地衣芽孢桿菌治療肝硬化患者的臨床藥效評價*

高 璐，于 鋒，王 堅**

1東南大學附屬第二醫(yī)院臨床藥學室，南京 210003；2中國藥科大學臨床藥學教研室，南京 210009

地衣芽孢桿菌治療肝硬化患者的臨床藥效評價*

高 璐1，于 鋒2**，王 堅1**

1東南大學附屬第二醫(yī)院臨床藥學室，南京 210003；2中國藥科大學臨床藥學教研室，南京 210009

目的：評價肝硬化患者腸黏膜屏障功能、血氨和血內毒素的變化特點及地衣芽孢桿菌膠囊對肝硬化患者的影響。方法：選擇60例肝硬化患者進行隨機開放性對照試驗，使用隨機數(shù)字表法分為治療組和對照組，給予保肝、利尿、支持治療，治療組在此基礎上加用地衣芽孢桿菌膠囊（整腸生）治療兩周。比較兩組治療前后血二胺氧化酶（DAO）、D-乳酸（D-L）、內毒素（ETX）、氨及肝功能變化情況。結果：肝硬化患者血DAO、D-L、ETX、氨四項指標與標準參考值相比增高，并且都隨肝硬化Child-Pugh評分升高而升高（0.4＜r＜0.7，t＜0.01）。酒精與嗜肝病毒導致的肝硬化相比，前者DAO、D-L水平顯著升高（P＜0.01）。14天的治療觀察后復查兩組肝功能無明顯差異，然而治療組DAO、D-L、EXT、氨較治療前都顯著下降（P＜0.01）。治療組停用整腸生后第14天復查總膽紅素、DAO、D-L水平較停藥前均無顯著性差異（P＞0.05）。在14天的觀察期內，治療組與對照組并發(fā)癥發(fā)生率差異無統(tǒng)計學意義（13.3%vs 3.3%，P＞0.0.5）。結論：地衣芽孢桿菌短期內治療具有潛在保護肝硬化患者腸黏膜屏障的作用，從而降低循環(huán)血中的內毒素和氨水平。

地衣芽孢桿菌；益生菌；肝硬化；腸黏膜通透性；內毒素；氨

已知腸道菌群失調與肝功能損傷有明顯的相關性，肝硬化時并發(fā)門靜脈高壓、低蛋白血癥、腸黏膜淤血及水腫，導致腸道細菌過度生長，發(fā)生腸道細菌及毒素經過受損的腸黏膜進入血循環(huán)，造成肝臟進一步損傷，并引起一系列的并發(fā)癥[1]，此在臨床治療中是一個難題。臨床藥師參考了有關文獻并結合我院情況，應用地衣芽孢桿菌制劑防治肝硬化患者腸黏膜受損、內毒素血癥、高血氨癥及肝硬化并發(fā)癥，并對患者腸黏膜功能、血內毒素、血氨與肝硬化程度及肝硬化病因之間的關系進行了研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2014年2月至2014年10月在我院肝病內科住院的肝硬化患者60例，其依據(jù)為：參考中華醫(yī)學會肝病學會分別于2010和2004年制定的《乙型肝炎防治指南》[2]和《丙型肝炎防治指南》[3]中肝炎后肝硬化的診斷標準，以及2010年中華醫(yī)學會肝病學會制定的《酒精性肝病診療指南》[4]中酒精性肝硬化的診斷標準確認為肝硬化患者，酒精性肝硬化患者均已戒酒半年以上，經B超或CT檢查證實，臨床癥狀和體征典型。

排除可能引起胃腸屏障功能損傷的肝外疾病（如糖尿病、甲狀腺疾病、硬皮病和假性腸梗阻等）、合并肝外疾病所致的慢性腹瀉、腦病、任何情況導致的感染及其他重要器官衰竭的患者；治療前14天內均未用抗生素、微生態(tài)制劑、抑酸藥、促胃腸動力藥物和熊去氧膽酸制劑。共計男性42名，女性18名，年齡32～79歲。使用分層隨機化法，先按由英國R.N.H.Pugh等人于1973年提出的肝硬化Child-Pugh（CP）分級方案進行評分并分為A、B、C三級，分別有16、22、22人；再根據(jù)隨機數(shù)字表法分別隨機將這三組肝硬化患者分為治療組、對照組，各30例；兩組患者的性別、年齡、血清總膽紅素、白蛋白、丙氨酸氨基轉移酶、凝血酶原時間及CP評分無統(tǒng)計學差異（P＞0.05)，具有組間可比性，見表1。

1.2 治療方法

治療在尊重患者的知情權及自愿參與原則下實施。對照組給予常規(guī)保肝、利尿、營養(yǎng)支持的綜合治療；治療組在此基礎上加用口服地衣芽胞桿菌活菌膠囊（商品名：整腸生，東北制藥集團公司沈陽第一制藥廠提供，規(guī)格0.5 g，每粒含2.5億活菌），每日3次，每次2粒，連服14天；治療期間不使用抗菌藥物及其他影響腸道菌群的制劑。

表1 兩組患者一般資料比較（±s，n=30）

表1 兩組患者一般資料比較（±s，n=30）

整腸生干預組陰性對照組P值年齡52.80±10.85 54.83±10.55 0.46性別（M/F）21/9 21/9 1.00酒精4 7病因乙肝病毒22 19 0.60丙肝病毒4 4 Child-Pugh分級（A/B/C）8/11/11 8/11/11 1.00 Child-Pugh評分8.73±2.38 8.83±2.48 0.87血清總膽紅素（3～19 μmol·L-1）59.56±59.84 58.81±52.47 0.96谷丙轉氨酶（5～40 U·L-1）52.41±42.13 67.03±76.85 0.37血清白蛋白（35～55 g·L-1）31.03±6.63 32.86±6.73 0.29凝血酶原時間（10～14 s）16.18±2.96 16.64±3.48 0.60

1.3 觀察內容及方法

服藥后每天記錄臨床癥狀：腹瀉、便秘等，分別在第0、14天取肘部靜脈血測定患者血氨、二胺氧化酶 （DAO）、D-乳酸鹽 （D-L）的水平及血漿內毒素（ETX）水平，并進行肝功能檢測。此外，治療組在服用整腸生第14天后停藥，停藥后即刻抽血復測肝功能、DAO、D-L。使用日立全自動生化分析儀7600型檢測常規(guī)生化功能；使用浙江伊利康生物技術有限公司的血氨檢測試劑盒測定血氨；廈門鱟試劑實驗廠有限公司的改良偶氮機制顯色試劑盒檢測ETX；上海廣銳生物科技有限公司的雙夾心ELISA試劑盒檢測DAO及D-L。正常參考值：DAO 2.04U·mL-1、D-L 0.82 μg· mL-1[5]、ETX 1.75 EU·mL-1[6]、血氨18～79 mmol·L-1。

1.4 統(tǒng)計學處理

應用SPSS17.0軟件系統(tǒng)進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，經正態(tài)性檢驗后，兩組間差異采用單因素方差分析，同時進行Levene方差齊性檢驗，方差齊性資料采用F檢驗，兩組間差異采用LSD法比較，方差不齊資料采用近似F檢驗Welch法，并且兩組間采用Dunnett’s T3比較，相關性分析通過計算Pearson相關系數(shù)，計數(shù)資料采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。血EXT、DAO、D-L采用回歸及相關分析。

2 結 果

2.1 Child-Pugh分級A、B、C組之間比較

CP-C組患者四項指標均比CP-A組顯著升高（P＜0.01），CP-C組的ETX、氨比CP-B組升高 （P＜ 0.05），其他指標未見顯著性差異，見表2。

表2 不同Child-Pugh評分患者的DAO、D-L、ETX及血氨活性比較（±s）

表2 不同Child-Pugh評分患者的DAO、D-L、ETX及血氨活性比較（±s）

注：與CP-A組比較**P＜0.01；與CP-B組比較#P＜0.05。

項 目Child-Pugh分級A B C例數(shù)16 22 22 DAO（U·mL-1）9.77±4.80 17.58±13.51 24.43±19.34**D-L（μg·mL-1）0.91±0.52 1.45±1.16 1.89±0.93**ETX（EU·mL-1）4.32±4.41 5.21±2.78 7.96±3.57**#氨（mmol·L-1）33.35±21.73 41.32±12.32 53.10±17.90**#

通過計算Pearson簡單相關系數(shù)分析CP評分與各項指標之間的線性相關性，反映出CP評分與DAO、D-L、EXT、氨均呈中等程度的正線性相關（0.4＜r＜0.7），而且顯著水平均較高（t＜0.01），見表3。

表3 肝硬化評分與DAO、D-L、EXT、氨活性之間的Pearson相關分析

2.2 肝硬化病因之間比較

酒精性肝硬化組DAO、D-L、氨均高于肝炎肝硬化組（P＜0.01或P＜0.05），而兩組的CP評分、EXT水平差異無統(tǒng)計學意義，見表4。

表4 肝炎肝硬化和酒精性肝硬化DAO、D-L、ETX和血氨的活性比較（±s）

表4 肝炎肝硬化和酒精性肝硬化DAO、D-L、ETX和血氨的活性比較（±s）

項目肝硬化病因嗜肝病毒酒精P值例數(shù)49 11 Child-Pugh評分9.64±2.80 8.59±2.30 0.20 DAO（U·mL-1）12.93±5.56 40.63±23.79＜0.01 D-L（μg·mL-1）1.14±0.44 2.91±1.48＜0.01 ETX（EU·mL-1）5.77±3.80 6.90±3.98 0.38氨（mmol·L-1）42.76±18.06 57.86±21.09 0.02

2.3 治療組與對照組比較

治療前兩組患者各項指標均無明顯差異，地衣芽孢桿菌治療組前后比較：DAO、D-L、EXT、氨水平的差異有統(tǒng)計學意義；治療組與對照組治療后的D-L、ETX、氨之間均有統(tǒng)計學差異，對照組前后對比ETX活性有明顯升高。見表5。

2.4 治療組停藥前與停藥14天后比較

治療組停用整腸生第14天復查總膽紅素水平及腸黏膜屏障完整性指標，經配對樣本t檢驗：TBil [（47.2±41.3）vs（39.4±27.0）μmol·L-1，P=0.06]、DAO [（14.2±11.1）vs （14.2±11.5）U·mL-1，P=0.93]、D-L [（1.0±0.5 vs 1.0±0.5）μg·mL-1，P=0.41]，停藥前后各項指標均無顯著性差異（P＞0.05）。

表5 兩組患者檢驗方面改善比較（±s，n=30）

表5 兩組患者檢驗方面改善比較（±s，n=30）

注：與同組治療前比較*P＜0.05，**P＜0.01；與對照組比較#P＜0.05，##P＜0.01。

組別總膽紅素（μmol·L-1）白蛋白（g·L-1）丙氨酸氨基轉移酶（U·L-1）DAO（U·mL-1）D-L（μg·mL-1）ETX（EU·mL-1）氨（mmol·L-1）治療組治療前59.6±59.8 31.03±6.63 52.4±42.1 17.0±13.3 1.4±0.9 6.6±4.1a45.3±21.5治療后47.2±41.3 31.27±5.33 36.0±19.3*14.2±11.1**1.0±0.5**#3.9±3.7**##32.2±17.6**##對照組治療前58.8±52.5 32.86±6.73 67.0±76.9 19.0±17.5 1.5±1.1 5.4±3.5 45.8±17.3治療后56.0±55.9 32.77±6.77 35.0±22.0*18.1±14.7 1.5±1.0 6.8±3.7**42.5±13.2

2.5 治療組與對照組并發(fā)癥發(fā)生情況比較

在14天的觀察期內，對照組出現(xiàn)輕微型肝性腦?。╩inimal hepatic encephalopathy，MHE）2例，原發(fā)性腹膜炎2例，并發(fā)癥發(fā)生率為13.3%（4/30）；治療組僅出現(xiàn)MHE 1例，并發(fā)癥發(fā)生率為3.3%（1/30）；兩組的并發(fā)癥發(fā)生率的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

2.6 不良反應

治療組中有1例男性患者在第一次服用整腸生后出現(xiàn)腹瀉，之后服藥未再出現(xiàn)腹瀉現(xiàn)象，無一例因不良反應而終止治療。

3 討 論

肝臟與腸道在解剖和功能上存在廣泛而密切的聯(lián)系，構成“腸肝軸”，所以腸道菌群失衡參與肝硬化各種并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。由于門脈高壓癥，肝硬化患者的腸道黏膜長期處于瘀血、缺氧狀態(tài)，腸黏膜屏障被破壞，再加之腸肝循環(huán)紊亂導致腸道致病菌過度生長和機體免疫功能低下，肝硬化患者極易發(fā)生腸道細菌移位 （bacterial translocation，BT），即腸道細菌或其產物（EXT）透過腸壁進入腸系膜淋巴結，繼而進入機體循環(huán)。BT除了直接導致細菌感染發(fā)生之外，還會激發(fā)全身性炎癥反應，影響機體血流狀態(tài)，誘發(fā)肝性腦病等并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展。血中二胺氧化酶和D-乳酸活性均可作為監(jiān)測腸黏膜損害和其通透性改變的早期指標。內毒素由腸道革蘭陰性菌產生，體積小于細菌，當腸黏膜通透性增加時即可通過受損的黏膜經門靜脈進入肝臟或周邊淋巴組織而引起全身的炎癥反應，進一步加重肝損傷，形成惡性循環(huán)。氨的主要來源是腸道，在腸道細菌尿素酶作用下產生，經肝臟解毒，肝硬化時解毒功能受損，血液中氨水平升高，血氨的變化可反映腸道的功能狀態(tài)，另外高濃度血氨在肝硬化所致的肝性腦病的發(fā)生中起著重要作用。

益生菌是一類活菌制劑，有平衡腸道菌群、抑制潛在致病菌、增加腸黏膜抵抗力的作用，可在多個水平下調內源性炎癥介質，近幾年被越來越多地用于肝硬化的輔助治療。一項Meta分析[7]顯示，通過補充益生菌制劑可以改善肝硬化患者的臨床癥狀，并降低并發(fā)癥的風險。目前臨床常用的益生菌中，很多菌種如雙歧桿菌、乳桿菌和糞腸球菌等，必須低溫冷藏保存，以使菌體休眠才能最大限度保持活性益生菌的數(shù)量，而地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌的菌株耐高溫能力強，所以常溫保存即可，并能以芽孢形式通過高胃酸環(huán)境，到達腸道后芽孢萌發(fā)成活菌，發(fā)揮最佳功效。地衣芽孢桿菌的作用機制包括拮抗、奪氧、屏障、免疫、營養(yǎng)五個方面，能有效抑制腸道致病菌生長和對腸上皮細胞的粘附作用[8]。綜上，為了保證患者服藥依從性及用藥效果，臨床藥師在綜合治療的基礎上，選用地衣芽孢桿菌膠囊制劑（整腸生）治療肝硬化患者。

研究表明，與正常參考值相比，肝硬化患者血DAO、D-L、ETX及血氨水平明顯增高，并且均隨肝硬化Child-Pugh評分升高而升高，表現(xiàn)為中度正相關性。Child-Pugh分級代表肝臟損害的嚴重程度，評分越高肝臟損害越嚴重，肝臟處理毒素、病原微生物的能力越低。CP-C級患者不僅有腸通透性的增加，還存在小腸細菌過度繁殖，這可能是這四項指標達到高峰的原因。失代償期肝硬化患者極易出現(xiàn)腸黏膜屏障功能損傷，發(fā)生腸源性內毒素血癥、高氨血癥。納入實驗的49名肝炎肝硬化患者與11名酒精性肝硬化患者相比較，Child-Pugh評分無差異，說明兩組的肝硬化程度相當。酒精性肝硬化患者DAO、D-L明顯高于肝炎肝硬化患者 （P＜0.01），因為長期大量酒精攝入可導致腸道代謝下降，此外乙醇及其氧化產物乙醛均可破壞腸上皮的緊密連接[9]，進而誘導腸屏障通透性增加。整腸生治療組在服藥14天后血DAO、D-L、EXT、氨都顯著下降，但總膽紅素、白蛋白、谷丙轉氨酶這三項反映肝功能的主要指標與治療組相比無明顯差異。說明短期內補充地衣芽孢桿菌具有潛在保護肝硬化患者腸黏膜屏障的功能，從而減少循環(huán)血中的內毒素和氨，但在改善肝功能方面沒有明顯作用，因為腸道菌群失調僅是肝硬化發(fā)展的病因之一。另外，發(fā)現(xiàn)治療組在停藥14天后腸道通透性仍能保持停服整腸生之前的較好狀態(tài)，提示該藥物能有效地改善肝硬化患者腸屏障功能，療效較持久。整腸生可以明顯降低肝硬化患者血氨、內毒素水平，故治療組肝性腦病、原發(fā)性腹膜炎的發(fā)生率低于對照組，但無顯著性差異，具體原因尚須進一步分析。整腸生干預組中未發(fā)生嚴重不良反應，故推測臨床中應用整腸生輔助治療肝硬化安全性較好，但臨床須加大樣本量進一步研究證實其安全性。

綜上所述，整腸生具有不易失活、價廉、安全等優(yōu)點，可以用于治療肝硬化、尤其是失代償期肝硬化，對酒精性肝硬化患者也有較高的應用價值，對維護腸道微生態(tài)平衡、改善腸黏膜屏障功能和預防肝硬化并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展有積極作用，且停藥后也能維持較長時間的療效；但是，本研究規(guī)模較小，今后需進行較大規(guī)模的臨床干預研究。關于整腸生的藥代動力學系統(tǒng)描述、使用時機、安全性、與抗生素聯(lián)用等問題都將有待于深入的研究，為臨床使用提供指導。

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Clinical Evaluation of Bacillus Licheniformis in the Treatment of Liver Cirrhosis*

GAO Lu1,YU Feng2**,WANG Jian1**
1The Second Hospital of Nanjing Affiliated to Southeast University,Nanjing 210003;2Department of Clinical Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009

Objective:To investigate the function of intestinal mucosal barrier in patients with liver cir-rhosis(LC)and explore the clinical efficacy and safety of Bacillus licheniformis in the treatment of LC pa-tients.Methods:In a randomized open study,60 participants with LC,in accordance with the random number table,were divided into experimental group and control group.Patients in the control group re-ceived hepatoprotective,diuretic and supporting treatment,and patients in the experimental group were giv-en probiotic capsules containing Bacillus licheniformis(Zhengchangsheng capsules)besides the same general therapy for a period of 14 days.The changes of DAO,D-L,EXT and ammonia levels and liver function before or after treatment between the 2 groups were compared．Results:The levels of DAO,D-L,EXT and ammonia were higher in patients with LC than the reference values.The levels were also positively correlated with the Child-Pugh scores.The levels of DAO and D-L were significantly higher with alcoholic cirrhosis than with liver cirrhosis of hepatitis (P＜0.01).Our study did not show a significant beneficial ef-fect of probiotic supplementation to improve liver function in patients with LC.Nevertheless,the adminis-tration of probiotics appeared to significantly reduce the DAO,D-L,ETX and ammonia levels starting after 14 days of treatment(P＜0.01).Up to 14-day after probiotics withdrawal,total bilirubin,DAO and D-L did not rebound.There was no statistical difference in the incidence of complications between the 2 groups (13.3%vs 3.3%,P＞0.05).Conclusions:Bacillus licheniformis could improve the function of intestinal mu-cosal barrier,reduce the absorption of enterological EXT and ammonia.

Bacillus licheniformis;Probiotics;Liver cirrhosis;Intestinal permeability;Endotoxin;Ammonia

R969.4；R657.3+1

A

1673-7806（2015）02-127-04

江蘇省藥學會奧賽康臨床藥學科研項目（No.201010）

高璐，女，碩士生 E-mail:gaolu08@126.com

* *通訊作者于鋒，男，教授 E-mail:yufengcpu@163.com王堅，男，主任藥師 E-mail:wangjian990@sina.com

2015-01-12

2015-02-08