基于口腔黏膜脫落細(xì)胞的CYP2C91075A/C 多態(tài)性流行病學(xué)研究

王 偉，童小文

(上海交大醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院 急診科，上海，200011)

華法林(Warfarin)是一種香豆素衍生物，主要是通過抑制細(xì)胞內(nèi)維生素K 環(huán)氧化還原酶的活性，阻止了Vit K 的循環(huán)利用，同時(shí)使得Vit K依賴性的凝血因子Ⅱ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ不能被有效激活，進(jìn)而起到抗凝作用，是目前神經(jīng)內(nèi)科和心內(nèi)科等臨床廣泛使用的一種口服抗凝藥物。其中S-華法林(左旋華法林)是臨床使用的消旋華法林的主要成分，目前也是人類對華法林的藥物代謝研究也集中于此型［1］。華法林主要經(jīng)細(xì)胞色素P4502C9(Cytochrome P450，CYP 2C9)代謝，在亞州和中國漢族人中主要以CYP 2C91075A＞C 突變最為多見。臨床［2－5］發(fā)現(xiàn)CYP 2C91075A＞C多態(tài)性突變與個(gè)體間華法林劑量差異化密切相關(guān)。因此明確CYP 2C91075A＞C 多態(tài)性突變對指導(dǎo)臨床用藥有非常重要的意義，本研究旨在進(jìn)一步探明CYP 2C91075A＞C 多態(tài)性在中國人群中的分布情況，為華法林藥物在臨床中合理規(guī)范使用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病例來源

上海交大醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院急診科門診及病房中隨機(jī)選擇需常規(guī)口服華法林藥物的江西漢族患者680例，其中男370例，女310例，年齡在40～68歲，平均57歲，所有入選患者簽知情同意書后納入研究。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

Rotor-Gene 6000 熒光PCR 儀(Corbett Life Science 公司，美國)，ABI 3730 xl 測序儀(ABI 公司，美國)，高保真PCR MIX(凡濟(jì)，上海)，DNA Marker 及口拭子DNA 提取試劑盒(凡濟(jì)，上海)，口拭子采樣拭子(凡濟(jì)，上海)。

1.3 樣本采集及DNA 提取

所有入選患者清水漱口后，用口拭子采樣拭子在兩頰內(nèi)側(cè)分別上下刮取15 次，采樣后置于試劑盒保存液后室溫保存，3 個(gè)月內(nèi)按照凡濟(jì)公司口拭子核酸抽提試劑盒說明書進(jìn)行DNA 提取，用紫外分光光度計(jì)對所提取的DNA 進(jìn)行定量和純度檢測，－20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 CYP 2C91075A＞C 突變檢測

1.4.1 PCR 引物設(shè)計(jì)與合成:F:序列5'-TGCACGAGGTCCAGAGATGC-3，產(chǎn)物長度131 bp;R:序列5'-AAACATGGAGTTGCAGTGTAG-3。

1.4.2 PCR 反應(yīng)體系:每個(gè)0.2 mL eppendorf 管中依次加入以下反應(yīng)液:2.5 μL 模板，10 μL 5×PCR 緩沖液(100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3，250 mmol/L KCl，50 mmol/L MgCl 25 mmol/L EDTA，5 mmol/L NAD+，0.5%(v/v)Triton X－100)，1 μL 熱啟動(dòng)酶，5 μL 引物混合液(每條引物濃度 為1 μL mol/ L)，5 μL 10 × Eva Green，26.5 μL 去離子水，總反應(yīng)體系為50 μL?；旌虾笤赗otor-gene 6000 定量PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性20 s，54 ℃30 s，72 ℃30 s，共30 個(gè)循環(huán)。

1.4.3 限制性內(nèi)切酶消化及電泳分型檢測:PCR 反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)2% 瓊脂糖凝膠電泳，Gold View 核酸染料染色檢測得到預(yù)期大小的片斷后，再進(jìn)行下一步酶切反應(yīng);酶切反應(yīng)體系30 μL，含PCR 產(chǎn)物10 μL，限制性內(nèi)切酶1.5 μL，10X 酶切緩沖液3 μL，混勻后置37 度消化4 h，用4%瓊脂糖凝膠電泳，Gold View 核酸染料染色后分析結(jié)果。

酶切結(jié)果判定:根據(jù)引物設(shè)計(jì)，PCR 產(chǎn)物大小應(yīng)為131 bp，如為野生型，則被切為110 bp 和21 bp 兩段，但由于21 bp 片段較小，在瓊脂糖檢測時(shí)難以顯示，所在當(dāng)采檢個(gè)體為野生型時(shí)純合子顯示110 bp 一條帶，如為突變純合子則只顯示131 bp 一條帶，雜合子則可顯示110 bp 和131 bp兩條帶。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用SPSS 13.0 軟件分析CYP 2C91075A＞C基因型及等位基因頻率分布情況。

2 結(jié)果

CYP2C9 基因只有AA(610例)和AC(70例)兩種基因型被發(fā)現(xiàn)，未見CC 型，分布頻率分別為89.71% 和10.29%，等位基 因A 的頻率 為94.85%，等位基因C 的頻率為5.15%。PCRRFLP 檢測結(jié)果示意圖見圖1。

圖1 PCR-RFLP 檢測結(jié)果示意圖

3 討論

近年來藥物遺傳學(xué)研究進(jìn)展迅速，人們已經(jīng)越來越認(rèn)識(shí)到藥物代謝的種族及個(gè)體差異性與藥物代謝相關(guān)基因的多態(tài)性關(guān)系密切。其中CYP2C9 作為細(xì)胞色素P450 酶家族中的重要成員，是肝微粒體中重要的藥物代謝相關(guān)酶，大量研究［3－5］表明CYP2C9 基因具有遺傳多態(tài)性。目前研究最多的有三種基因型，分別是野生型CYP2C9* 1，突變型CYP2C9* 2(430C＞T)和突變型CYP2C9* 3(1075A＞C)。近年來研究［3］表明，CYP2C9 多態(tài)性頻率存在明顯的人種差異性，總體來說白種人較黃種人和黑種人存在更高的突變率，且有些突變類型只存在于某個(gè)或某幾個(gè)人群中，在白種人和土耳其人群中2/3 的個(gè)體為野生型純合子，1/3 個(gè)體是* 2 或* 3 的雜合子，小于2.5%的個(gè)體是* 2* 2，* 2* 3 或* 3* 3 基因型的攜帶者;而在美國黑人和東亞人群中未發(fā)現(xiàn)CYP2C9* 2 等位基因［6］;在國內(nèi)除在新疆維吾爾族中檢測到CYP2C9* 2 等位基因(頻率為3%)以外，其他研究［7］中均未發(fā)現(xiàn)CYP2C9* 2的等位基因，因此本研究重點(diǎn)針對CYP2C9* 3 即1075A/C 進(jìn)行檢測，入選病例中未發(fā)現(xiàn)1075A＞C純合突變體，只檢出1075A 與C 雜合突變的患者70例，等位基因頻率為10.92%，略高于之前耿啟彬等2012年報(bào)道的廣東地區(qū)的7.9%［8］，但低于何震宇2006年報(bào)道的心臟瓣膜置換術(shù)后長期服用華法林病人的18.18%，這與之前得到的CYP2C9 突變存在人種差異的結(jié)論是一致的。

從口腔頰黏膜脫落細(xì)胞中獲取DNA 并進(jìn)行基因檢測有許多的優(yōu)勢:①無創(chuàng)性，可有效避免采血的痛苦，便于對小孩、老人或某此抗拒取血，如某些精神疾病患者等進(jìn)行基因樣本的采集;②簡便易行，只需口拭子和離心管即可;③可提供足量的DNA，即往報(bào)道的實(shí)驗(yàn)中單拭子得率可達(dá)0.5～5 μg，本實(shí)驗(yàn)中所采用的凡濟(jì)生物改進(jìn)后的單拭子得率可達(dá)5～15 μg［9］，可滿足基本上所有后續(xù)的基因?qū)W檢測;④可以較長時(shí)間的保存，加上保存液后可室溫放置3 個(gè)月仍能提取出完整的基因組。因此通過口拭子刮取口腔頰黏膜脫落細(xì)胞這種非侵入性方法來獲得DNA，能最大限度的減少被檢者的痛苦［10－11］。當(dāng)然，口拭子刮取口腔頰黏膜脫落細(xì)胞所得的DNA 不可避免的會(huì)有可能混有食物或是口腔內(nèi)細(xì)菌的污染，這些外來DNA 如果與所檢測基因有重疊或相似序列時(shí)，則可能會(huì)干擾檢測結(jié)果，隨著目前基因檢測技術(shù)敏感性和特異性的不斷提高，通過優(yōu)化引物可很好的解決外來DNA 的干擾問題。

本研究表明CYP2C91075A/C 等位基因在中國人群中有比較高的分布頻率，由于之前研究已經(jīng)表明攜帶有該突變的個(gè)體服用華法林時(shí)更易出現(xiàn)藥物毒副作用，因此臨床上在使用華法林藥物時(shí)應(yīng)進(jìn)行CYP2C9 基因分型檢測，有利于指導(dǎo)臨床合理使用華法林藥物，降低毒副作用的發(fā)生，對臨床個(gè)性化用藥具有一定的指導(dǎo)作用，而基于口腔黏膜脫落細(xì)胞這一無創(chuàng)采樣方式將有利于該項(xiàng)檢查的大范圍推廣實(shí)施。

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