膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者血漿miRNA表達(dá)譜研究

汪志強(qiáng)　王輝云　鄧美玲　吳少雄

作者單位:510060 廣州市中山大學(xué)腫瘤防治中心

?

·基礎(chǔ)研究·

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者血漿miRNA表達(dá)譜研究

汪志強(qiáng)王輝云鄧美玲吳少雄

作者單位:510060 廣州市中山大學(xué)腫瘤防治中心

【摘要】目的采用microRNA(miRNA) 基因芯片分析在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBM)患者血漿中表達(dá)的miRNA，尋找GBM血液中的分子生物學(xué)標(biāo)志物。方法分別收集22例GBM患者和8例健康志愿者血液標(biāo)本，試劑盒提取總RNA，與基因芯片進(jìn)行雜交，檢測(cè)GBM患者和健康志愿者血漿中miRNA表達(dá)譜，篩選差異表達(dá)的miRNA。采用Kaplan-Meier方法分析差異表達(dá)的miRNA與GBM生存期的關(guān)系。結(jié)果miRNA表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)在GBM差異表達(dá)的miRNA共19個(gè)，其中上調(diào)3個(gè)，下調(diào)16個(gè)。生存分析顯示，miR-30c-2-3p高表達(dá)組患者中位無疾病進(jìn)展時(shí)間較低表達(dá)組明顯縮短(P=0.016)。結(jié)論通過基因芯片的方法發(fā)現(xiàn)了在GBM患者血漿中19個(gè)差異表達(dá)的miRNA。miR-30c-2-3p的高表達(dá)與GBM的不良相關(guān)，可能是潛在的GBM預(yù)后預(yù)測(cè)分子標(biāo)記物。

【關(guān)鍵詞】膠質(zhì)母細(xì)胞瘤；血漿；微RNA；基因芯片

(ThePracticalJournalofCancer,2015,30:475～478)

近年來，顱內(nèi)膠質(zhì)瘤發(fā)病率逐年遞增。國(guó)內(nèi)報(bào)道膠質(zhì)瘤約占全部腦腫瘤的35%～60%[1]。其中，原發(fā)性惡性(WHO Ⅲ、Ⅳ級(jí))膠質(zhì)瘤占35%～60%，以膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma,GBM)最常見。GBM屬高度惡性腫瘤，生長(zhǎng)呈浸潤(rùn)性，無明顯邊界，手術(shù)難以徹底切除，預(yù)后很差。即使給予積極治療，50%的患者在診斷后1年內(nèi)死于腫瘤復(fù)發(fā)[2-4]。因此，找到能夠早期診斷、預(yù)測(cè)預(yù)后生物學(xué)標(biāo)記物尤為重要。

microRNA(miRNA)是1類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的小分子、單鏈非編碼RNA，在細(xì)胞代謝、分化、增殖和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。研究表明miRNA在惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。此外，miRNA在體液(血漿/血清等)中能穩(wěn)定的存在，而且部分體液miRNA具有腫瘤特異性和預(yù)后價(jià)值，使其可能成為潛在的非侵入性腫瘤標(biāo)志物[5]。早期在腦膠質(zhì)瘤的miRNA表達(dá)譜研究多基于組織學(xué)或細(xì)胞系展開的[6-7]，miRNA在血液或腦脊液的研究鮮有報(bào)道。本研究通過采用基因芯片的方法檢測(cè)在GBM患者血漿的miRNA，篩選差異表達(dá)的miRNA，尋找能夠早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的無創(chuàng)性分子生物學(xué)指標(biāo)，為進(jìn)一步探索GBM發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制提供線索。

1材料與方法

1.1病例與臨床資料的收集

收集中山大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院2010年10月-2014年3月收治的經(jīng)病理檢查確診的22例GBM患者和8例健康志愿者的靜脈血液標(biāo)本。GBM患者年齡29～76歲，平均50.7歲，其中男性8例,女性14例。健康志愿者年齡36～55歲，平均48歲，男性3例，女性5例；所有血液標(biāo)本均為EDTA抗凝管空腹采集，1～2 h內(nèi)離心分離獲得血漿轉(zhuǎn)入-80 ℃保存?zhèn)溆谩Ｋ谢颊吆椭驹刚呔炇鹬橥鈺?/p>

1.2RNA的提取

按照Norgen’s Plasma/Serum Circulating RNA Purification 試劑盒(Norgen Biotek公司)說明書步驟抽提血漿總RNA，Nanodrop ND-1000微量紫外分光光度計(jì)測(cè)定總RNA濃度。

1.3MiRNA芯片制備

根據(jù)miRNA數(shù)據(jù)庫(kù)18.0選取1 849個(gè)miRNA設(shè)計(jì)高靈敏高特異性互補(bǔ)靶RNA結(jié)合的探針，使用芯片點(diǎn)樣儀SmarArrayerTM136(CapitalBio公司)點(diǎn)制miRNA芯片。

1.4熒光標(biāo)記連接與芯片雜交

取0.3 μg總RNA，堿性磷酸酶去磷酸化，二甲基亞砜(DMSO)變性，T4 RNA連接酶標(biāo)記Dy 547(Dharmacon公司)。采用Micro Bio-Spin 6 column (BioRad公司)純化濾過并濃縮成粉，溶于雜交液中，加入微陣列中，46 ℃雜交過夜。

1.5清洗芯片、信號(hào)數(shù)字化處理

雜交結(jié)束后進(jìn)行芯片清洗。芯片甩干后用共聚焦激光掃描儀LuxScanTM10K(CapitalBio公司)進(jìn)行圖像掃描，應(yīng)用GenePix pro V6.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。

1.6隨訪時(shí)間

所有患者均接受隨訪，隨訪截止時(shí)間是2014年10月1日，中位隨訪時(shí)間是14個(gè)月(3～42個(gè)月)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

miRNA芯片數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，應(yīng)用Significance Analysis of Microarrays軟件和非配對(duì)t檢驗(yàn)分析GBM患者和健康志愿者血漿miRNA 表達(dá)差異，篩選差異表達(dá)在1.5倍以上和P<0.05的miRNA。將各差異表達(dá)miRNA芯片檢測(cè)的相對(duì)表達(dá)量中位數(shù)作為分界值，分別將患者分為低表達(dá)組和高表達(dá)組。采用Kaplan-Meier方法進(jìn)行生存分析，并采用Log-rank檢驗(yàn)比較兩組生存率。應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1MiRNA表達(dá)譜

與健康志愿者相比，GBM患者血漿中表達(dá)上調(diào)1.5倍以上的miRNA有3種，表達(dá)下調(diào)1.5倍以上的miRNA有16種， 兩組miRNA相對(duì)表達(dá)值見表1。

miRNA 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組(n=22)健康志愿者組(n=8)表達(dá)情況差異倍數(shù)Phsa-miR-30c-2-3p11.119±0.47710.597±0.182上調(diào)1.5020.015hsa-miR-319712.632±0.68711.849±0.798上調(diào)1.6640.025hsa-miR-451a13.247±0.94812.212±1.221上調(diào)1.8010.041hsa-miR-4760-3p10.639±0.24711.065±0.704下調(diào)0.6620.022hsa-miR-877-3p10.619±0.19711.110±0.598下調(diào)0.661<0.001hsa-miR-485-3p10.747±0.23011.295±0.501下調(diào)0.657<0.001hsa-miR-444911.093±0.21311.638±0.544下調(diào)0.652<0.001hsa-miR-142-3p11.016±0.23011.546±0.563下調(diào)0.649<0.001hsa-miR-427014.740±0.62215.467±0.488下調(diào)0.6300.013hsa-miR-5196-3p9.917±0.53410.666±0.206下調(diào)0.627<0.001hsa-miR-197-5p13.939±0.68714.760±0.310下調(diào)0.615<0.001hsa-miR-4667-5p13.405±0.63214.154±0.702下調(diào)0.5790.015hsa-miR-473011.273±0.66712.191±0.729下調(diào)0.528<0.001hsa-miR-3184-5p13.329±0.77214.254±0.736下調(diào)0.528<0.001hsa-miR-449c-5p12.644±2.31614.712±0.756下調(diào)0.5190.018hsa-miR-3689a-3p10.505±0.96211.435±1.220下調(diào)0.4770.031hsa-miR-1225-5p11.827±0.58012.965±0.480下調(diào)0.467<0.001hsa-miR-318012.418±0.80513.312±1.364下調(diào)0.4520.031hsa-miR-429811.317±0.59312.531±0.443下調(diào)0.448<0.001

2.2差異表達(dá)miRNA與GBM患者生存的關(guān)系

應(yīng)用Kaplan-Meier方法對(duì)22例GBM患者進(jìn)行生存分析。結(jié)果顯示：miR-30c-2-3p高表達(dá)組患者中位無疾病進(jìn)展時(shí)間(progression-free survival,PFS)為11.9個(gè)月，較低表達(dá)組患者(未達(dá)到)明顯縮短，兩組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Log-rank檢驗(yàn)：P=0.016)(圖1)，而中位總生存時(shí)間(overall survival,OS)的差異接近有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.073)。另有兩個(gè)差異性表達(dá)的miRNA(miR-4667-5p和miR-3180)的低表達(dá)組患者中位PFS和中位OS，較高表達(dá)組患者縮短，差異接近有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表2)。其余差異表達(dá)的miRNA未顯示出預(yù)后價(jià)值。

表2　部分差異表達(dá)miRNA與GBM患者生存的關(guān)系

圖1　miR-30c-2-3p表達(dá)與患者預(yù)后的關(guān)系

3討論

miRNA是1類內(nèi)源性的具有調(diào)控功能的小分子、單鏈非編碼RNA，在細(xì)胞代謝、分化、增殖和凋亡等生物學(xué)過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。 miRNA表達(dá)的組織特異性、腫瘤組織和瘤旁組織間差異表達(dá)及其調(diào)控機(jī)制是近年來研究的熱點(diǎn)，已成為腫瘤潛在分子生物標(biāo)志物。本研究利用循環(huán)miRNA穩(wěn)定的特點(diǎn)，通過高通量、涵蓋廣的miRNA芯片技術(shù)，分析發(fā)現(xiàn)了19個(gè)在GBM患者血漿中差異表達(dá)在1.5倍以上的miRNA，其中3個(gè)表達(dá)上調(diào)，16個(gè)表達(dá)下調(diào)。這些差異表達(dá)miRNA可能為早期診斷提供了非侵入性的篩選方法。此外，我們的研究發(fā)現(xiàn)miR-30c-2-3p高表達(dá)與GBM患者不良預(yù)后相關(guān)。

研究表明，miR-30家族(miR-30a、miR-30b和 miR-30c)不同表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞增殖和分化，以及藥物反應(yīng)性有關(guān)[8]。文獻(xiàn)報(bào)道m(xù)iR-30c的低表達(dá)在結(jié)直腸癌、膀胱癌、肺癌和腎癌等中具有預(yù)后價(jià)值[9-12]。Wang等[10]研究膀胱癌miRNA差異表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)miR-30c和miR-30e-5p下調(diào)。Heinzelmann等[11]研究發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌miR-30c的低表達(dá)與腫瘤侵襲能力和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)。但也有文獻(xiàn)報(bào)道與上述研究結(jié)果并不一致。在Shen等[13]的肝細(xì)胞癌患者血漿miRNA的研究中，發(fā)現(xiàn)miR-30c呈高表達(dá)。同樣在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)GBM患者血漿miR-30c-2-3p呈高表達(dá)，并且生存分析顯示miR-30c-2-3p高表達(dá)組患者生存期顯著短于低表達(dá)組。提示 miR-30c-2-3p可能可以作為早期診斷和預(yù)測(cè)預(yù)后的指標(biāo)，但仍需要進(jìn)一步研究驗(yàn)證。

此外，miR-451a也被發(fā)現(xiàn)在多種惡性腫瘤中有表達(dá)變化。miR-451a在結(jié)腸癌、肺癌、肝癌等組織或細(xì)胞系低表達(dá)[14-16]。同樣研究者有不同的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR-451a在腫瘤組織或細(xì)胞系高表達(dá)[17-19]。而在膠質(zhì)瘤組織學(xué)或細(xì)胞系的研究中，多數(shù)發(fā)現(xiàn)miR-451a呈低表達(dá)[20-22]。如Gal等[20]研究表明，miR-451在惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中低表達(dá)，并且發(fā)現(xiàn)miR-451聯(lián)合甲磺酸伊馬替尼能抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖和分化。miR-45l參與膠質(zhì)瘤細(xì)胞調(diào)解機(jī)制復(fù)雜，至今尚未明確的結(jié)論。在我們研究中，發(fā)現(xiàn)GBM患者血漿中miR-451a呈高表達(dá)，這可能與腫瘤細(xì)胞類型來源、分化程度等有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)的其他差異性表達(dá)的miRNA在國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)中鮮有報(bào)道。

總之,我們分析了GBM患者與健康志愿者血漿miRNA表達(dá)譜,發(fā)現(xiàn)了19個(gè)存在差異性表達(dá)的miRNA。并且miR-30c-2-3p的高表達(dá)與GBM的不良相關(guān)，可能是潛在的GBM預(yù)后預(yù)測(cè)分子標(biāo)記物。但本實(shí)驗(yàn)中樣本例數(shù)相對(duì)較少，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究和臨床驗(yàn)證。

參考文獻(xiàn)

[1]殷蔚伯，谷銑之主編.腫瘤放射治療學(xué)·中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤〔M〕.第3版.北京:中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社,2002:1018.

[2]Walker MD,Green SB,Byar DP,et al.Randomized comparisons of radiotherapy and nitrosoureas for the treatment of malignant glioma after surgery〔J〕.N Engl J Med,1980,303(23):1323-1329.

[3]Walker MD,Strike TA,Sheline GE,et al.An analysis of dose-effect relationship in the radiotherapy of malignant gliomas〔J〕.Int J Radiat Oncol Biol Phys,1979,5(10):1725-1731.

[4]Stupp R,Mason WP,van den Bent MJ,et al.Radiotherapy plus concomitant and adjuvant temozolomide for glioblastoma〔J〕.N Engl J Med,2005,352(10):987-996.

[5]Markou A,Sourvinou I,Vorkas PA,et al.Clinical evaluation of microRNA expression profiling in non small cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer,2013,81(3):88-96.

[6]Calin GA,Sevignani C,Dumitru CD,et al.Human microRNA genes are frequently located at fragile sites and genomic regions involved in cancers〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(9):2999-3004.

[7]Chan JA,Krichevsky AM,Kosik KS,et al.MicroRNA-21 is an antiapoptotic factor in human glioblastoma cells〔J〕.Cancer Res,2005,65(14):6029-6033.

[8]Hand NJ,Master ZR,Eauclaire SF,et al.The microRNA-30 family is required for vertebrate hepatobiliary development〔J〕.Gastroenterology,2009,136(3):1081-1090.

[9]Xi Y,Formentini A,Chien M,et al.Prognostic values of microRNAs in colorectal cancer〔J〕.Biomark Insights,2006,2:113-121.

[10]Wang G,Zhang H,He H,et al,Up-regulation of microRNA in bladder tumor tissue is not common〔J〕.Int Urol Nephrol,2010,42(1):95-102.

[11]Heinzelmann J,Henning B,Sanjmyatav J,et al.Specific m-

iRNA signatures are associated with metastasis and poor prognosis in clear cell renal cell carcinoma〔J〕.World J Urol,2011,29(3):367-373.

[12]Zhong K,Chen K,Han L,et al.MicroRNA-30b/c inhibits -

non-small cell lung cancer cell proliferation by targeting Rab18〔J〕.BMC Cancer,2014,14:703.

[13]Shen J,Wang A,Wang Q,et al.Exploration of genome-wide circulating microrna in hepatocellular carcinoma (HCC):miR-483-5p as a potential biomarker〔J〕.Cancer Epidemiol Biomarkers Prev,2013,22(12):2364-2373.

[14]Li HP,Zeng X C,Zhang B,et al.MiR-451a inhibits cell proliferation in human hepatocellular carcinoma through direct suppression of IKK-β〔J〕.Carcinogenesis,2013,34(11):2443-2451.

[15]Li HY,Zhang Y,Cai JH,et al.MicroRNA-451 Inhibits gro-

wth of human colorectal carcinoma cells via downregulation of Pi3k/Akt〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2013,14(6):3631-3134

[16]Markou A,Sourvinou I,Vorkas PA,et al.Clinical evaluation of microRNA expression profiling in non small cell lung cancer〔J〕.Lung Cancer,2013,81(3):88-96.

[17]謝海濤,莊俊華,黃憲章,等.結(jié)腸癌組織和癌旁組織miRNA表達(dá)譜研究〔J〕.腫瘤防治研究,2012,39(1):75-77.

[18]潘峰,聞洋,馬士杰,等.血漿miRNA表達(dá)譜與胰腺癌相關(guān)性的研究〔J〕.南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2012,32(11):1541-1544.

[19]Bandres E,Bitarte N,Arias F,et al.MicroRNA-451 regulates macrophage migration inhibitory factor production and proliferation of gastrointestinal cancer cells〔J〕.Clin Cancer Res,2009,15(7):2281-2290.

[20]Gal H,Pandi G,Kanner AA,et al.MIR-451and Imatinib -

mesylate inhibit tumor growth of glioblastoma stem cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2008,376(1):86-90.

[21]Tian Y,Nan Y,Han L,et al.MicroRNA miR-451 downreg-

ulates thePI3K/AKT pathway through CAB39 in human glioma〔J〕.Int J Oncol,2012,40(4):1105-1112.

[22]Nan Y,Han L,Zhang A,et al.MiRNA-451 plays a role as tumor suppressor in human glioma cells〔J〕.Brain Res,2010,1359(9):14-21.

(編輯：吳小紅)

Plasma MicroRNA Expression Profiles in Glioblastoma

WANGZhiqiang,WANGHuiyun,DENGMeiling,etal.SunYat-senUniversityCancerCenter,Guangzhou,510060

【Abstract】ObjectiveTo investigate the expression profiles of microRNA(miRNA) in glioblastoma (GBM) by microarray technique and explore the potential molecular biomarker for GBM.MethodsPlasmas were obtained from 22 cases of GBM and 8 cases of healthy volunteers.Total RNA was extracted by RNA extraction kit and hybridized with miRNA microarrays.The miRNA expression profiles of GBM and healthy volunteers were analyzed and differential miRNA expression was determined.The correlation between differential miRNAs expression and survival was analysed by Kaplan-Meier method.ResultsMiRNA expression profiling was analyzed.19 miRNAs were identified to be deferentially expressed,in which 3 were overexpressed and 16 were underexpressed in GBM.Kaplan-Meier analysis showed that high expression of miR-30c-2-3p was closely associated with a shorter progression-free survival time (P=0.016).Conclusion19 deferentially expressed miRNAs are detected in GBM by microarray method.High expression of miR-30c-2-3p is associated with poor prognosis of patients with GBM.MiR-30c-2-3p may serve as a potential molecular prognosis marker.

【Key words】Glioblastoma;Plasma;MicroRNA;microarray

(收稿日期2015-01-01修回日期 2015-03-10)

中圖分類號(hào)：R739.91

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1001-5930(2015)04-0475-04

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.04.001

通訊作者：吳少雄