0.16-1.28 μg and the average recovery rate was 101.48%,RSD=2.56%（n=6）.Conclusion The established methods is simple,convenient and accurate with good reproducibility,and can be applied to determine the content of hydroxysafflor yellow A in Tibetan Medicine Ershiwei Roudoukou Pills.

Ershiwei Roudoukou Pills;hydroxysafflor yellow A;content determination;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006-4931(2015)19-0039-02

康新莉，女，在讀碩士研究生，藥師，研究方向?yàn)槊褡逅幬镔Y源評(píng)價(jià)，（電子信箱）1315356502＠qq.com；譚睿，女，博士研究生，教授，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化和新制劑研發(fā)，本文通訊作者，（電話）028-8734667（電子信箱）tanrui＠swjtu.edu.cn。

2015-04-23)

β重大新藥創(chuàng)制國(guó)家科技重大專項(xiàng)“中藥新藥安全性檢測(cè)技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)研究”子課題，項(xiàng)目編號(hào)：2014ZX09304307001-019；國(guó)家藥典委員會(huì)“2011-2012年度國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高工作(中藥)科研立項(xiàng)”，項(xiàng)目編號(hào)：892。