節(jié)瓜抗鐮刀菌酸突變體NBS類RGAs序列的分離鑒定

趙　芹，謝大森，何曉明，羅少波，彭慶務(wù)，陳俊秋

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州510640)

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節(jié)瓜抗鐮刀菌酸突變體NBS類RGAs序列的分離鑒定

趙芹，謝大森，何曉明，羅少波，彭慶務(wù)，陳俊秋

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，廣東廣州510640)

摘要:為挖掘和利用節(jié)瓜抗病種質(zhì)資源，根據(jù)已克隆植物NBS-LRR(nucleotide binding site and leucine rich repeat)類抗病基因保守區(qū)設(shè)計簡并引物，從節(jié)瓜抗鐮刀菌酸突變體“LT3”的基因組DNA中擴增得到250 bp目的條帶，通過重組克隆及測序獲得22條NBS抗病同源序列(命名為JNB1～JNB22)。利用DNAStar軟件及NCBI Blastx同源搜索發(fā)現(xiàn)，這些抗病同源序列長度為249～250 nt，推導(dǎo)氨基酸序列具有P-loop、Kinase-2a典型NBS類R基因保守結(jié)構(gòu)域，其中21條具連續(xù)ORF(open reading frame)；核苷酸序列相似性在48.8%～99.2%，氨基酸序列相似性為18.1%～100.0%；氨基酸序列聚類分析分為6個組。Blast結(jié)果顯示，節(jié)瓜RGAs(resistance gene analogs)核苷酸序列與其他植物R基因最高相似性為72%～99%，對應(yīng)氨基酸序列與其他植物具有36%～100%相似性，多數(shù)序列與冬瓜R基因相似性最高；同源進化分析表明，所有節(jié)瓜RGAs序列均為nonTIR-NBS-LRR類，與氨基酸序列同源比對結(jié)果一致。節(jié)瓜NBS類抗病同源序列的分離鑒定為進一步克隆功能性抗病基因及分子標記輔助抗病育種提供參考。

關(guān)鍵詞:節(jié)瓜抗病突變體；NBS-LRR類；抗病同源序列；同源克隆；序列分析

節(jié)瓜(BenincasahispidaCogn.var.chieh-quaHow)又名毛瓜，是華南地區(qū)重要特色蔬菜，主要分布在廣東、廣西、海南等地，類型品種豐富。節(jié)瓜在廣東省地區(qū)栽培有300多年歷史，年種植面積超2萬hm2；節(jié)瓜產(chǎn)量高，耐貯運，風(fēng)味別致，營養(yǎng)保健價值高[1-2]，是夏秋季節(jié)的重要蔬菜之一，除滿足本地市場外，也是華南地區(qū)北運和出口創(chuàng)匯的重要蔬菜品種，對于調(diào)節(jié)蔬菜淡季、保證蔬菜周年供應(yīng)起著非常重要的作用[3]。

隨著市場需求的提高和種植面積的擴大，枯萎病成為制約節(jié)瓜生產(chǎn)的重要因素，給節(jié)瓜生產(chǎn)造成嚴重損失[4]，特別是老病田，嚴重時顆粒無收。由于枯萎病菌為土傳病害，通過生物防治與栽培措施難以根治。實踐證明，挖掘新的抗性基因資源，結(jié)合分子育種技術(shù)培育和合理利用新抗病品種是控制病害的最經(jīng)濟有效的途徑[5-6]。本課題組通過多年種質(zhì)資源引進、收集和創(chuàng)新，通過病原菌接種建立了節(jié)瓜抗枯萎病篩選技術(shù)，另外以鐮刀菌酸作為脅迫劑，對節(jié)瓜無菌苗莖尖不定芽進行抗性離體篩選，建立了節(jié)瓜抗枯萎病離體篩選技術(shù)體系，并獲得多份節(jié)瓜抗鐮刀菌酸變異體[7]。因此利用本課題組的資源優(yōu)勢，克隆分析與研究節(jié)瓜抗病基因，對提高節(jié)瓜抗病性及闡明節(jié)瓜抗病分子機制具有重要意義。

抗病基因的克隆一直是植物分子生物學(xué)研究領(lǐng)域的熱點之一。迄今通過圖位克隆與轉(zhuǎn)座子標簽等方法分離克隆了70多個針對不同病原物的抗病基因[8]。這些R基因編碼產(chǎn)物存在許多高度保守的區(qū)域，以此為基礎(chǔ)將抗病基因分為8類，如核苷酸結(jié)合位點和富亮氨酸重復(fù)(nucleotide binding site and leucine rich repeat，NBS-LRR)、絲氨酸-蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)(ser/thr-kinase，STK)、蛋白激酶類(protein kinase，PK)等[9]，其中NBS-LRR類抗病基因在基因組中含量最為豐富，約占總數(shù)的75%[10-11]。鑒于抗病基因同源序列可能為R基因或假基因一部分或與R基因緊密連鎖，因此根據(jù)這些抗病基因的保守序列設(shè)計引物，PCR擴增同源序列，成為克隆該類抗病基因的有效途徑，目前已在小麥、水稻、大豆和黃瓜等多種作物中廣泛應(yīng)用[12-15]。節(jié)瓜R基因的克隆至今尚未取得實質(zhì)性進展，從節(jié)瓜中分離RGA有助于篩選與各種抗病基因連鎖的分子標記，且對某些RGA的結(jié)構(gòu)特征、表達特性以及調(diào)控特點的研究，有助于深入闡釋節(jié)瓜的抗病機制，為進一步利用圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)或RACE技術(shù)獲得節(jié)瓜抗病基因全長奠定基礎(chǔ)。本研究以節(jié)瓜抗性材料“LT3”為試材，同源擴增NBS類抗病基因序列，為進一步克隆功能性抗病基因及開發(fā)分子標記輔助育種提供研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1植物材料

節(jié)瓜抗性材料為抗鐮刀菌酸突變體“LT3”，由感枯萎病品種“A06”無菌組培苗經(jīng)鐮刀菌酸(60～80 mg/L)脅迫篩選得到的抗性體細胞無性系變異，再生植株的2～3葉期小苗，經(jīng)枯萎病菌接種和鐮刀菌酸脅迫鑒定，表現(xiàn)抗病性增強，其他主要農(nóng)藝性狀無明顯變化。其自交系種子于2013年8月播種于溫室營養(yǎng)盤內(nèi)，待幼苗長至2～3片真葉，采集葉片保存于-70 ℃冰箱備用。

1.2主要試劑

ExTaqDNA聚合酶、dNTP與pMD 19-T載體試劑盒為大連寶生物(TaKaRa)生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖、DNA回收試劑盒、Amp抗生素、DNA Marker、大腸桿菌DH5α感受態(tài)均為廣州鼎國生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；其余試劑為國產(chǎn)分析純；

1.3節(jié)瓜基因組DNA提取與引物設(shè)計合成

采用改良CTAB法[16]提取節(jié)瓜“LT3”葉片總DNA，利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳及納米紫外分光光度計檢測DNA濃度及純度。

參考芒果與南瓜等[17-18]NBS類抗病基因的保守結(jié)構(gòu)域，設(shè)計合成簡并引物。引物由廣州英駿生物技術(shù)公司合成。NBS-F:5′-GGYATGGGNGGYMTHGGNAARAC-3′，NBS-R:5′-CCANACATCATCMAGSACAA-3′，其中R=A/G，N=A/G/C/T，Y=C/T，M=A/G/T，S=C/G。

1.4PCR擴增與克隆

以提取的節(jié)瓜總DNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)體系包括50 ng模板DNA 2.5 μL，10×Exbuffer (含MgCl2)、1 UExTaqDNA聚合酶、0.2 mmol/L dNTPs、0.4 μmol/L引物，滅菌雙蒸水補充至總體積25 μL。按以下反應(yīng)程序擴增：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，反應(yīng)35個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。整個反應(yīng)在GeneAmp system 9700型PCR擴增儀(ABI公司)上進行。

擴增產(chǎn)物利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，在Bio-Rad公司GeneGeniusBio Imaging System凝膠成像系統(tǒng)下觀察和拍照。

1.5PCR產(chǎn)物純化、克隆與測序

PCR產(chǎn)物回收純化后與pMD 19-T Vector連接，轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞內(nèi)，涂布在固體LB(含Amp 100 μg/mL)培養(yǎng)基上培養(yǎng)過夜，利用M13通用引物進行菌落PCR檢測，陽性克隆菌液送與廣州英駿生物技術(shù)有限公司測序。

1.6目的片段序列測定及序列同源性分析

測得序列在GenBank中用Blastn和Blastx工具進行核苷酸序列和氨基酸序列間的同源搜索，利用DNAstar軟件進行序列比對，分析各序列長度、變異位點、相似性、遺傳分歧及序列同源比對；結(jié)合GenBank公布的其他物種NBS-LRR類抗病基因蛋白序列，利用MegAlign構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹進行同源進化分析，對節(jié)瓜RGAs進行歸類分析，用于參比的已知R基因有番茄Mi-1.1(AF03 9681)、煙草N(BAD12594)、亞麻M(U73916)、擬南芥RPS2 (U14158)、甜瓜FOM-2(AY583855)、番茄I2C-1(AF004878)、亞麻L11(AF093641)，其中N、M與L11屬于TIR-NBS-LRR類抗病基因，Mi-1.1、RPS2、FOM-2和I2C-1屬于non -TIR-NBS-LRR類的抗病基因[18-19]。

2結(jié)果與分析

M:DNA Marker DL2 000;1-2:節(jié)瓜NBS類RGAs PCR產(chǎn)物。M:DNA Marker DL2 000;1-2:PCR productsof NBS type RGAs from chieh-qua.圖1　節(jié)瓜NBS類RGAs PCR產(chǎn)物電泳分析Fig.1　Electrophoresis analysis of PCR productsof NBS type RGAs from chieh-qua

2.1節(jié)瓜NBS類RGAs的克隆與鑒定

由圖1可見，從節(jié)瓜基因組DNA擴增得到250 bp左右的明亮特異條帶；挑取24個菌落測序，獲得22個特異片段命名為JNB1-JNB22，序列長度在249～250 nt；NCBI blastp同源比對發(fā)現(xiàn)22條RGAs與其他作物R基因具較高相似性；其推導(dǎo)氨基酸序列均包含NBS類R基因特有的保守結(jié)構(gòu)域，推測均為節(jié)瓜RGAs。除JNB12在第5與43位氨基酸殘基處提前終止外，其他序列均具備連續(xù)的開放閱讀框(open reading frame，ORF)。22條RGAs核苷酸序列相似性為48.8%～99.2%，遺傳分歧為1.6～83.3；其中JNB20與JNB21相似性最高，JNB2與JNB3相似性最低；各序列間存在472個變異位點，在80～190 nt位置變異最豐富，由此可見節(jié)瓜RGAs中存在豐富的變異位點，可能分屬于節(jié)瓜中不同的抗病基因或具有NBS結(jié)構(gòu)域的不同基因(圖2，表1)。

“-”為優(yōu)化聯(lián)配產(chǎn)生的缺口?！?”Gaps introduced for optimal alignment.圖2　節(jié)瓜NBS類RGAs核苷酸序列比對Fig.2　Nucleotide sequences alignment of NBS type RGAs in chieh-qua

%

22條節(jié)瓜RGAs推導(dǎo)氨基酸序列相似性在18.1%～100.0%，遺傳分歧為0～273.0，其中JNB2與JNB12相似性最低為18.1%，JNB3與JNB7、JNB19與JNB4、JNB20與JNB5、JNB21與JNB5、JNB10與JNB6、JNB14與JNB6、JNB18與JNB6等16對基因片段相似性為100.0%(表1)。核苷酸序列進化樹中，22條RGAs分為3組，其中JNB8、JNB9、JNB22、JNB15、JNB2與其他片段遺傳距離最遠，為第1組，分為2個亞組，JNB2單獨為一亞組，剩余片段為第2亞組；JNB5、JNB20、JNB21、JNB17、JNB4與JNB19為第2組，剩余RGAs組成第3組，分為4個亞組，其中JNB12、JNB1與JNB13各單獨形成一亞組，剩余為第4亞組(圖3)。由此看出，節(jié)瓜NBS類RGAs基因在進化時表現(xiàn)出較大的遺傳分歧。

圖3　節(jié)瓜抗鐮刀菌酸突變體NBS類RGAs 核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3　DNA phylogenetic tree of NBS type RGAs in chieh-qua

2.2節(jié)瓜NBS類RGAs保守結(jié)構(gòu)域分析

“.”終止密碼子;JNB1～JNB22.pro表示節(jié)瓜NBS類RGAs JNB1-JNB22的推導(dǎo)氨基酸序列?！?”Stop code;JNB1～JNB22.pro representing the deduced amino acid sequences of chieh-qua NBS type RGAs JNB1～JNB22.圖4　節(jié)瓜NBS類RGAs氨基酸序列比對Fig.4　Amino acid sequences alignment of NBS type RGAs protein in chieh-qua

前人研究報道P-loop區(qū)域為GMGGI/LGKTT，Kinase-2區(qū)域為(L/F)(L/V)VLD(D/N)(V/M) W，Kinase-3區(qū)域為GSR(R/V/K)(V/I)L(L/I/V)TTR。節(jié)瓜NBS類RGAs結(jié)構(gòu)域相當保守，除JNB12不包含P-loop結(jié)構(gòu)外，其他序列存在典型的P-loop(GMGGI/LGKTT/M)、Kinase-2 (F/LL /VVLDDVW)功能域 (圖4)，部分序列保守結(jié)構(gòu)域中發(fā)生單個氨基酸突變，JNB2、JNB8、JNB9、JNB15與JNB22 P-loop功能域GMGGI/LGKTT變?yōu)镚MGGI/LGKTM，基本骨架未改變。由此表明本實驗獲得了22條序列(JNB1～JNB22)為潛在候選基因片段。前人研究報道NBS區(qū)域內(nèi)Kinase-2結(jié)構(gòu)域最后一個氨基酸殘基是區(qū)分TIR-NBS-LRR和nonTIR-NBS-LRR類抗病基因的重要特征[20]，TIR-NBS-LRR類抗病基因中Kinase-2基序最后一個殘基為天冬氨酸(D)，而在nonTIR -NBS-LRR類抗病基因中都為色氨酸(W)，因此本研究中獲得的22條節(jié)瓜NBS類RGAs均為nonTIR-NBS-LRR類抗病基因。

2.3節(jié)瓜RGAs氨基酸序列的同源性檢索

22條RGAs核苷酸序列與其他植物NBS類R基因具有72%～99%相似性，其推導(dǎo)氨基酸序列均表現(xiàn)NB-ARC保守結(jié)構(gòu)域特征，與其他植物R基因相似性在36%～100%，物種名稱與GenBank登錄號及系統(tǒng)發(fā)育進化樹見圖5。22條節(jié)瓜RGAs除JNB2外，與冬瓜NBS類抗性蛋白最高相似性在98%～100%，JNB2與黃瓜推測抗病蛋白(XP004138985)相似性最高，為85%。所有抗病同源序列分為6個組，節(jié)瓜RGAs主要聚集在第1與2組中，17份節(jié)瓜RGAs與FOM2及15份其它物種抗病同源序列聚為第1組，第2組包括5份節(jié)瓜RGAs、RPS2及2份其他植物RGAs，第3組包括參比基因I2C-1、Mi-1.1及5份其他物種RGAs，葡萄RGA(AAR08873)單獨組成第4組，參比基因L11與M聚為第5組，N基因與其他RGAs遺傳距離最遠，為第6組。

依據(jù)系統(tǒng)發(fā)育進化樹及參比基因的位置，將獲得片段分為2大類，第5與6組L11、M及N基因?qū)賂IR-NBS-LRR類，而分布于剩余4個組的22份節(jié)瓜RGAs、參比基因FOM2、I2C-1及Mi-1.1與23份其他物種RGAs屬nonTIR-NBS-LRR類(圖5)。這與節(jié)瓜RGAs氨基酸序列多重比較結(jié)果一致。

圖5　節(jié)瓜與其他已知物種NBS基因類似物編碼蛋白序列聚類分析Fig.5　Phylogenetic tree of NBS type RGAs protein sequences in known different plants and chieh-qua

3結(jié)論與討論

節(jié)瓜廣泛栽培于廣東、廣西與海南等地，經(jīng)濟價值巨大。瓜類枯萎病是目前危害節(jié)瓜生產(chǎn)的最主要病害之一,是由一種真菌引起的世界性土傳病害，在整個生育期均可發(fā)病。華南地區(qū)節(jié)瓜枯萎病的田間發(fā)病率通常為30%，嚴重時可達70%以上，給生產(chǎn)造成十分嚴重的損失。實踐證明培育抗病品種具有穩(wěn)定、安全、環(huán)保等優(yōu)點，是最為經(jīng)濟有效的方法。節(jié)瓜原產(chǎn)于我國南方，抗枯萎病的品種資源十分豐富，利用我國特有的資源優(yōu)勢，對現(xiàn)有資源進行抗節(jié)瓜枯萎病的抗性機制研究，對于合理有效的利用我國抗節(jié)瓜枯萎病品種資源和抗病育種工作具有重要意義。本研究室以鐮刀菌酸作為脅迫劑，對感病節(jié)瓜莖尖不定芽進行離體篩選，獲得了多份抗鐮刀菌酸突變體。迄今尚未有節(jié)瓜抗病基因或其同源序列克隆的報道。因此，利用自主創(chuàng)新的特色抗性種質(zhì)，發(fā)掘鑒定其自身的抗病基因，將為節(jié)瓜基因工程、抗病品種培育創(chuàng)制寶貴的實驗材料，并可以為其他瓜類抗性育種研究提供有價值的借鑒。

NBS類基因是已知的R基因家族中最大的一類基因，以基因簇多拷貝形式與其他R基因序列排列在染色體上，有些基因簇含有十幾個甚至幾十個基因序列，使得基因內(nèi)和基因間錯配、重組、重復(fù)的頻率大大提高，促進無義基因與新R基因的產(chǎn)生[21-22]。本研究根據(jù)已克隆的NBS類R基因保守結(jié)構(gòu)域，設(shè)計簡并引物，從節(jié)瓜中分離了22條抗病同源序列，相似性變異范圍較大，其中1條序列不能翻譯為完整氨基酸序列，可能屬于基因組中的非編碼區(qū)域或內(nèi)含子存在、無法通讀的假基因。所有序列包含472個變異位點，在80～190 nt區(qū)間變異最為豐富，說明從節(jié)瓜中分離NBS類同源基因具有很大隨機性，同時節(jié)瓜NBS類基因存在一個龐大基因家族，這些基因可能來自同一基因的不同拷貝或?qū)儆诓煌嫦?，且變異程度較高；21條節(jié)瓜RGAs序列均包含NBS類R基因典型保守結(jié)構(gòu)域，且包含連續(xù)開放閱讀框，與已克隆其他物種尤其是冬瓜的R基因具較高相似性，表明這些序列可能為功能性R基因，同時說明節(jié)瓜與其他瓜類尤其是冬瓜的親緣關(guān)系緊密。

雖然NBS結(jié)構(gòu)域是最重要的抗病基因保守結(jié)構(gòu)域之一，但具有NBS結(jié)構(gòu)域的基因不一定就是抗病基因[23]，有可能是功能抗病基因的殘遺物，也可能是由于抗病基因簇里的重組進一步演化出的假基因，因此還需其他可能與抗病更直接相關(guān)的重要結(jié)構(gòu)域[24]。NBS類基因由3個區(qū)域組成，包括P-loop(結(jié)合ATP或GTP的磷酸)，kinase 2及kinase 3a，多數(shù)研究是根據(jù)P-loop及kinase 3a設(shè)計引物，而本研究是根據(jù)前2個保守域來設(shè)計的，分離得到的21條具連續(xù)開放閱讀框的NBS類RGAs，均具有TIR與NBS保守結(jié)構(gòu)域，但還需進一步表達分析以鑒定真正具有抗病功能的基因；而后以其為研究對象，進一步擴增全長基因開展功能研究或開發(fā)分子標記輔助抗病育種將是下一步具重要研究意義的工作。

RGA在基因組中的分布和演化在一定程度上反映了抗病基因的情況，因此將 22 個節(jié)瓜RGA序列與已知抗病基因進行了聚類分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有抗病基因序列分為6組，而所得節(jié)瓜RGAs序列全部分布于groupI與groupII，表明所獲得的節(jié)瓜RGA序列大部分為潛在的2個類型的抗病基因，進一步通過文庫篩選或者通過RACE方法獲得其cDNA全長，并對病害誘導(dǎo)條件下的表達試驗進行研究，以鑒定其與抗病性的關(guān)系，將是值得深入研究的內(nèi)容。

NBS-LRR基因可分為2個亞類，一類含有TIR結(jié)構(gòu)域(TIR-NBS-LRR)，另一類不含TIR結(jié)構(gòu)域，但是在N端含有螺旋卷曲結(jié)構(gòu)域(CC-NBS-LRR)。依據(jù)同源進化分析發(fā)現(xiàn)節(jié)瓜RGAs與nonTIR-NBS-LRR參比基因FOM2、I2C-1、Mi-1.1聚在2個組內(nèi)，說明節(jié)瓜RGAs屬nonTIR-NBS-LRR類R基因；節(jié)瓜RGAs的P-loop與Kinase-2功能域總結(jié)為GMGGI/LGKTT/M和F/LL/VVLDDVW，且所有序列Kinase-2結(jié)構(gòu)域最后一個氨基酸基團均為W，表明為nonTIR-NBS-LRR類R基因，與前面結(jié)論一致，也進一步支持了前人的研究結(jié)果[20]，節(jié)瓜RGAs保守結(jié)構(gòu)域也存在一些突變，但未影響到整個保守域性質(zhì)；保守域外的氨基酸序列變異程度較大，序列整體的相似性變化范圍較廣(18.1%～100.0%)，與其他物種的相似性也在36%～100%。這些點突變、插入和缺失可能是引起節(jié)瓜RGAs多樣性的原因。上述研究結(jié)果均為進化趨異假說提供了一些間接證據(jù)[11]。

由于節(jié)瓜細胞學(xué)與分子水平研究非常薄弱，利用圖位克隆和轉(zhuǎn)座子標簽技術(shù)克隆節(jié)瓜抗病基因仍具有一定困難。利用基于同源候選基因的克隆策略對分離與已知抗病基因緊密連鎖和可能存在的同一候選基因是一種簡便快捷且有效的手段，但該方法也具有其局限性，如分離基因具有很大的隨機性，或者獲得片段含有保守結(jié)構(gòu)域，但可能與植物抗性無關(guān)，且對候選抗病基因的抗譜不易確定。因此可通過用不同堿基組合的簡并引物PCR擴增，或從不同部位與時期cDNA分離RGAs，提高獲得不同R序列機會。本研究以節(jié)瓜抗鐮刀菌酸突變體“LT3”為試材，同源擴增NBS類抗病基因序列，為進一步克隆節(jié)瓜的功能性抗病基因以及分子標記輔助育種提供研究基礎(chǔ)。

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Identification and Cloning of NBS-LRR Type Resistance Gene

Analogues from Chieh-qua Mutant Resistant to Fusaric Acid

ZHAO Qin*,XIE Da-sen,HE Xiao-ming,LUO Shao-bo,

PENG Qing-wu,CHEN Jun-qiu

(Vegetable Research Institute,Guangdong Academy of Agricultural Sciences,Guangzhou Guangdong 510640,China)

Abstract:To explore and apply resistance genes of chieh-qua,degenerate primers were designed and synthesized to isolate resistance gene analogues (RGAs) from genomic DNA of chieh-qua resistant mutant “LT3” to fusaric acid according to the conserved domains of NBS-LRR (nucleotide binding site and leucine rich repeat) type disease-resistant genes in most known plants and 22 RGAs named JNB1-JNB22 were obtained.Sequence analysis and alignment results indicated that full-length of these RGAs was 249-250 nt,the deduced amino acids sequences contained typical conserved domains of NBS typeRgenes,such as P-loop,Kinase-2a.21 sequences had continuous ORFs (open reading frame).These RGAs showed great homologous differences with

the similarity from 48.4% to 99.2% and amino acid sequence homology varied from 18.1% to 100.0%.At the nucleotide level,the sequence identities of 22 RGAs ranged from 72% to 99% with the cloned NBSRgenes from other plant species.While deduced amino acid sequences of chieh-qua RGAs showed identity with cloned NBS typeRgenes from other plant species ranging from 36% to 100%,especially shared the highest similarities withRgenes of wax gourd.These RGAs were all divided into the nonTIR-NBS-LRR group,which was accordant with multiple alignment of amino acid sequences.Clustering analysis of amino acid sequences indicated that all sequences were divided into 6 groups.These RGAs isolated from chieh-qua in present study would lay the foundation for further cloning of disease resistant genes in chieh-qua and marker-assisted selection (MAS) of disease resistant breeding.

Key words:chieh-qua resistant mutant;NBS-LRR type;resistance gene analogs;homologous clone;sequence analysis

作者簡介：趙芹(1982—)，副研究員，博士，主要從事瓜類遺傳育種與分子生物技術(shù)研究,E-mail：zhaoqin0802@126.com。

基金項目：國家自然科學(xué)基金青年基金(31311643)、廣東省自然科學(xué)博士科研啟動基金(10451064001006063)和廣州市珠江科技新星項目(2013086)

收稿日期：2015-03-10修回日期：2015-05-06

中圖分類號：S642.9

文獻標志碼：A

文章編號：1000-2286(2015)06-1086-08

趙芹，謝大森，何曉明，等.節(jié)瓜抗鐮刀菌酸突變體NBS類RGAs序列的分離鑒定[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，37(6)：1086-1093.