集胞藻PCC6803中sll1981基因的克隆與表達研究

龍昊知，李至敏，王小琴，吳曉玉*，張　寶，王　飛，李志敏*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，江西南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學理學院，江西南昌330045)

?

集胞藻PCC6803中sll1981基因的克隆與表達研究

龍昊知1，李至敏2，王小琴1，吳曉玉1*，張寶1，王飛1，李志敏1*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學生物科學與工程學院，江西南昌330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學理學院，江西南昌330045)

摘要：集胞藻PCC6803中sll1981基因編碼蛋白的功能研究存在爭議。實驗從集胞藻PCC6803基因組中克隆了sll1981基因，將該基因構(gòu)建到pET-32a載體上并在大腸桿菌BL21(DE3)菌體中表達。結(jié)果表明sll1981蛋白可以在該表達體系中高效可溶性表達，利用鎳親和層析純化方法得到了純度大于95%的sll1981蛋白，蛋白收率約為3 mg/g菌體。研究為今后鑒定sll1981蛋白的真正功能奠定了基礎。

關鍵詞：集胞藻，基因克隆，蛋白純化

三羧酸循環(huán)是需氧生物體內(nèi)普遍存在的代謝途徑，在細胞代謝過程中起著至關重要的作用[1]。然而長期以來學術界一致認為藍細菌沒有完整的三羧酸循環(huán)[2-3]，原因是在藍細菌中沒有檢測到將a-酮戊二酸轉(zhuǎn)化成琥珀酰輔酶A的a-酮戊二酸脫氫酶[4-5]。2011年Donald Bryant研究組[6]報道了聚球藻PCC7002中A2770基因和A2771基因分別編碼a-酮戊二酸脫羧酶和琥珀酸半醛脫氫酶的研究，從而使得藍細菌的三羧酸循環(huán)以另外一種方式變得完整。集胞藻PCC6803的全基因組序列測定由日本Kazusa研究中心于1996完成[7]。通過基因組序列比對，本課題組發(fā)現(xiàn)集胞藻PCC6803中的sll1981基因和聚球藻PCC7002中A2770基因的序列相同度達到80%。因此sll1981基因也極有可能編碼a-酮戊二酸脫羧酶。

事實上，2000年F Joset等[8]首先報道sll1981基因編碼乙酰乳酸合成酶。然而該文作者并沒有體外純化sll1981蛋白，也沒有在體外證實sll1981蛋白的乙酰乳酸合成酶活性。2006年，Majumder等[9]報道sll1981基因編碼肌醇磷酸合成酶。但是體外實驗結(jié)果表明sll1981蛋白作為肌醇磷酸合成酶的活性非常低，kcat僅為0.016 s-1。同時，該文作者指出他們用文獻報道的方法[10]沒有測試到重組sll1981蛋白體外具有乙酰乳酸合成酶活性。需要指出的是Majumder等人采用從包涵體中復性的方法獲得了重組sll1981蛋白。因此為了闡明sll1981基因編碼蛋白的真正功能，獲得可溶性的sll1981蛋白就顯得非常關鍵。本課題通過將sll1981基因構(gòu)建到pET-32a載體上，獲得了sll1981蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)菌體中的高效可溶性表達，為下一步鑒定sll1981蛋白的真正功能奠定了基礎。

1材料與方法

1.1實驗材料

大腸桿菌DH5a、BL21(DE3)菌株購自北京全式金生物技術有限公司；集胞藻PCC6803 cDNA來自中科院青島生物能源與過程研究所呂雪峰研究員實驗室；表達載體pET-32a購自Novagen公司；PfuDNA聚合酶，2×Taq Mix，限制性內(nèi)切酶BamHI，XhoI，T4 DNA連接酶，Protein Marker，DNA Ladder，膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒均購自大連Takara公司；Ni Sepharose 6 Fast Flow購自Amersham公司；所用引物由Invitrogen公司合成；質(zhì)粒測序由華大基因完成；其它主要試劑均為分析純，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2實驗方法

1.2.1聚合酶鏈式反應體系sll1981基因片段通過PCR擴增得到，集胞藻PCC6803 cDNA為擴增模板。反應體系為集胞藻PCC6803 cDNA 1 mL，2×Taq Mix 25 mL，上游引物(sll1981F)和下游引物(sll1981R)各0.5 mL (終濃度為10 pmol)，PfuDNA聚合酶0.5 mL，加超純水22.5 mL至總體積50 mL。擴增反應條件為94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。反應結(jié)束后4 ℃保溫。引物序列如下(均為5’→3’方向):

引物sll1981F序列：AAATTTGGATCCATGGGGCAAATGAACACCGCAG (斜體為BamHI酶切位點)

引物sll1981R序列：AATAATCTCGAGTTATTCCCAAATTTCACAGGCC (斜體為XhoI酶切位點)

1.2.2pET32a-sll1981重組子的構(gòu)建與鑒定將PCR擴增得到的sll1981基因片段經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后進行膠回收。在回收得到的30 mL產(chǎn)物中加入10×buffer 5 mL，BamHI內(nèi)切酶1 mL，加超純水至50 mL，將反應體系置于37 ℃培養(yǎng)箱中1 h后用65 ℃水浴(5 min)使BamHI內(nèi)切酶失活，然后加入XhoI內(nèi)切酶1 mL，放置于37 ℃培養(yǎng)箱中1 h。用同樣的方法對pET-32a載體進行BamHI和XhoI雙酶切。膠回收酶切片段后用T4 DNA連接酶16 ℃水浴恒溫下過夜連接sll1981基因片段和pET-32a線性片段(目的片段與載體片段的摩爾比為3∶1)。取連接液10 mL轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞(50 mL)，涂布于含氨芐青霉素(50 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上篩選，37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)后挑取單克隆菌落做PCR鑒定和DNA測序鑒定。

1.2.3pET32a-sll1981重組子的誘導表達方法將上述鑒定正確的菌落于37 ℃搖床培養(yǎng)20 mL，提取質(zhì)粒后適量轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細胞，涂布于含氨芐青霉素(50 mg/mL)的LB固體培養(yǎng)基上于37 ℃恒溫過夜培養(yǎng)，挑取單克隆菌落加入到25 mL含有氨芐青霉素(50 mg/mL)的LB培養(yǎng)液中過夜培養(yǎng)。然后按1%接種量加入過夜培養(yǎng)液至2 000 mL LB培養(yǎng)液中(含有50 mg/mL氨芐青霉素)進行菌體擴大培養(yǎng)。待培養(yǎng)液OD600至0.6～0.8時加入IPTG(終濃度0.2 mmol/L)于20℃，180 rpm繼續(xù)培養(yǎng)10 h。

1.2.4sll1981蛋白的分離純化離心得到的菌體用10倍體積的binding buffer(20 mmol/L Tris-HCl，pH7.5緩沖液)重懸，于冰浴中超聲破碎6 min(超聲工作5 s，間歇25 s，有效功率35%)。菌體裂解液于4 ℃下10 000 rpm離心30 min得到菌體上清液，經(jīng)0.22 mm濾膜過濾后用Ni Sepharose 6 Fast Flow樹脂使用咪唑進行梯度洗脫，用SDS-PAGE檢測目的蛋白。合并含有目的蛋白的洗脫液后于4 ℃下脫鹽濃縮，采用Bradford方法對目的蛋白進行定量[11]。

2結(jié)果與分析

M：DNA marker；1和2均為PCR擴增產(chǎn)物M：DNA marker；1 and 2：PCR product圖1　sll1981的PCR擴增電泳圖Fig.1　PCR amplification of sll1981

2.1pET32a-sll1981重組子的構(gòu)建與鑒定

用集胞藻PCC6803 cDNA作為模板，經(jīng)PCR擴增、瓊脂糖凝膠電泳后獲得約1.7 Kbp大小的DNA條帶，該基因片段與sll1981基因理論大小(1 653 bp)相吻合(圖1)。將該擴增得到的片段和pET-32a載體經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切后得到用于連接反應的目的基因條帶和pET-32a條帶(圖2)。連接液轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞并經(jīng)過夜培養(yǎng)后挑取10個單克隆菌落進行PCR鑒定，結(jié)果得到2個陽性克隆點(20%陽性率，圖3中5和8)，將陽性克隆送由華大基因進行DNA測序，測序結(jié)果經(jīng)ApE軟件分析證明PCR擴增獲得的sll1981基因序列正確。

2.2sll1981蛋白的誘導表達與純化

pET32a-sll1981重組子在大腸桿菌的誘導表達情況如圖4所示。sll1981基因的長度為1 653 bp，其表達的蛋白分子量為60 175.8 Da，然而由于pET-32a載體帶有多個標簽(Trx tag，His tag和S tag)使得pET32a-sll1981重組子表達的蛋白分子量增加為77 879.2 Da，與圖4中泳道1-3中約80 KDa的條帶相一致。泳道1表明sll1981在大腸桿菌BL21(DE3)菌體的表達量較高。泳道2和3表明sll1981是可溶性蛋白，盡管有一部分sll1981存在于沉淀中，總體而言可溶性蛋白的量要高于不可溶性蛋白的量。

M：DNA marker；1：載體pET-32a酶切后產(chǎn)物；2：sll1981基因片段酶切后產(chǎn)物　　M:DNA marker;1:product of pET-32aplasmid;2:product of sll1981圖2　BamHI和XhoI雙酶切后產(chǎn)物鑒定圖　Fig.2　Identification of products after BamHI and XhoI digestion

M：DNA marker；1-10：挑取的單克隆PCR產(chǎn)物M:DNA marker;1-10:PCR products ofpET32a-sll1981 cloning圖3　pET32a-sll1981重組子的PCR鑒定圖Fig.3　PCR identification of pET32a-sll1981

sll1981蛋白的親和層析純化如圖5所示。當咪唑濃度增加到40 mmol/L時，有少量sll1981蛋白洗脫。梯度增加咪唑濃度至100 mmol/L，可以將大部分雜蛋白洗脫掉。之后用含有200 mmol/L咪唑緩沖液將sll1981蛋白全部洗脫，得到純度大于95%的蛋白(圖5泳道2和3)。合并洗脫液2和3后脫鹽濃縮，并用Bradford方法測定獲得的蛋白總量，蛋白收率約3 mg/g 菌體。

M：蛋白質(zhì)標準；1：細胞破碎液；2：離心后上清液；3：離心后沉淀(M:protein marker;1:cell lysate;2:supernatant of cell lysate afer centrifugation;3:precipitate of cell lysate after centrifugation圖4　pET32a-sll1981重組子的IPTG誘導表達及溶解性的凝膠電泳圖Fig.4　SDS-PAGE of sll1981 protein

M：蛋白質(zhì)標準；1-7：咪唑洗脫液，泳道1-3：200 mmol/L咪唑，泳道4-5：100 mmol/L咪唑，泳道6：60 mmol/L咪唑，泳道7：40 mmol/L咪唑M:protein marker;1-7:imidazole elution,lane 1-3:200 mmol/L imidazole,lane 4-5:100 mmol/L imidazole,lane 6:60 mmol/L imidazole,lane 7:40 mmol/L imidazole圖5　sll1981蛋白的親和層析純化圖Fig.5　SDS-PAGE of sll1981 protein purification

3結(jié)論與討論

Chatterjee等[9]的研究發(fā)現(xiàn)sll1981基因在pT7-7載體和大腸桿菌BL21(DE3)的表達體系中盡管表達的蛋白量較高，然而該蛋白為不可溶性蛋白。本實驗室之前的研究發(fā)現(xiàn)pET28a-sll1981重組子在大腸桿菌BL21(DE3)中表達的蛋白也為不可溶性蛋白。本研究表明，pET32a-sll1981重組子在大腸桿菌BL21(DE3)中能得到高效表達并且表達的蛋白為可溶性蛋白，蛋白收率約為3 mg/g菌體。原因可能是pET-32a載體攜帶有編碼硫氧還蛋白標簽(Trx tag)基因，該標簽能夠促使目的蛋白二硫鍵形成，從而增加目的蛋白在原核表達體系中的可溶性[12]。載體上的組氨酸標簽(6×His tag)也為sll1981蛋白的純化提供了便利條件。此外載體中含有的凝血酶酶切位點可以將硫氧還蛋白標簽和sll1981蛋白切開，進一步純化可以得到較接近原始大小的目的蛋白，并且可以提高目的蛋白的純度。sll1981蛋白的功能測定正在進行中。

致謝：本課題研究得到了教育部留學回國人員科研啟動基金項目的支持。本研究的部分數(shù)據(jù)是在中國科學院青島生物能源與過程研究所呂雪峰研究員實驗室完成的，在此對呂雪峰研究員致以謝意。

參考文獻：

[1]Hodges M.Enzyme redundancy and the importance of 2-oxoglutarate in plant ammonium assimilation[J].J Exp Bot,2002,53:905-916.

[2]Schwarz D,Nodop A,Huge J,et al.Metabolic and transcriptomic phenotyping of inorganic carbon acclimation in the cyanobacteriumSynechococcuselongatusPCC 7942[J].Plant physiology,2011,155:1640-1655.

[3]Ohashi Y,Shi W,Takatani N,et al.Regulation of nitrate assimilation in cyanobacteria[J].J Exp Bot,2011,62:1411-1424.

[4]Pearce J,Carr N G.Metabolism of acetate by blue-green algae Anabaena variabilis and Anacystis nidulans[J].J Gen Microbiol,1967,49:301-313.

[5]Smith A J,London J,Stanier R Y.Biochemical basis of obligate autotrophy in blue-green algae and thiobacilli[J].J Bacteriol,1967,94:972-983.

[6]Zhang S Y,Bryant D A.The tricarboxylic acid cycle in cyanobacteria[J].Science,2011,334:1551-1553.

[7]Kaneko T,Sato S,Kotani H,et al.Sequence analysis of the genome of the unicellular cyanobacteriumSynechocystissp.strain PCC6803.II.Sequence determination of the entire genome and assignment of potential protein-coding regions[J].DNA Res,1996,3:109-136.

[8]Maestri O,Joset F.Regulation by external pH and stationary growth phase of the acetolactate synthase fromSynechocystisPCC6803[J].Mol Microbiol,2000,37:828-838.

[9]Chatterjee A,Dastidar K G,Maitra S,et al.Sll1981,an acetolactate synthase homologue ofSynechocystissp PCC6803,functions as L-myo-inositol 1-phosphate synthase[J].Planta,2006,224:367-379.

[10]Kim J,Beak D G,Kim Y T,et al.Effects of deletions at the C-terminus of tobacco acetohydroxyacid synthase on the enzyme activity and cofactor binding[J].Biochem J,2004,384:59-68.

[11]Bradford M M.A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding[J].Anal Biochem,1976,72:248-254.

[12]LaVallie E R,DiBlasio E A,Kovacic S,et al.A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in theE.colicytoplasm[J].Biotechnology,1993,11(2):187-193.

Cloning and Expression of sll1981 Gene fromSynechocystisPCC6803

LONG Hao-zhi1，LI Zhi-min2，WANG Xiao-qin1，WU Xiao-yu1*，

ZHANG Bao1，WANG Fei1，LI Zhi-min1*

(1.College of Bioscience and Bioengineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China;2.College of Science,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Abstract:The function of protein encoded by sll1981 gene fromSynechocystisPCC6803 is in dispute.In this study the sll1981 gene was cloned from the genome ofSynechocystisPCC6803,and a plasmid was constructed by ligating the sll1981 gene with pET-32a vector.The plasmid was transformed withE.coliBL21(DE3) competent cell.The results demonstrated that the sll1981 protein was successfully expressed in the soluble form inE.coliBL21(DE3),and the protein was purified by Ni Sepharose affinity chromatography with purify of > 95%,yield of 3 mg/g wet cell.The study will provide the foundation for identifing the real function of sll1981 protein in future.

Key words:Synechocystis；gene cloning；protein purification

作者簡介：龍昊知(1987—)，男，博士，講師，主要從事微生物生態(tài)研究，E-mail：longhaozhi1987@126.com；*通信作者：吳曉玉，女，教授，博士，E-mail：xywu166@163.com；*通信作者：李志敏,男，副教授，博士，E-mail：zmlizm@126.com。

基金項目：國家自然科學基金資助項目(31400054和31560250)

收稿日期：2015-08-28修回日期：2015-11-02

中圖分類號：Q344+.13;Q949.2

文獻標志碼：A

文章編號：1000-2286(2015)06-1076-04

龍昊知，李至敏，王小琴，等.集胞藻PCC6803中sll1981基因的克隆與表達研究[J].江西農(nóng)業(yè)大學學報，2015，37(6)：1076-1079.