熱毒寧注射液與兩種常用溶媒配伍后9種成分穩(wěn)定性研究*

李 淼，王永香，孟 瑾，王仁杰，畢宇安，王振中，蕭 偉**

1江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港 222001；2中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222001

熱毒寧注射液與兩種常用溶媒配伍后9種成分穩(wěn)定性研究*

李 淼1，2，王永香1，2，孟 瑾1，2，王仁杰1，2，畢宇安1，2，王振中1，2，蕭 偉1，2**

1江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，連云港 222001；2中藥制藥過(guò)程新技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，連云港 222001

目的：考察熱毒寧注射液與兩種常用溶媒配伍后制劑中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C等9種成分的穩(wěn)定性，為臨床用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：將熱毒寧注射液分別與5%葡萄糖注射液和0.9%氯化鈉注射液按50∶250的比例配伍，考察0～6 h內(nèi)配伍藥液中9種成分含量變化情況。結(jié)果與結(jié)論：熱毒寧注射液與5%葡萄糖注射液或0.9%氯化鈉注射液配伍6 h內(nèi)，其中9種成分均穩(wěn)定。

熱毒寧注射液；配伍；穩(wěn)定性；綠原酸；梔子苷；斷氧化馬錢子苷；高效液相色譜法

熱毒寧注射液為江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司自主研發(fā)的中藥注射劑，其處方由金銀花、青蒿、梔子三味藥材組成[1]。本品具有清熱、疏風(fēng)、解毒之功效，用于外感風(fēng)熱所致感冒、咳嗽，癥見高熱、微惡風(fēng)寒、頭痛身痛、咳嗽痰黃；上呼吸道感染、急性支氣管炎見上述癥候者。關(guān)于熱毒寧注射液配伍方面研究的文獻(xiàn)較多[2]，但對(duì)于其配伍過(guò)程中有效成分穩(wěn)定性情況研究較少。有研究表明金銀花中的有機(jī)酸類成分[3]及梔子中的環(huán)烯醚萜苷類成分[4]均為有效成分，所以本實(shí)驗(yàn)將熱毒寧注射液按一定比例分別與5%葡萄糖注射液和0.9%氯化鈉注射液配伍使用，研究其中綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、咖啡酸、斷氧化馬錢子苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C 9種成分的穩(wěn)定性，為臨床合理使用該藥提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀Agilent 1100（美國(guó)安捷倫公司，包括自動(dòng)進(jìn)樣器，二元泵，DAD紫外檢測(cè)器）；BP 211D電子分析天平 （德國(guó)賽多利斯公司0.01 mg）；MILLIPORE超純水機(jī)。

熱毒寧注射液 （江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)：110705，110706，110713，110715）。綠原酸、咖啡酸、梔子苷對(duì)照品均購(gòu)置于中國(guó)藥品生物制品檢定研究院，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)分別為110753-200413，110885-200102，110749-200714；異綠原酸B（批號(hào)：071130）、異綠原酸A（批號(hào)：A0025）、異綠原酸C（批號(hào)：MUST-09041001）、新綠原酸（批號(hào)：MUST-10091501）、隱綠原酸（批號(hào)：905997）對(duì)照品由成都曼思特生物科技有限公司提供，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；斷氧化馬錢子苷對(duì)照品為自制（色譜法檢測(cè)純度在98%以上，面積歸一化）。0.9%氯化鈉注射液（批號(hào)110727701）、5%葡萄糖注射液（批號(hào)110614701）為辰欣藥業(yè)股份有限公司產(chǎn)品；甲醇為色譜純；磷酸為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Phenomenex Luna 5u C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：237 nm、324 nm；體積流量：1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。流動(dòng)相為甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液 （B），梯度洗脫程序：0～20 min，12%～30%A；20～60 min，30%～50%A[3]。

2.2 溶液的配制與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)

2.2.1 混合對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C對(duì)照品 16.79、5.90、5.26、13.85、4.88、4.58、8.46、4.64、7.03 mg用50%甲醇溶解制成質(zhì)量濃度分別為839.50、295.00、263.00、692.50、244.00、229.00、423.00、232.00、351.50 μg·mL-1的對(duì)照品混合溶液，0.22 μm微孔濾膜（有機(jī)膜）濾過(guò)，冷藏備用。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取熱毒寧注射液與5%葡萄糖注射液（或0.9%氯化鈉注射液）以50∶250比例混合的溶液2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加入50%甲醇溶液稀釋至刻度搖勻，0.22 μm微孔濾膜（有機(jī)膜）濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.2.3 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 取對(duì)照品混合溶液、供試品溶液進(jìn)樣檢測(cè)，見圖1。綠原酸、新綠原酸、咖啡酸、隱綠原酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷、異綠原酸A、異綠原酸B、異綠原酸C相鄰色譜峰的分離度均在1.5以上，拖尾因子均在1.00至1.10之間，理論塔板數(shù)以各色譜峰計(jì)均在10000以上。

圖1 混合對(duì)照品和供試品溶液的HPLC色譜

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取綠原酸等9種對(duì)照品混合溶液0.1、0.2、0.4、1.0、2.0、4.0、10.0 mL，分別置于10mL量瓶中，加50%甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，再分別按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測(cè)，記錄峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，縱坐標(biāo)Y為對(duì)照品的峰面積、橫坐標(biāo)X（μg·mL-1）為質(zhì)量濃度，得線性方程：

新綠原酸Y=29.6594X-10.5519（r2=0.9999）；

綠原酸Y=29.39X+11.52（r2=1.0000）；

隱綠原酸Y=30.8598X-9.6342（r2=0.9999）；

咖啡酸Y=54.33X-12.60（r2=1.0000）；

梔子苷Y=14.3229X-4.7754（r2=0.9999）；

斷氧化馬錢子苷Y=14.8257X-2.4655（r2=0.9999）；

異綠原酸B Y=31.9671X-34.2703（r2=0.9999）；

異綠原酸A Y=34.7999X-29.4002（r2=0.9999）；

異綠原酸C Y=35.5031X-46.2478（r2=0.9999）。

結(jié)果表明，新綠原酸在2.95～295.00 μg·mL-1，綠原酸在8.40～839.50 μg·mL-1，隱綠原酸在2.63～263.00 μg·mL-1，咖啡酸在2.29～229.00 μg·mL-1，梔子苷在6.93～692.50μg·mL-1，斷氧化馬錢子苷在2.44～244.00 μg·mL-1，異綠原酸B在4.23～423.00 μg·mL-1，異綠原酸A在2.32～232.00 μg·mL-1，異綠原酸C在3.52～351.50 μg·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.2 進(jìn)樣精密度試驗(yàn) 精密量取綠原酸等9種成分對(duì)照品的混合溶液，按照“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積均為10 μL，以對(duì)照品峰面積進(jìn)行計(jì)算，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C峰面積的RSD分別為0.19%、0.28%、0.35%、0.31%、0.12%、0.47%、0.18%、0.69%、0.26%，表明該儀器的精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、12、24 h注入液相色譜儀，記錄9種成分的峰面積值。結(jié)果新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、峰面積的RSD分別為：1.2%、1.4%、1.3%、1.5%、1.0%、1.4%、1.0%、1.6%、1.2%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.2.2”項(xiàng)下方法，取熱毒寧注射液樣品（批號(hào)：110705）與5%葡萄糖注射液按照50∶250混合后的溶液，制備6份供試品溶液，進(jìn)行樣品分析，計(jì)算綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、梔子苷、斷氧化馬錢子苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C等的平均含量（n=6）分別為6.01、2.09、2.86、0.12、11.07、2.09、0.60、0.27、0.45 g·L-1，RSD分別為 0.73%、0.81%、0.95%、1.02%、0.35%、0.91%、0.85%、0.51%、1.10%（n=6）。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取熱毒寧注射液（批號(hào)：110705）與5%葡萄糖注射液以50∶250混合的溶液（新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、梔子苷含量分別為：0.348、1.002、0.477、0.020、0.100、0.045、0.075、0.348、1.845 g·L-1）6份，每份1.0 mL，分別精密添加含新綠原酸0.346 g·L-1、綠原酸1.010 g·L-1、隱綠原酸0.450 g·L-1、咖啡酸0.025 g·L-1、異綠原酸B 0.105 g·L-1、異綠原酸A 0.046 g·L-1、異綠原酸C 0.080 g·L-1、斷氧化馬錢子苷0.350 g·L-1、梔子苷1.900 g·L-1的混合對(duì)照品溶液1.0 mL，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。9種成分的平均回收率依次為：99.95%、99.50%、97.96%、99.33%、99.05%、99.28%、98.96%、99.00%、99.13%；SD分別為：1.01%、0.63%、1.05%、3.01%、1.35%、2.63%、2.43%、1.07%、0.95%（n=6）。試驗(yàn)結(jié)果表明，本法具有良好的回收率。

2.4 試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 配伍溶液配制方法 在20℃恒溫條件下，將50 mL熱毒寧注射液分別與250 mL的5%葡萄糖注射液（5%GS）、0.9%氯化鈉注射液（0.9%NS）混合均勻，分別于0、1、2、4、6 h對(duì)混合藥液進(jìn)行外觀檢查及綠原酸、新綠原酸、隱綠原酸、咖啡酸、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C、斷氧化馬錢子苷、梔子苷等9種成分含量測(cè)定。

2.4.2 樣品檢測(cè)結(jié)果 配伍溶液在6 h內(nèi)外觀無(wú)明顯變化，藥液澄清透明，無(wú)沉淀、無(wú)氣泡產(chǎn)生。三批熱毒寧注射液與兩種溶媒分別配伍后0～6 h內(nèi)9種成分含量無(wú)顯著性變化，結(jié)果見表1。

3 討 論

中藥注射液的配伍問(wèn)題是影響其安全性的重要因素。熱毒寧注射液與兩種常用溶媒配伍，對(duì)其內(nèi)含的9種成分穩(wěn)定性情況進(jìn)行研究，在檢測(cè)方法的建立過(guò)程中，將其供試品溶液制備方法進(jìn)行了改進(jìn)，同時(shí)測(cè)定9個(gè)成分，既減少了供試品溶液處理步驟，又節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間。

結(jié)果顯示，熱毒寧注射液分別與5%葡萄糖注射液、0.9%氯化鈉注射液配伍，配伍溶液在0～6 h內(nèi)，綠原酸等9種成分的含量無(wú)顯著性變化，表明這9種成分在配伍藥液中6 h內(nèi)均是穩(wěn)定的，為熱毒寧注射液臨床合理用藥提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)及數(shù)據(jù)支持。

[1] 李 芳，周建明，韓兆忠，等.3種中藥注射液的過(guò)敏性試驗(yàn)研究[J].中國(guó)現(xiàn)代中藥，2013，15（3）：183-6.

[2] 王永香，劉 濤，王振中，等.熱毒寧注射液與溶媒配伍穩(wěn)定性研究[J].中國(guó)中藥雜志，2010，35（22）：2990-3.

[3] 畢宇安，王振中，宋愛華，等.熱毒寧注射液高效液相色譜指紋圖譜研究及多成分定量分析[J].世界科學(xué)技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2010，12（2）：298-303.

[4] 劉 樺，周婷婷，范國(guó)榮.液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在環(huán)烯醚萜苷類化合物研究中的應(yīng)用[J].藥學(xué)服務(wù)與研究，2011，11（1）：45-9.

Study on the Compatible Stability of 9 Components in Reduning Injection Mixed with 2 Kinds of Solvent Most in Use*

LI Miao1,2,WANG Yong-xiang1,2,MENG Jin1,2,WANG Ren-jie1,2,BI Yu-an1,2,WANG Zhen-zhong1,2,XIAO Wei1,2**
1Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co.,Ltd.,Lianyungang 222001;2State Key Laboratory of New-tech for Chi-nese Medicine Pharmaceutical Process,Lianyungang 222001

Objective:To investigate the compatible stability of chlorogenic acid,neochlorogenic acid, cryptochlorogenic acid,cafferic acid,geniposide,secoxyloganin,isochlorogenic acid A,isochlorogenic acid B and isochlorogenic acid C in Reduning Injection mixed with two solvents,to provide an experimental basis for clinical medicine.Methods:The changes of the nine components in Reduning injection combined with 5%glucose injection or 0.9%sodium chloride injection respectively (Reduning injection:solvent=50:250) were determined by HPLC.Results and Conclusion:The 9 components were stable in 6 h after combin-ing Reduning injection and 5%glucose injection or 0.9%sodium chloride injection.

Redning injection;Compatibility;Stability;Chlorogenic acid;Geniposide;Secoxyloganin;HPLC

R969.2

A

1673-7806（2015）02-150-03

國(guó)家重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（編號(hào)：2013ZX09402203）

李淼，女，工程師 E-mail:limiao4569092@126.com

**通訊作者蕭偉，男，研究員，博士生導(dǎo)師 E-mail:kanionlunwen@163.com

2014-11-06

2015-01-28