HPLC法測(cè)定泊馬度胺原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

張笑雨，高愛(ài)偉，楊 浩，丁 黎中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 0009；南京卡文迪許生物工程技術(shù)有限公司，南京 0046

HPLC法測(cè)定泊馬度胺原料藥中的有關(guān)物質(zhì)

張笑雨1，2，高愛(ài)偉2，楊 浩2，丁 黎1*
1中國(guó)藥科大學(xué)藥物分析教研室，南京 210009；2南京卡文迪許生物工程技術(shù)有限公司，南京 210046

目的：建立泊馬度胺有關(guān)物質(zhì)的HPLC測(cè)定方法。方法：采用Inertsil ODS-3V柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對(duì)降解雜質(zhì)和工藝雜質(zhì)進(jìn)行定量分析；以辛烷磺酸鈉緩沖液-乙腈（90∶10，A）與乙腈-甲醇（50∶50，B）為流動(dòng)相，梯度洗脫；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。結(jié)果：在選定的色譜條件下泊馬度胺與各雜質(zhì)分離良好，6個(gè)雜質(zhì)平均回收率均在83.4%至100.8%之間。結(jié)論：本法選擇性高、重現(xiàn)性好，可作為泊馬度胺質(zhì)量控制的方法。

HPLC法；泊馬度胺；有關(guān)物質(zhì)

泊馬度胺（Pomalidomide）是一種免疫調(diào)節(jié)抗腫瘤藥[1]，分子式為C13H11N3O4（結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1），分子量為273.24。泊馬度胺膠囊（Pomalyst誖）由美國(guó)賽爾基因公司（Celgene Corporation）研制，于2013年2月8日，經(jīng)美國(guó)FDA通過(guò)快速審批程序批準(zhǔn)上市，用于治療先前至少接受過(guò)包括來(lái)那度胺和硼替佐米在內(nèi)的兩種藥物治療的骨髓瘤患者（患者已對(duì)兩藥沒(méi)有響應(yīng)，并在60天的治療期內(nèi)病情發(fā)展和難以治療）[2]。泊馬度胺的規(guī)格為1、2、3、4 mg；并在美國(guó)獲得了罕用藥資格。2013年8月5日，經(jīng)歐洲藥品管理局審批在歐洲上市。

目前泊馬度胺原料及制劑未在國(guó)內(nèi)上市。根據(jù)本科研項(xiàng)目——合成泊馬度胺，在詳細(xì)研究起始物料的基礎(chǔ)雜質(zhì)、過(guò)程雜質(zhì)（含歧化反應(yīng)雜質(zhì)）以及降解雜質(zhì)的基礎(chǔ)上，建立測(cè)定泊馬度胺的有關(guān)物質(zhì)方法，可以全面地控制該原料中的有關(guān)物質(zhì)。

1 儀器與試藥

美國(guó)Agilent公司1100型高效液相色譜儀，含DAD檢測(cè)器，ChemStation色譜工作站（瑞士Mettler Toledo公司）；135-S電子分析天平。

泊馬度胺對(duì)照品（南京卡文迪許生物工程技術(shù)有限公司自制，批號(hào)：13050101，純度：99.54%）；泊馬度胺（南京卡文迪許生物工程技術(shù)有限公司，含量98%，批號(hào)：130501、130502、130503）。雜質(zhì)對(duì)照品IMP01（純度：99.31%，批號(hào)：12100101）；IMP02（純度：99.69%，批號(hào)：12100101）；IMP03（純度99.31%，批號(hào)；130301）；IMP04（純度：90.77%，批號(hào)：130301）；IMP05（純度：98.59%，批號(hào)：130201）；IMP06（純度96.16%，批號(hào)：130201）均由南京卡文迪許生物工程有限公司提供。甲醇、乙腈均為色譜純；其余試劑為分析純。泊馬度胺及各雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1。

圖1 泊馬度胺、雜質(zhì)結(jié)構(gòu)式

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測(cè)波長(zhǎng)：215 nm；柱溫：25℃；自動(dòng)進(jìn)樣器溫度：4℃；流速：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：20 μL；流動(dòng)相：流動(dòng)相A為辛烷磺酸鈉緩沖液（取辛烷磺酸鈉1.08 g，磷酸0.5 mL，用水稀釋至1000 mL，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至3.0）-乙腈（90∶10），流動(dòng)相B為乙腈-甲醇（50∶50），進(jìn)行梯度洗脫。洗脫梯度見(jiàn)表1。

2.2 有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法

取本品，精密稱定，加40%乙腈水溶液溶解并稀釋成每1 mL中含泊馬度胺0.2 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液適量，用40%乙腈水溶液稀釋制成每1 mL中含泊馬度胺2 μg的溶液，作為主成分自身對(duì)照溶液。

照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，取對(duì)照溶液20 μL注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)儀器靈敏度，使主成分色譜峰的峰高約為滿量程的10%～25%，再精密量取供試品溶液和對(duì)照溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。供試品溶液色譜圖中，扣除溶劑峰及梯度峰后，如顯雜質(zhì)峰，除 IMP01、IMP02、IMP03、IMP04、IMP05、IMP06按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算，其余雜質(zhì)峰，按主成分自身對(duì)照法以峰面積計(jì)算，即得。

表1 有關(guān)物質(zhì)流動(dòng)相洗脫梯度

2.3 專屬性試驗(yàn)

2.3.1 與已知雜質(zhì)分離情況 取泊馬度胺及IMP01、IMP02、IMP03、IMP04、IMP05、IMP06適量，精密稱定，加40%乙腈水溶液稀釋制成每1 mL中含泊馬度胺200 μg、各雜質(zhì)2 μg的混合溶液，進(jìn)樣。見(jiàn)圖2。結(jié)果表明，在“2.1”色譜條件下泊馬度胺主峰與雜質(zhì)間、雜質(zhì)峰之間分離情況理想，雜質(zhì)間的分離度均大于1.5。

圖2 有關(guān)物質(zhì)分離度試驗(yàn)色譜圖

2.3.2 與未知雜質(zhì)分離情況 另取本品 （批號(hào)130501）約20 mg，分別經(jīng)酸（5 mL，0.5 mol·mL-1稀鹽酸溶液，室溫放置30 min，中和）、堿（5 mL，0.01 mol·mL-1氫氧化鈉溶液，室溫放置10 min，中和）、氧化（5 mL，30%H2O2，室溫放置2 h）、水浴（80℃，2 h）、光照（4500 lx，5天）等條件強(qiáng)制降解破壞，以上樣品用40%乙腈水溶液溶解并稀釋至100 mL，再稀釋1倍。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定上述溶液，見(jiàn)圖3。由圖3可見(jiàn)主峰與雜質(zhì)峰分離良好。

上述條件下，各雜質(zhì)峰與主峰均能良好分離，主峰純度高，純度因子均大于999.0。說(shuō)明此方法專屬性好，能夠有效檢測(cè)樣品中的雜質(zhì)與降解產(chǎn)物，且降解回收率在94%～103%，回收率符合要求。

2.4 檢測(cè)限和定量限

取泊馬度胺對(duì)照品和各雜質(zhì)對(duì)照品適量，分別配成每1 mL中含0.2 mg的溶液，分別吸取溶液適量，用40%乙腈水溶液逐級(jí)稀釋，進(jìn)樣分析，按信噪比S/N=3計(jì)算檢測(cè)限，按信噪比S/N=10計(jì)算定量限，泊馬度胺 （PMDA）和雜質(zhì)IMP01、IMP02、IMP03、IMP04、IMP05、IMP06的檢測(cè)限與定量限見(jiàn)表2。

圖3 破壞試驗(yàn)的HPLC圖

表2 泊馬度胺檢測(cè)限與定量限（ng）

2.5 雜質(zhì)的線性與范圍

取IMP01、IMP02、IMP03、IMP04、IMP05、IMP06樣品適量，精密稱定，加40%乙腈水溶液溶解，并稀釋制成0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg·mL-1系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件，分別精密量取20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度C（μg·mL-1）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程和相關(guān)系數(shù)。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.6 準(zhǔn)確度試驗(yàn)

取泊馬度胺對(duì)照品配制成0.2 mg·mL-1的溶液，進(jìn)行分析測(cè)定樣品中已知雜質(zhì)的含量。分別稱取雜質(zhì)IMP01、IMP02、IMP03、IMP04、IMP05、IMP06配制成4 μg·mL-1的溶液作為雜質(zhì)儲(chǔ)備液，各配制3份。精密稱取泊馬度胺樣品9份，精密移取各雜質(zhì)儲(chǔ)備液，得到相當(dāng)于雜質(zhì)限量濃度80%、100%、200%的溶液 （每個(gè)濃度對(duì)應(yīng)3份雜質(zhì)儲(chǔ)備液），照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算各雜質(zhì)的測(cè)得量，根據(jù)測(cè)得量和加入量計(jì)算回收率。IMP01、IMP02、IMP03、IMP04、IMP05、IMP06平均回 收率 分別為 83.36%、100.31%、98.09%、100.77%、99.76%、98.65%，RSD分別為 1.89%、1.55%、1.44%、1.65%、0.99%、1.28%。

表3 各雜質(zhì)的回歸方程和相關(guān)系數(shù)（n=6）

2.7 進(jìn)樣精密度

取泊馬度胺對(duì)照品適量制成濃度為2 μg·mL-1的溶液，照“2.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，RSD值為0.30%。

2.8 溶液穩(wěn)定性

取“2.7”中的樣品，置于4℃，分別于0、1.25、2.5、5、10、15、20、25 h照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄峰面積，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)，RSD為0.29%。

2.9 樣品測(cè)定結(jié)果

照以上方法測(cè)定3批樣品，已知的6種雜質(zhì)中檢出IMP05存在于130502批與130503批中，結(jié)果見(jiàn)表4。

3 討 論

3.1 流動(dòng)相的篩選

雜質(zhì)IMP02在普通色譜系統(tǒng)中難保留，故選擇加入離子對(duì)試劑（辛烷磺酸鈉），改善其保留效果，從而達(dá)到更好的分離。辛烷磺酸鈉考察兩種濃度，采用0.01 mol·L-1時(shí)，峰形較寬，IMP02有拖尾峰、肩峰；采用0.005 mol·L-1時(shí)峰形變窄。又考察了不同pH，發(fā)現(xiàn)pH對(duì)各物質(zhì)出峰時(shí)間有影響，且pH越低峰形越好，但pH低于3.0時(shí)IMP01、IMP02、IMP06的分離度不好，故選擇pH為3.0。

表4 泊馬度胺3批樣品雜質(zhì)檢測(cè)結(jié)果

3.2 進(jìn)樣器溫度的選擇

由于樣品溶液在常溫下不穩(wěn)定，經(jīng)過(guò)試驗(yàn)后將其置于4℃的自動(dòng)進(jìn)樣器中。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

IMP01、IMP02、IMP04為末端吸收，IMP03在227 nm處有最大吸收，IMP05在215 nm處有最大吸收，IMP06在228 nm處有最大吸收。泊馬度胺在226 nm處有最大吸收。為了確保雜質(zhì)能夠檢出，綜合考慮本品在215 nm處雜質(zhì)檢出最佳，降解試驗(yàn)回收率符合要求，梯度基線干擾較小，適合有關(guān)物質(zhì)檢測(cè)。

經(jīng)過(guò)方法學(xué)驗(yàn)證，此高效液相色譜法選擇性高、重現(xiàn)性好，可作為泊馬度胺質(zhì)量控制的方法。

[1] LacyMQ,McCurdyAR.Pomalidomide [J].Blood, 2013,122(14):2305-9.

[2] U.S.Food and Drug Administration.FDA NEWS RE-LEASE:FDA approves Pomalyst for advanced multiple myeloma[EB/OL].(2013-02-08)[2014-09-30].http:// www.fda.gov/NewsEvents/Newsroom/PressAnnouncements/ ucm338895.htm.

Determination of the Related Substances of Pomalidomide by HPLC

ZHANG Xiao-yu1,GAO Ai-wei2,YANG Hao2,DING Li1*
1DepartmentofPharmaceuticalAnalysis,China PharmaceuticalUniversity,Nanjing 210009;2Nanjing Cavendish Bio-engineering Technology Co.,Ltd.,Nanjing 210046

Objective:To establish an HPLC method for the determination of pomalidomide and its related substances.Methods:The test for degradation and process impurities was based on an Inertsil ODS-3V(250 mm×4.6 mm,5 μm)column;Mobile phase consisted of octane sulfonic acid sodium buffer solution-methanol acetonitrile for gradient elution;The detection wavelength was set at 215 nm.Results:Related substances were completely separated from the main constituent.The recoveries were from 83.4%to 100.8%.Conclusion:This highly selective and reproducible HPLC method offers an option in the quality control of pomalidomide.

HPLC;Pomalidomide;Related substances

R927.11

A

1673-7806（2015）02-153-03

張笑雨，女，碩士生 E-mail:cpuzxy@126.com

*通訊作者丁黎，男，博士生導(dǎo)師，教授 E-mail:dinglidl@hotmail.com

2014-12-03

2014-12-27