馬銀花種子萌發(fā)期對干旱脅迫的生理響應(yīng)

李　暢，蘇家樂，劉曉青，何麗斯，陳尚平，肖　政

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京210014)

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馬銀花種子萌發(fā)期對干旱脅迫的生理響應(yīng)

李暢，蘇家樂*，劉曉青，何麗斯，陳尚平，肖政

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/江蘇省高效園藝作物遺傳改良重點實驗室，江蘇南京210014)

摘要：以馬銀花為材料，采用聚乙二醇(PEG-6000)模擬不同程度的干旱脅迫，觀測馬銀花種子發(fā)芽率、抗氧化酶活性、有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)、丙二醛(MDA)含量及細胞膜相對透性的變化，探討馬銀花種子萌發(fā)期對干旱脅迫的生理生化響應(yīng)機制。結(jié)果表明：(1)PEG脅迫濃度≥15%時，馬銀花種子萌發(fā)率顯著降低，種子萌發(fā)受抑制。(2)5%～20% PEG脅迫濃度范圍內(nèi)，隨著干旱脅迫程度的增加，超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)活性先升后降，均在15% PEG脅迫下達到最高；過氧化物酶(POD)活性持續(xù)升高。(3)與對照(CK)和輕度脅迫(5%、10% PEG)相比，15%～20% PEG脅迫下脯氨酸含量、可溶性糖含量、MDA含量和細胞膜相對透性均顯著升高。說明種子萌發(fā)期的馬銀花具有一定的耐旱性，可抵御輕度水分脅迫；15% PEG中度水分脅迫下馬銀花種子萌發(fā)受抑制，但可通過自身生理指標(biāo)的改變主動適應(yīng)干旱逆境。

關(guān)鍵詞：馬銀花；種子萌發(fā)期；干旱脅迫；生理響應(yīng)

干旱作為自然界最常見的逆境脅迫因素之一，影響植物的生存、生長和分布。植物對干旱脅迫的適應(yīng)和損傷程度與干旱脅迫的強度以及植物本身的抗性有關(guān)，并通過生理功能、生化代謝、形態(tài)適應(yīng)、生長發(fā)育等多種形式呈現(xiàn)，故研究不同干旱脅迫強度下植物生理生化機制具有重要意義[1-2]。種子萌發(fā)期是種子植物生活史中的關(guān)鍵階段，也是進行植物耐旱性研究的重要時期[3-4]。目前，有學(xué)者已在葉片形態(tài)[5-6]、光合特性[7-8]、細胞膜透性[6,9]、脂類過氧化[6,9-10]、抗氧化酶系統(tǒng)[6,9-10]等方面對杜鵑花屬少數(shù)種類耐旱性開展了有益探索，但未見馬銀花耐旱性研究報道，同時，前人對杜鵑花耐旱研究多以幼苗或成齡植株為試材，鮮見種子萌發(fā)期的耐旱性研究。

馬銀花(Rhododendronovatum)是杜鵑花科(Ericaceae)杜鵑花屬馬銀花亞屬(subgenusAzaleastrum)常綠灌木，我國特有種，主要分布于長江和珠江流域海拔1 000 m以下的灌叢中，花色雅，有淡香，具有較高的觀賞價值和藥用價值，研究開發(fā)前景廣闊[11-12]。種子繁殖是馬銀花最主要的引種繁殖方式[12-13]，而引種栽培過程中會受到諸多環(huán)境因素的影響，水分是極為重要的因子之一，故研究馬銀花種子萌發(fā)期的耐旱性尤為重要。本試驗采用聚乙二醇(PEG)模擬干旱脅迫狀況，觀測了干旱脅迫下馬銀花種子的發(fā)芽率、細胞膜透性、丙二醛、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和抗氧化酶的動態(tài)變化，以期在生理生化水平上探討其種子萌發(fā)期對干旱的響應(yīng)機制，為馬銀花的引種、開發(fā)利用及耐旱育種研究提供理論參考。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試的馬銀花種子采集于浙江天目山自然保護區(qū)野生植株，由浙江農(nóng)林大學(xué)鑒定提供，自然晾干，除去干癟空粒和雜質(zhì)，室溫干燥器內(nèi)保存。選取籽粒飽滿、大小均勻的種子用于試驗，種子凈度96%，長(1.199 ± 0.098 6) mm，寬(0.502 ± 0.055 3) mm，千粒質(zhì)量(0.071 9 ± 0.001 9) g，TTC法[14]測定種子活力為61%。

1.2種子脅迫處理

根據(jù)預(yù)備試驗，配置5%、10%、15%和20%的聚乙二醇(polyethylene glycol，PEG)-6000溶液模擬干旱脅迫，對應(yīng)的溶液水勢分別約為-0.05，-0.20，-0.40，-0.60 MPa[15]。

種子經(jīng)3 g/L KMnO4溶液浸種消毒15 min，去離子水充分洗凈，吸水紙吸干種子表面水分后，分別置于鋪有浸透上述PEG溶液濾紙的培養(yǎng)皿和搪瓷盤內(nèi)發(fā)芽，對照(CK)以去離子水代替。其中培養(yǎng)皿內(nèi)種子用于發(fā)芽率測定，搪瓷盤種子用于生理指標(biāo)測定。每個濃度梯度(包括CK)重復(fù)3次，培養(yǎng)皿每重復(fù)100粒種子，搪瓷盤每重復(fù)1 g種子。培養(yǎng)溫度25 ℃，光照強度120 μmol/(m2·s)，光照時間12 h/d。每天向濾紙加PEG-6000溶液數(shù)滴，以浸透濾紙并稍有剩余為度，每3 d更換1次濾紙，以減少水勢變動。

1.3測定指標(biāo)

1.3.1發(fā)芽率從種子置床之日開始，以胚根長度達種子長度的1/2為發(fā)芽標(biāo)準(zhǔn)，每24 h觀察記錄種子發(fā)芽數(shù)，連續(xù)5 d無萌發(fā)種子視為發(fā)芽結(jié)束。

發(fā)芽率(germination rate，GR)=種子發(fā)芽總數(shù)/供試種子總數(shù)(100粒)×100%

(1)

1.3.2生理指標(biāo)待發(fā)芽結(jié)束后，取每搪瓷盤中全部發(fā)芽種子的胚根進行生理指標(biāo)的測定。其中：丙二醛(MDA)含量的測定采用硫代巴比妥酸法[16]，細胞膜相對透性采用電導(dǎo)儀法[16]，游離脯氨酸含量測定采用酸性茚三酮法[16]，可溶性糖測定采用蒽酮比色法[16]。超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)活性采用試劑盒法，試劑盒由南京建成生物有限公司提供[17]。所需上清液均按李合生[16]的方法制備，按試劑盒說明書操作、比色，運用試劑盒提供的公式計算出SOD、POD、CAT活性。

1.4數(shù)據(jù)分析

所有測定結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，SPSS 18.0軟件進行單因素方差分析和相關(guān)性分析，使用最小顯著差數(shù)法(LSD)比較差異顯著性，Excel 2003下繪制圖并擬合回歸方程。

2結(jié)果與分析

2.1干旱脅迫對馬銀花發(fā)芽率的影響

如表1所示，5%～20% PEG濃度范圍內(nèi)，隨著PEG脅迫濃度的增加，馬銀花種子的發(fā)芽率呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢：5% PEG脅迫濃度下，發(fā)芽率高于CK，但與CK差異不顯著；PEG脅迫濃度≥10%時，種子發(fā)芽率下降；PEG脅迫濃度≥15%時，種子發(fā)芽率較CK顯著降低；20% PEG脅迫濃度下，馬銀花種子發(fā)芽率降低至CK的36.64%。進一步分析表明，發(fā)芽率與PEG脅迫濃度的Pearson相關(guān)系數(shù)達-0.866，負相關(guān)關(guān)系達到了極顯著水平；回歸擬合曲線y=0.005 8x3-0.325 7x2+ 2.503 2x+ 53.981(R2=0.993 2)。

表1　干旱脅迫對馬銀花種子發(fā)芽率的影響

同行數(shù)值后不同小寫字母表示差異達到0.05顯著水平。The different lowercase indicate significance at 0.05 level in the same row.

2.2干旱脅迫對馬銀花抗氧化酶活性的影響

如圖1所示，PEG干旱脅迫對萌發(fā)的馬銀花種子SOD、POD和CAT活性影響不盡相同。相同之處：5% PEG輕度干旱脅迫下，3種抗氧化酶活性均與CK差異不顯著。不同的是，在5%～20% PEG脅迫濃度范圍內(nèi)，隨著PEG脅迫濃度的升高，SOD和CAT活性均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢：10%～15% PEG脅迫下SOD和CAT活性顯著高于CK；15% PEG脅迫下SOD和CAT活性均升至最高，分別為CK的1.60倍和1.73倍；20% PEG脅迫下，SOD和CAT活性下降，但與CK差異不顯著。POD活性則隨PEG脅迫濃度的升高而呈上升趨勢：PEG脅迫濃度≥10%則較CK顯著升高，至20% PEG脅迫濃度下升至最高，為CK的3.21倍。

不同小寫字母表示差異達到0.05顯著水平。The different lowercase indicate significance at 0.05 level.圖1　干旱脅迫對SOD、POD和CAT活性的影響Fig.1　Effects of drought stress on SOD,POD and CAT activities

2.3干旱脅迫對馬銀花滲透調(diào)節(jié)能力的影響

脯氨酸和可溶性糖是植物體內(nèi)兩種重要的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，5%～20% PEG干旱脅迫下，萌發(fā)的馬銀花種子2種有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對干旱脅迫的響應(yīng)亦不盡相同(表2)。其中，脯氨酸含量在5% PEG脅迫下低于CK，但與CK差異不顯著；在10%～20% PEG脅迫濃度范圍內(nèi)，萌發(fā)的馬銀花種子的脯氨酸含量均顯著高于CK，且隨脅迫濃度的增加持續(xù)上升，處理間差異顯著，至20% PEG脅迫下達到最大值，為CK的2.64倍?？扇苄蕴呛縿t隨PEG脅迫濃度的增加呈先升高后降低的趨勢：15% PEG脅迫下，可溶性糖含量達到最高，為CK的1.97倍，與CK差異顯著；20% PEG脅迫可溶性糖含量降低，但仍顯著高于CK。

2.4干旱脅迫對馬銀花MDA含量和細胞膜相對透性的影響

2.4.1MDA含量如表2所示，5%～20% PEG脅迫濃度范圍內(nèi)，萌發(fā)的馬銀花種子的MDA含量隨PEG脅迫濃度的增加逐漸升高。PEG脅迫濃度≤10%時，MDA含量與CK不存在顯著差異；而當(dāng)PEG脅迫濃度≥15%，MDA含量較CK顯著增加；20% PEG脅迫下，MDA含量增加至對照的1.63倍。

2.4.2細胞膜相對透性由表2可知，不同PEG脅迫濃度處理對萌發(fā)的馬銀花種子的細胞膜相對透性產(chǎn)生不同程度的影響，且在5%～20% PEG脅迫濃度范圍內(nèi)，隨PEG脅迫濃度的增加，細胞膜相對透性呈逐漸增加的趨勢。其中，PEG脅迫濃度≤10%時，細胞膜相對透性與CK差異不顯著；15%～20% PEG脅迫濃度下，細胞膜相對透性分別較CK增加了37.13%和59.80%，顯著高于CK和其它處理。

表2　干旱脅迫下馬銀花脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量和細胞膜相對透性

同列數(shù)值后不同小寫字母表示差異達到0.05顯著水平。The different lowercase indicate significance at 0.05 level in the same column.

2.5發(fā)芽率與各生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

如表3所示，Pearson相關(guān)分析表明，PEG模擬干旱脅迫下，馬銀花種子發(fā)芽率與POD活性、脯氨酸含量、可溶性糖含量、MDA含量、細胞膜相對透性呈極顯著負相關(guān)；與SOD和CAT活性負相關(guān)程度未達到顯著水平。

表3　干旱脅迫下馬銀花種子發(fā)芽率與各生理指標(biāo)的Pearson 相關(guān)性分析

**表示極顯著相關(guān)。** Correlation is significant at the 0.01 level.

3討論

對于大多數(shù)植物而言，種子萌發(fā)和初期生長階段對環(huán)境脅迫最為敏感，所以常用種子萌發(fā)及其初期生長狀況進行植物抗逆性的評價[18]。在影響植物生長的諸多因素中，水分條件尤為重要，明確馬銀花耐旱性可有的放矢的指導(dǎo)引種栽培。本試驗通過對PEG-6000模擬干旱脅迫下馬銀花種子萌發(fā)及初期生長階段相關(guān)生理指標(biāo)的分析，初步了解了馬銀花種子萌發(fā)和初期生長階段的耐旱性。試驗表明，5%和10% PEG脅迫對馬銀花種子萌發(fā)影響不明顯，但隨PEG脅迫濃度的增加，馬銀花種子萌發(fā)受抑制程度加重，這與在脹果甘草[19]、紫云英[20]、鳳仙花[21]等的種子萌發(fā)規(guī)律相似。說明馬銀花種子萌發(fā)可忍耐輕度干旱脅迫(PEG濃度≤10%)，但在中度干旱脅迫(PEG濃度15%和20%)下則受抑制。

干旱可誘導(dǎo)活性氧離子如氧自由基、過氧化氫等的積累，引發(fā)膜脂過氧化自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)進程，使得其產(chǎn)物MDA含量增加，而植物體在長期進化過程中形成了包括SOD、POD和CAT在內(nèi)的抗氧化酶防御系統(tǒng)，可清除活性氧，防止膜脂過氧化[17]。本試驗中，干旱脅迫下，馬銀花種子SOD和CAT活性隨干旱脅迫程度的加深先升高后降低，POD活性一直升高，這與柯世省等[10]對云錦杜鵑的研究報道一致。表明這3種抗氧化酶可能對干旱脅迫和活性氧的響應(yīng)存在一定差異，亦反映了馬銀花種子在遭受干旱脅迫時各酶之間復(fù)雜的內(nèi)在關(guān)系和協(xié)同作用。在本試驗中，20% PEG脅迫濃度下，SOD和CAT活性下降，可能是有害物質(zhì)的積累超過了保護酶的清除能力，而POD活性的繼續(xù)升高則可能與POD具有雙重性作用，亦可在逆境或衰老后期表達，參與活性氧生成、葉綠素降解有關(guān)[9-10]。

MDA含量和細胞膜相對透性是植物抗性研究中常用的生理指標(biāo)，逆境傷害時，膜脂過氧化導(dǎo)致MDA積累，使核酸和蛋白質(zhì)變性，膜流動性降低，膜透性增大[9]。本試驗中，輕度干旱脅迫對萌發(fā)的馬銀花種子的MDA含量和細胞膜相對透性影響不明顯，但隨脅迫程度的加深，MDA含量和細胞膜相對透性顯著升高，尤其是20% PEG脅迫下，顯著高于其它處理，表明此時的馬銀花體內(nèi)活性氧代謝平衡失調(diào)，膜脂過氧化程度加劇，細胞膜損傷嚴(yán)重，這也可能是馬銀花在20% PEG濃度脅迫下SOD和CAT活性降低的原因之一。

滲透調(diào)節(jié)是植物響應(yīng)干旱脅迫的重要生理機制。干旱脅迫下，植物體內(nèi)會積累脯氨酸、可溶性糖等有機溶質(zhì)，降低植物細胞水勢，維持滲透平衡和體內(nèi)水分，以減輕或消除脅迫所造成的傷害。柯世省等[10]對云錦杜鵑、徐娟等[22]對興安杜鵑和迎紅杜鵑的研究表明，隨著水分脅迫程度加深，供試材料脯氨酸和可溶性糖含量增加。在本試驗中，5% PEG輕度干旱脅迫下，萌發(fā)的馬銀花種子脯氨酸含量變化平緩，但隨著脅迫程度的加深，脯氨酸含量不斷積累，與上述文獻的結(jié)論一致。而可溶性糖含量則隨著干旱脅迫程度加深呈現(xiàn)先上升后下降趨勢，但在供試濃度脅迫范圍內(nèi)(≤20% PEG)，其含量下降不明顯，與最大值(15% PEG脅迫下)差異不顯著。可見，在中度干旱脅迫(15%～20% PEG)下，馬銀花能夠積累較多的有機滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，維持正常的生理代謝以適應(yīng)逆境，進而維持其種子的萌發(fā)及生長。此外，在本試驗中，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)增加的相對幅度為脯氨酸>可溶性糖，這與白鵬等[17]對油菜的研究結(jié)果一致，但與黃承玲等[9]對露珠杜鵑和迷人杜鵑的研究結(jié)果有差異，可能是因為不同植物對干旱脅迫響應(yīng)機制不同所致，但是否與杜鵑花的生長時期不同有關(guān)尚有待進一步研究。

植物的抗旱性是一個受多因素影響的復(fù)雜數(shù)量性狀。本試驗從發(fā)芽率及多個生理指標(biāo)綜合分析了馬銀花種子萌發(fā)期的耐旱性，表明馬銀花種子萌發(fā)期可忍受輕度水分脅迫，15% PEG脅迫表現(xiàn)為一個閾值，之后隨著PEG脅迫濃度的增加，可溶性糖含量及SOD、CAT活性降低。說明馬銀花對輕度干旱及水勢為-0.40 MPa中度干旱(15% PEG)具有一定的適應(yīng)性。當(dāng)然，本試驗是在實驗室中保持其它環(huán)境因子一致的情況下進行的馬銀花種子萌發(fā)期模擬干旱脅迫研究，不能完全代表大田育苗的實際情況，馬銀花的引種栽培應(yīng)用尚需進一步進行大田出苗期的耐旱試驗驗證。

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Physiological Responses ofRhododendronovatumto

Drought Stress during Its Seed Germination Stage

LI Chang,SU Jia-le*,LIU Xiao-qing,HE Li-si,CHEN Shang-ping,XIAO Zheng

(Institute of Horticulture,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences/ Jiangsu Key Laboratory for Horticultural Crop Genetic Improvement,Jiangsu 210014,China)

Abstract:In order to study the physiological and biochemical response mechanism ofRhododendronovatumto drought stress during its seed germination stage,the dynamics of germination rate,antioxidant enzyme activities,organic osmoregulation substances,malondialdehyde (MDA) and relative permeability of cell membrane were analyzed under drought stress simulated by polyethylene glycol (PEG) -6000.The results showed that germination rate ofR.ovatumwas significantly decreased and inhibited when PEG stress concentration was ≥15%.At 5%-20% PEG stress concentration,SOD and CAT activities were increased when PEG was≤15% but decreased when PEG was> 15%,POD activity was continuously increased with the increase of drought stress degree.In comparison with no stress (CK) and light drought stress,the contents of proline,soluble sugar and MDA and relative permeability of cell membrane increased significantly.The results indicated that seed germination ofR.ovatumwas tolerant to drought in some degree under light water stress.The seed germination ofR.ovatumwas inhibited by moderate water stress (15% PEG),but the seeds could adapt to drought stress by changing their own physiological conditions.

Key words:Rhododendronovatum;seed germination stage;drought stress;physiological response

作者簡介：李暢(1982—)，女，助理研究員，碩士，主要從事花卉種質(zhì)資源與遺傳育種研究，E-mail：changli529@foxmail.com；*通信作者：蘇家樂，研究員，E-mail：sujl66@aliyun.com。

基金項目：國家“十二五”科技支撐計劃項目(2013BAD01B070403)、江蘇省自然科學(xué)基金項目(BK2012789)和江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新項目[CX(12)2016]

收稿日期：2015-03-17修回日期：2015-05-16

中圖分類號：S685.21

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1000-2286(2015)06-0994-05

李暢，蘇家樂，劉曉青，等.馬銀花種子萌發(fā)期對干旱脅迫的生理響應(yīng)[J].江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2015，37(6)：994-998.