中華蜜蜂與意大利蜜蜂性成熟處女蜂王蛋白質(zhì)組比較分析

吳小波，王子龍，李淑云，顏偉玉，曾志將

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，江西南昌330045)

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中華蜜蜂與意大利蜜蜂性成熟處女蜂王蛋白質(zhì)組比較分析

吳小波，王子龍，李淑云，顏偉玉，曾志將*

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所，江西南昌330045)

摘要：為了比較分析中華蜜蜂和意大利蜜蜂兩蜂種處女蜂王性成熟期蛋白表達(dá)差異。試驗(yàn)采用雙向電泳法建立中華蜜蜂和意大利蜜蜂處女蜂王性成熟期蛋白質(zhì)表達(dá)譜，通過質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定部分差異蛋白。研究發(fā)現(xiàn)：在中華蜜蜂蜂王和意大利蜜蜂蜂王中分別檢測到2 205、2 417個(gè)蛋白點(diǎn)，兩者之間的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)有168個(gè)。其中，在中華蜜蜂蜂王高度表達(dá)的蛋白點(diǎn)有90個(gè)；在意大利蜜蜂蜂王中高度表達(dá)的蛋白點(diǎn)有78個(gè)。對(duì)部分差異蛋白進(jìn)行質(zhì)譜分析，共鑒定了19個(gè)蛋白點(diǎn)，其中在中華蜜蜂性成熟處女蜂王中上調(diào)表達(dá)的蛋白有副肌球蛋白、肌鈣蛋白T、ATP合成酶以及丙酮酸脫氫酶等；在意大利蜜蜂性成熟處女蜂王中上調(diào)表達(dá)的蛋白有NADH輔酶Q氧化還原酶、保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶、肌鈣蛋白以及氣味結(jié)合蛋白19前體等。中華蜜蜂與意大利蜜蜂性成熟處女蜂王體內(nèi)存在大量蛋白表達(dá)差異，這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)可能與兩蜂種蜜蜂行為生物學(xué)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：中華蜜蜂；意大利蜜蜂；蜂王；蛋白質(zhì)組

蜜蜂是一種資源共享、分工明確和相互交流的高度結(jié)構(gòu)化的社會(huì)昆蟲，并以3種級(jí)型存在，即蜂王、工蜂和雄蜂。蜂王和雄蜂是蜂群的繁育主體，雄蜂的主要職能是與處女蜂王交尾，保證蜂王能產(chǎn)雙倍體的受精卵。蜂王為蜂群的母體，承擔(dān)著繁育工作即產(chǎn)卵。為了提高蜜蜂種群適應(yīng)性及避免近親交配等，蜜蜂進(jìn)化出有效的競爭交配機(jī)制，即蜜蜂的婚飛。處女蜂王羽化出房，到達(dá)性成熟以及婚飛時(shí)，其體內(nèi)會(huì)發(fā)生明顯的生理變化[1-6]。中華蜜蜂和意大利蜜蜂是兩個(gè)獨(dú)立的蜂種，兩蜂種在繁殖、種群消長中存在明顯區(qū)別[7-8]。中華蜜蜂是我國的寶貴蜂種資源，但自1896年中國引進(jìn)西方蜜蜂100多年以來，西方蜜蜂已使中華蜜蜂分布區(qū)域縮小，種群數(shù)量急劇下降[9]。后來研究發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂蜂王自然交配受到意大利蜜蜂的干擾[10]，并推測處女蜂王婚飛交尾時(shí)，中華蜜蜂性成熟蜂王不僅會(huì)吸引中華蜜蜂的雄蜂來交尾，而且同時(shí)吸引大量西方蜜蜂的雄蜂，這樣西方蜜蜂雄蜂會(huì)嚴(yán)重干擾中蜂蜂王與中蜂雄蜂正常交配，從而使中蜂蜂王交尾成功率大幅度下降[11]，后來研究也發(fā)現(xiàn)，兩種蜂王性成熟期體表釋放的主要信息素含量存在差異[4]。蛋白質(zhì)組學(xué)是研究基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)，不同時(shí)期以及不同環(huán)境條件下表達(dá)的蛋白質(zhì)與其特定發(fā)育時(shí)期和生境條件的遺傳調(diào)控存在內(nèi)在關(guān)系[12]。本研究擬通過雙向電泳的方法，比較分析中華蜜蜂與意大利蜜蜂性成熟期蜂王蛋白質(zhì)組成的特征及差異，以期為深入研究蜂王干擾交尾機(jī)理提供一定理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試?yán)ハx

試驗(yàn)蜂群為江西農(nóng)業(yè)大學(xué)蜜蜂研究所飼養(yǎng)的中華蜜蜂(Apisceranacerana)和意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica)。其蜂群各含有1只同批次且交尾成功的蜂王。蜂群進(jìn)行自由采集。試驗(yàn)樣品的雙向電泳和質(zhì)譜鑒定試驗(yàn)在武漢市洪山區(qū)言行生物產(chǎn)品經(jīng)營部進(jìn)行。

1.2樣品采集

按照標(biāo)準(zhǔn)的人工育王方法分別在中華蜜蜂和意大利蜜蜂蜂群中進(jìn)行人工育王[13]，待處女蜂王出房后，囚入王籠并放入無王區(qū)。處女蜂王出房12 d后，分別采集性成熟的中華蜜蜂和意大利蜜蜂處女蜂王。為了避免蜂王腹部消化道食物對(duì)試驗(yàn)的影響，用解剖剪從蜂王側(cè)面解剖并剔除蜂王體內(nèi)的消化道，每只蜂王為一個(gè)樣品,將每組4個(gè)樣品送至雙向電泳與質(zhì)譜鑒定檢測實(shí)驗(yàn)室，放入-80 ℃冰箱保存。

1.3蛋白質(zhì)提取與雙向電泳

具體操作步驟參照參考文獻(xiàn)[14]。即采集樣品后，先進(jìn)行蛋白提取與純化，再進(jìn)行蛋白質(zhì)溶解與定量，最后進(jìn)行等電聚焦儀( 德國ETTAN IPGPHOR3)聚焦和雙向SDS-PAGE電泳(德國ETTAN DALTsix)。其中，第一向等電聚焦程序?yàn)椋篠1 stp 300V 0:20Hr；S2 stp 700V 0:30Hr；S3 stp 1 500V 1:30Hr；S4 grd 9 000V 3:00Hr；S5 stp 9 000V 4:00Hr。第二向電泳程序?yàn)椋篠1 2W/gel 45 min，S2 17W/gel 4 h。電泳結(jié)束后將膠體放入固定液中進(jìn)行固定，最后進(jìn)行G-250染色。

1.4圖譜掃描與質(zhì)譜鑒定

染色后的凝膠使用透射模式進(jìn)行掃描(ArtixScan M2)，掃描結(jié)果導(dǎo)入計(jì)算機(jī)，分析中華蜜蜂蜂王和意大利蜜蜂蜂王蛋白質(zhì)點(diǎn)信息。在此基礎(chǔ)上，利用凝膠差異斑點(diǎn)分析軟件(ArtixScan M2)比較分析中華蜜蜂與意大利蜜蜂差異表達(dá)蛋白(灰度比值大于2)，確認(rèn)分別在中華蜜蜂蜂王和意大利蜜蜂蜂王顯著高表達(dá)的蛋白點(diǎn)。另外，從中華蜜蜂蜂王和意大利蜜蜂蜂王凝膠中分別選擇10個(gè)和9個(gè)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。利用德國布魯克(Bruker Dalton)Ultraflex III TOF/TOF質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。UV波長為355 nm，重復(fù)速率為200 HZ，加速電壓為20 000 V，最優(yōu)質(zhì)量分辨率為1 500 Da。掃描質(zhì)量范圍為700～3 200 Da，收集信號(hào)。胰酶自切峰為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜儀。所有實(shí)驗(yàn)樣品的質(zhì)譜圖均以用默認(rèn)模式獲得。利用軟件flexAnalysis(Bruker Dalton)過濾基線峰、識(shí)別信號(hào)峰。利用BioTools(Bruker Dalton)軟件搜索NCBI數(shù)據(jù)庫，尋找匹配的相關(guān)蛋白質(zhì)，同時(shí)查詢其功能，來明確鑒定的蛋白質(zhì)為何種蛋白質(zhì)。

2試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1中華蜜蜂與意大利蜜蜂性成熟處女蜂王蛋白質(zhì)圖譜分析

將染色后的凝膠進(jìn)行掃描后導(dǎo)入計(jì)算機(jī)，結(jié)果如圖1所示。對(duì)圖譜進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂性成熟處女蜂王和意大利蜜蜂性成熟處女蜂王中分別有2 205、2 417個(gè)蛋白點(diǎn)，兩者之間存在168個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)。對(duì)這些差異蛋白點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)，在中華蜜蜂蜂王中高度表達(dá)的蛋白點(diǎn)有90個(gè)，其等電點(diǎn)介于4.27～6.62，分子量介于10.80～67.63 Kda(表1)；在意大利蜜蜂蜂王中高度表達(dá)的蛋白點(diǎn)有78個(gè)，其對(duì)應(yīng)的等電點(diǎn)介于4.21～6.70，分子量在10.44～91.84 Kda(表2)。另外，在中華蜜蜂蜂王和意大利蜜蜂蜂王中高表達(dá)蛋白比值為1 000 000的蛋白點(diǎn)分別有51、59個(gè)。

左：中華蜜蜂蜂王 queens of Apis cerana cerana；右：意大利蜜蜂蜂王 queens of Apis mellifera ligustica；圖中標(biāo)記的點(diǎn)為已鑒定的蛋白點(diǎn)The spots of Fig are the protein spots subjected to functional identification圖1　中華蜜蜂與意大利蜜蜂蜂王雙向電泳蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜Fig.1　Profile of the 2-DE analysis of queens between Apis mellifera ligustica and Apis cerana cerana

編號(hào)No比值Ratio等電點(diǎn)pI分子量MW編號(hào)No比值Ratio等電點(diǎn)pI分子量MW編號(hào)No比值Ratio等電點(diǎn)pI分子量MW編號(hào)No比值Ratio等電點(diǎn)pI分子量MW編號(hào)No比值Ratio等電點(diǎn)pI分子量MWG014.159814.9867629G192.67495.0939120G372.718285.4633638G5510000005.4823324G7310000005.6215337G0210000004.9866139G202.805385.0739090G3810000005.2832536G5610000005.9022435G7410000004.5415210G032.914846.1458804G213.989545.1739060G3910000005.3732639G573.286684.8021669G7510000004.5414893G043.512936.0658329G2210000005.0638465G4010000005.1832587G5810000005.5721311G7610000006.1014645G0510000005.2156583G232.046115.5738200G412.742226.1631122G5910000005.6521047G7710000004.5414576G0610000005.6253250G2410000005.5737763G426.980326.3630876G602.485264.3020502G7810000004.5414180G0710000005.5152200G2510000004.9137302G4310000006.2430389G6110000005.2720049G7910000005.2613680G0810000005.7551683G2610000006.0036903G4410000006.0629816G6210000004.7319882G8010000004.7613357G092.013355.5050791G2710000004.6536677G4510000006.3428250G6312.60046.6219690G813.657344.9613119G1010000005.7549543G282.003485.8436415G4634.46125.0527893G6426.0346.5618730G824.075574.9313057G114.618444.7647021G292.625635.2135607G4710000005.827194G652.550465.4318730G8312.81024.3512825G1210000004.5845980G302.428966.0735843G4810000005.6425888G662.516494.5318518G8410000004.3112521G1310000005.7043531G3110000005.7235788G492.257284.2725400G672.976465.8117991G8510000006.0012255G142.058645.7242779G3210000004.7135541G5010000006.1524965G686.451124.5217402G8610000005.1011030G152.821445.8142041G3310000005.3735541G512.373286.3324621G6910000004.5217067G8710000005.7511030G1610000004.8740906G346.306995.7935081G524.158655.6424349G704.051044.6316925G8810000006.2411004G174.633965.3939573G3510000005.9734668G532.716934.7824214G715.084624.9116303G8910000005.6710939G182.395454.8639361G362.537726.1634285G5410000005.1123715G7210000004.8815681G9010000005.7310796

表2　意大利蜜蜂性成熟處女蜂王上調(diào)表達(dá)蛋白質(zhì)

2.2中華蜜蜂與意大利蜜蜂性成熟處女蜂王蛋白質(zhì)質(zhì)譜鑒定

通過對(duì)差異蛋白質(zhì)進(jìn)行圖譜分析，選擇19個(gè)差異表達(dá)蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，其中10個(gè)蛋白在中華蜜蜂性成熟處女蜂王中高表達(dá)，其鑒定結(jié)果主要為副肌球蛋白、肌鈣蛋白T、ATP合成酶以及丙酮酸脫氫酶等。另外9個(gè)蛋白質(zhì)在意大利蜜蜂性成熟處女蜂王中高表達(dá)，主要為NADH輔酶Q氧化還原酶、保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶、肌鈣蛋白以及氣味結(jié)合蛋白19前體等(表3)。

3結(jié)論與討論

本研究旨在分析中華蜜蜂與意大利蜜蜂性成熟處女蜂王表達(dá)蛋白，以期了解兩蜂種蜂王蛋白質(zhì)組的差異。結(jié)果表明，中華蜜蜂和意大利蜜蜂性成熟處女蜂王中分別檢測到了2 205、2 417個(gè)蛋白點(diǎn)，但差異蛋白點(diǎn)只有168個(gè)，可能與蜂王性成熟期的蛋白點(diǎn)相對(duì)比較保守有關(guān)，也可能是因?yàn)橹腥A蜜蜂和意大利蜜蜂在蜜蜂屬中親緣關(guān)系最近的緣故。另外，也可能是因?yàn)閮烧弑磉_(dá)的差異蛋白點(diǎn)太少，導(dǎo)致兩種雄蜂很難辨別蜂王是中華蜜蜂蜂王還是意大利蜜蜂蜂王。對(duì)其顯著差異表達(dá)的蛋白進(jìn)行圖譜分析，結(jié)果顯示中華蜜蜂和意大利蜜蜂分別有90、78個(gè)上調(diào)表達(dá)蛋白。周天娥等[15]研究發(fā)現(xiàn)，中華蜜蜂雄蜂卵期表達(dá)的蛋白點(diǎn)也高于意大利蜜蜂，可能是這2種蜜蜂在長期進(jìn)化過程中形成了符合各自發(fā)育規(guī)律的蛋白表達(dá)模式。中華蜜蜂與意大利蜜蜂蜂王體內(nèi)含有比值為1 000 000的蛋白點(diǎn)數(shù)的蛋白51、59個(gè)，而且中華蜜蜂工蜂觸角和雄蜂觸角間的差異表達(dá)蛋白點(diǎn)大部分在意大利蜜蜂中高表達(dá)[16]，這也可能是因?yàn)閮煞浞N之間在嗅覺功能、能量代謝、分子運(yùn)輸?shù)确矫孢€是存在較大差異。

對(duì)中華蜜蜂性成熟處女蜂王中高表達(dá)的幾種蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定發(fā)現(xiàn)，ATP合成酶、副肌球蛋白、肌動(dòng)蛋白、丙酮酸脫氫酶以及蛋白酶體a亞基等在中華蜜蜂蜂王中高表達(dá)。副肌球蛋白是粗肌絲中含量最高的蛋白之一，它能幫助粗肌絲進(jìn)行組裝，并調(diào)節(jié)粗肌絲長度、直徑以及肌肉收縮。副肌球蛋白編碼基因的缺失，肌肉沒有收縮性。肌動(dòng)蛋白是微絲的結(jié)構(gòu)蛋白，也具有收縮功能[17]。ATP合成酶和丙酮酸脫氫酶均為調(diào)節(jié)、催化合成ATP的關(guān)鍵酶[18-19]。這兩種蛋白和酶在中華蜜蜂性成熟處女蜂王中高表達(dá)，可能與中華蜜蜂的特性有關(guān)，中華蜜蜂處女蜂王在巢房中活動(dòng)速度相對(duì)較快，其體內(nèi)的肌肉收縮、新陳代謝更加旺盛，從而需要這些蛋白和酶參與相應(yīng)的物理和化學(xué)反應(yīng)。

表3　已鑒定的19個(gè)蛋白點(diǎn)基本信息

蛋白酶體是一類具有水解蛋白功能的大分子復(fù)合物，在蛋白質(zhì)降解過程中起著重要作用。蛋白酶體含有幾種不同的a亞基和?亞基，其中a亞基為結(jié)構(gòu)性蛋白，而?亞基為功能性催化蛋白，兩者相輔相成，蛋白酶體?亞基基因表達(dá)隨機(jī)體新陳代謝、蛋白質(zhì)代謝活動(dòng)有關(guān)[20]。研究發(fā)現(xiàn)，蛋白酶體a亞基在中華蜜蜂蜂王體內(nèi)高表達(dá)，這可能與蜂王婚飛有關(guān)，中華蜜蜂處女蜂王在進(jìn)行婚飛時(shí)，其飛行速度比意大利蜜蜂快，持續(xù)時(shí)間可能比意大利蜜蜂長，在婚飛過程中需要產(chǎn)生大量的?亞基，因此，蜂王在婚飛前表達(dá)大量的a亞基，為婚飛時(shí)集合蛋白酶體?亞基奠定基礎(chǔ)。

研究還發(fā)現(xiàn)，NADH-輔酶Q氧化還原酶，肌鈣蛋白，保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶以及氣味結(jié)合蛋白等在意大利蜜蜂性成熟處女蜂王中高表達(dá)。NADH輔酶Q氧化還原酶是動(dòng)物和植物體內(nèi)呼吸鏈上參與傳遞電子的第一個(gè)功能酶，這些酶的表達(dá)會(huì)受外界環(huán)境、營養(yǎng)、殺螨劑等因素的影響，如昆蟲采集了具有抗性的食物后，其體內(nèi)的NADH輔酶Q氧化還原酶基因表達(dá)呈現(xiàn)明顯的上升趨勢[21]。意大利蜜蜂相對(duì)于中華蜜蜂，更容易感染螨蟲，而在日常飼養(yǎng)過程中，常常用螨撲等殺螨劑對(duì)意大利蜜蜂進(jìn)行殺螨處理，從而也導(dǎo)致蜂群體內(nèi)的NADH輔酶Q氧化還原酶基因表達(dá)上調(diào)。

保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶是保幼激素合成過程中最重要的調(diào)控酶，它通過將自身的甲基轉(zhuǎn)移到由法尼酸環(huán)氧化產(chǎn)生的保幼激素酸后形成保幼激素[22]。保幼激素是導(dǎo)致蜂王發(fā)育的主要內(nèi)源性信號(hào)，較高水平的保幼激素能阻止蜂王卵巢發(fā)生程序性細(xì)胞死亡，使卵巢得到充分發(fā)育，也能增加蜜蜂個(gè)體體重[23]。本研究發(fā)現(xiàn)，保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶在意大利蜜蜂蜂王中高表達(dá)，主要原因在于意大利蜜蜂處女蜂王個(gè)體、卵巢等比中華蜜蜂蜂王大，需要更多的保幼激素酸甲基轉(zhuǎn)移酶參與保幼激素的合成。

肌鈣蛋白是一類肌肉調(diào)節(jié)蛋白，與原肌球蛋白結(jié)合，直接參與鈣所控制的肌肉收縮，肌鈣蛋白T是抑制或激活肌凝蛋白活性所必須的[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，肌鈣蛋白T在意大利蜜蜂處女蜂王中高表達(dá)，可能與生殖系統(tǒng)發(fā)育有關(guān)。意大利蜜蜂蜂王產(chǎn)卵能力比中華蜜蜂更旺盛，而且意大利蜜蜂卵巢也比中華蜜蜂大，卵巢形成卵子以及與精子相結(jié)合時(shí)，需要肌鈣蛋白參與肌肉收縮，卵子和精子移動(dòng)與結(jié)合等。

蜜蜂氣味結(jié)合蛋白19的功能目前尚無報(bào)道，而且近期開展的蜜蜂相關(guān)轉(zhuǎn)錄組也未發(fā)現(xiàn)該蛋白基因在不同時(shí)期存在表達(dá)差異，可能是該蛋白功能相對(duì)比較保守。然而，本研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白在意大利蜜蜂性成熟處女蜂王中高表達(dá)，這可能與蜂種有關(guān)，也可能與蜂王婚飛有關(guān)，意大利蜜蜂蜂王能夠利用氣味結(jié)合蛋白19行使辨別雄蜂集聚區(qū)，也可能具有其它特殊功能，具體功能有待于進(jìn)一步研究與論證。

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Proteomic Comparison of Sexual Matured Queen between

ApisceranaceranaandApismelliferaligustica

WU Xiao-bo,WANG Zi-long,LI Shu-yun,YAN Wei-yu,ZENG Zhi-jiang*

(Honeybee Research Institute,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Abstract:This study aims to investigate the differentially expressed proteins of sexual matured queens betweenApisceranaceranaandApismelliferaligusticaby comparison of proteome profiles.Two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) was used to establish the proteomic maps of the two species of sexual matured queens.Part of differentially expressed proteins were identified by mass spectrometry and database search.The results showed that 2 205 and 2 417 proteins spots were detected respectively in the sexual matured queens ofApisceranaceranaandApismelliferaligustica,and 168 differentially expressed protein spots were found.90 proteins were significantly up-expressed in the sexual matured queens ofApisceranaceranawhile 78 proteins were significantly up-expressed in the sexual matured queens ofApismelliferaligustica.19 differentially expressed proteins were identified by mass spectrometry.The Paramyosin,Actin,ATP synthase and Pyruvate dehydrogenase were up-expressed in the queensApisceranacerana, while the NADH-ubiquinone oxidoreductase,Juvenile

hormone acid methyltransferase,Troponin T and Odorant binding protein 19 precursor were up-expressed in the queensApismelliferaligustica.A large number of proteins in queens betweenApisceranaceranaandApismelliferaligusticashowed expression changes,which might be related to the difference in behaviour biology of the two kinds of queens.

Key words:Apisceranacerana;Apismelliferaligustica;queen;proteome

作者簡介:吳小波(1983—),男,博士,主要從事養(yǎng)蜂學(xué)教學(xué)與研究工作,E-mail:wuxiaobo21@163.com;*通信作者:曾志將，教授，E-mail:bees1965@sina.com。

基金項(xiàng)目:國家蜂產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系資助項(xiàng)目(No.CARS-45-kxj12)、國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31060327)、江西省科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(20141BBF60033)和 江西省教育廳科技計(jì)劃項(xiàng)目(GJJ13280)

收稿日期：2015-03-06修回日期：2015-05-06

中圖分類號(hào)：S893.2；S893.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-2286(2015)06-1057-06

吳小波，王子龍，李淑云，等.中華蜜蜂與意大利蜜蜂性成熟處女蜂王蛋白質(zhì)組比較分析[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2015，37(6)：1057-1062.