替吉奧單藥對幽門螺桿菌相關性胃癌中gC1qR的表達影響*

徐炳國，王樹卿，劉程偉**，高玲娟

1黑龍江牡丹江市腫瘤醫(yī)院腹部外科，牡丹江 157009；2黑龍江佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腹部外科，佳木斯 154007；3江蘇省南京市婦幼保健院檢驗科，南京 210004

替吉奧單藥對幽門螺桿菌相關性胃癌中gC1qR的表達影響*

徐炳國1，王樹卿2，劉程偉2**，高玲娟3**

1黑龍江牡丹江市腫瘤醫(yī)院腹部外科，牡丹江 157009；2黑龍江佳木斯大學附屬第一醫(yī)院腹部外科，佳木斯 154007；3江蘇省南京市婦幼保健院檢驗科，南京 210004

目的：探討替吉奧單藥對胃癌中幽門螺桿菌（H.pylori，Hp）的感染及球狀C1q受體基因（gC1qR）表達的影響。方法：以胃癌、胃炎病例組織及胃癌細胞系為研究對象，采用實時定量聚合酶鏈反應（Real time PCR）檢測gC1qR mRNA表達水平；采用Hp DNA PCR方法，對胃竇部組織標本進行Hp水平檢測；流式細胞技術進行細胞凋亡的檢測及transwell實驗進行細胞侵襲能力的檢測。結果：在40對配對組織中有33對腫瘤組織gC1qR mRNA表達低于配對的胃炎病例組織；替吉奧單藥可誘導gC1qR基因表達，抑制胃癌細胞Hp感染，同時增加胃癌細胞的凋亡率及降低胃癌細胞侵襲能力。結論：替吉奧單藥誘導gC1qR基因表達，影響Hp對胃癌發(fā)生發(fā)展，是治療胃癌的首選藥物。

替吉奧單藥；gC1qR基因；幽門螺桿菌（H.pylori，Hp）；胃癌

胃癌目前是全球最常見的惡性腫瘤之一，居各類惡性腫瘤死亡率之首[1]。胃癌的病因學研究已經(jīng)證實，幽門螺桿菌（H.pylori，Hp）感染是導致胃癌及其相關病變的首要因素[2]，因此深入研究影響Hp感染對胃癌發(fā)生的影響及其作用機制開始成為預防醫(yī)學領域疾病早期防治的一個熱點研究內容。球狀C1q受體（Receptor for the globular heads of C1q，gC1qR）是各種哺乳動物細胞（紅細胞除外）中均存在的一種受體蛋白，主要以C1q-gC1qR復合體形式位于線粒體表面，影響線粒體功能[3]，調控細胞的生物學特征[4]。目前，胃癌無統(tǒng)一的治療方案，其化療方案效果也不盡相同。臨床治療顯示替吉奧單藥治療晚期胃癌可以明顯提高有效率及遠期生存率，本研究就替吉奧單藥治療晚期胃癌機制做進一步探討。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選擇2011年1月～2013年12月在牡丹江市腫瘤醫(yī)院門診及住院的患者，年齡在35～69歲，受試者分為兩組：①胃炎組40例，胃鏡檢查的患者；②胃癌組，40例。采用實時定量聚合酶鏈反應（Real time PCR）檢測gC1qR mRNA表達水平；采用Hp DNA PCR方法，對胃竇部組織標本進行Hp水平檢測，確定gC1qR基因與Hp感染、胃癌的相關性。

1.2 儀器與試劑

Prime 7300熒光定量PCR儀 （美國ABI公司）。Trizol試劑、RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、轉染試劑盒均購自 Invitrogen公司；Real-time PCR試劑Master Mix購自 ABI公司；特異性引物和探針（Taqman探針、FAM標記）由杭州赫貝公司合成。

1.3 胃癌細胞培養(yǎng)與分組

胃癌細胞株MKN-28（人胃癌高分化腺癌細胞株）由杭州赫貝生物技術有限公司提供。細胞貼壁生長，培養(yǎng)于 （含15%胎牛血清，100 U·mL-1青霉素，100 U·mL-1鏈霉素，非必需氨基酸10 mL·L-1及MEM，pH 7.2）培養(yǎng)液中，每50 mL培養(yǎng)瓶中加入4 mL完全營養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2孵箱中，每1～2天換液一次。將培養(yǎng)的胃癌細胞株分做2種處理：①實驗組：取培養(yǎng)的胃癌細胞系，50%～70%融合，以1×107個活菌的Hp菌液與胃癌細胞共同培養(yǎng)24 h，以40 mg·m-2替吉奧單藥作用于Hp感染胃癌細胞；②對照組：取培養(yǎng)的胃癌細胞系，50%～70%融合，以1×107個活菌的Hp菌液與胃癌細胞共同培養(yǎng)24 h，不施加替吉奧單藥作用于Hp感染胃癌細胞。

1.4 實時熒光定量聚合酶鏈式反應（Real-time PCR）

gC1qR引物與探針分別為：上游5’-AAT CAC ACG GTA GAC ACT GAA ATG CC-3’，下游5’-CAT CAT CCC ATC TAA AAT GTC CCC TG-3’，探針5’-TGC TCC AGT TCA ACC AAC GTC CTT CTC-3’。βactin引物與探針分別為：上游5’-TCA CCC ACA CTG TGC CCA TCT ATG A-3’，下游5-CAT CGG AAC CGC TCA TTG CCG ATA-3’，探針5’-ACG CGC TCC CCC ATG CCA TCC TGC GT-3’。PCR反應體系為20 μL含1×TaqMan Universal PCR Mas-ter Mix（ABI）、0.1 μmol·L-1熒光標記探針、引物各0.2 μmol·L-1。實時熒光 PCR反應在 ABI Prime 7300定量PCR檢測儀上進行，反應參數(shù)為50℃/2 min，95℃/3 min，95℃/15 s，60℃/1 min，40個循環(huán)，在60℃進行單點熒光檢測。選擇熒光檢測模式FAM熒光，對于實驗數(shù)據(jù)，按以下公式進行計算：2-ΔΔCT=2-（CT.gC1qR-CT.actin）Timex+（CT.gC1qR-CT.actin）Time0

1.5 胃癌細胞凋亡檢測

收集細胞制成細胞懸液，調整細胞數(shù)為5×106/mL。500～1000 r·min-1離心5 min，棄去培養(yǎng)液。用預冷、4℃無菌的PBS充分洗滌細胞兩次，用250 μL結合緩沖液重新懸浮細胞。取100 μL的細胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-異硫氰酸熒光素（Fluorescein Isothiocyanate，F(xiàn)ITC）和10 μL 20 μg· mL-1的碘化丙啶（Propidiumiodide，PI）溶液，混勻后室溫下避光孵育10 min。孵育后加入400 μL結合緩沖液，立即上流式細胞儀分析（實驗須在1 h內完成）。

1.6 胃癌細胞侵襲實驗

細胞體外侵襲能力的測定在重建基底膜的8 μm孔徑的聚碳酯膜transwell小室中進行。上室內加入含5×106/mL的實驗組/對照組胃癌細胞重懸液100 μL；下室內為具有趨化作用的無血清培養(yǎng)成纖維細胞培養(yǎng)液。上下室之間以聚碳酸酯膜-Matrigel來模擬體內細胞外基質環(huán)境，從而考察細胞穿透細胞外基質向外浸潤和擴展的能力。37℃培養(yǎng)24 h后，將上室附著的細胞以濕棉簽拭去，對膜下方細胞行常規(guī)HE染色，光學顯微鏡觀察。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結 果

2.1 胃癌組織中gC1qR mRNA水平的表達與幽門螺桿菌的關系

33例（82.5%）胃癌組織中gC1qR mRNA表達水平下調，胃炎組織中5例（12.5%）gC1qR mRNA表達水平下調；gC1qR基因在胃癌組織中的表達明顯低于胃炎組織，兩者之間差異具有顯著性（P＜0.01）。同期檢測Hp感染率，由圖1、表1可見，胃癌組Hp感染率與胃炎組相比差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。

圖1 實時熒光定量PCR擴增gC1qR及Actin示意圖

表1 2組gC1R mRNA表達和Hp感染率的檢測（±s）

表1 2組gC1R mRNA表達和Hp感染率的檢測（±s）

注：與胃炎組比較，**P＜0.01

組別gC1R mRNA Hp（%）胃癌組0.22±0.04**72.4**胃炎組0.65±0.07 33.3

2.2 替吉奧單藥對胃癌細胞的凋亡和侵襲能力

替吉奧單藥作用于Hp感染胃癌細胞 （實驗組），結果顯示，與未用藥組（對照組）比較，gC1qR表達顯著升高，Hp含量明顯減少，且胃癌細胞的凋亡率明顯增加，而胃癌細胞的侵襲能力顯著下降，2組比較存在顯著差異（P＜0.01）。見圖2、表2。

圖2 流式細胞儀檢測胃癌細胞凋亡示意圖

表2 2組胃癌細胞的凋亡和侵襲細胞數(shù)比較（±s）

表2 2組胃癌細胞的凋亡和侵襲細胞數(shù)比較（±s）

注：與對照組比較，**P＜0.01

組別實驗組對照組gC1R mRNA Hp 凋亡侵襲0.42±0.03**0.12±0.02**0.87±0.08**25.46±2.05**0.21±0.03 0.76±0.04 0.34±0.04 64.39±1.04

3 討 論

國際癌癥研究機構（IARC）組織將Hp列為I類致癌因子，Hp感染人群發(fā)生胃癌的風險是非感染人群的6倍，提示Hp感染是胃癌惡變的重要危險因素。在前期研究中，對牡丹江市腫瘤醫(yī)院胃竇部組織及胃黏膜組織病變者進行核酸水平的Hp檢測，也發(fā)現(xiàn)慢性淺表性胃炎、慢性萎縮性胃炎和胃竇部不典型增生病變組織中，Hp DNA含量分別為正常胃組織的2.68、2.95、4.52倍。

胃癌的發(fā)生是多因素、多階段、多基因變異綜合作用的過程，迄今有關Hp基因致癌機理的研究已有較多文獻報道，如：激活巨噬細胞游走抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF），從而促進胃上皮細胞增殖并抑制凋亡[5]；調控Cas-pase-3基因抑制胃癌細胞凋亡[6]；調控線粒體功能導致胃癌細胞無限增殖等機制，是近年來提出的有關Hp致癌的新理論[7]。本研究發(fā)現(xiàn)補體受體gC1qR（補體C1q受體）可以通過錨定在線粒體上影響滋養(yǎng)層細胞的功能，從而介導滋養(yǎng)層細胞的凋亡[8]。本研究中，采用Real time PCR檢測胃病變組織中gC1qR mRNA表達，結果發(fā)現(xiàn)，胃癌組織中gC1qR mRNA的表達顯著下調。上述結果提示gC1qR是Hp-胃癌細胞關系研究的新線索。

以化療為主的非手術綜合治療是治療晚期癌癥的主要手段，可明顯改善晚期胃癌患者的生活質量，延長生存期。據(jù)統(tǒng)計，替吉奧單藥治療晚期胃癌有效率為26.0%～49.0%，鑒于此，我們將替吉奧單藥作用與體外培養(yǎng)的Hp感染的胃癌細胞株，發(fā)現(xiàn)其誘導gC1qR基因表達，抑制Hp感染，同時胃癌細胞凋亡率明顯增加，且侵襲能力顯著下調，本研究從體外實驗為替吉奧單藥治療胃癌提供全新理論。

[1] Hyun MH,Lee CH,Kim HJ,et al.Systematic review and meta-analysis of robotic surgery compared with conventional laparoscopic and open resections for gas-tric carcinoma[J].Br J Surg,2013,100(12):1566-78.

[2] Osman MA,Bloom GS,Tagoe EA.Helicobacter pyloriinduced alteration of epithelial cell signaling and polarity: a possible mechanism of gastric carcinoma etiology and disparity[J].Cytoskeleton(Hoboken),2013,70(7):349-59.

[3] Gao LJ,Gu PQ,Fan WM,et al.The role of gC1qR in regulating survival of human papillomavirus 16 onco-genes-transfected cervical cancer cells[J].Int J Oncol, 2011,39(5):1265-72.

[4] Kim JA,Wei Y,Sowers JR.Role of mitochondrial dysfunc-tion in insulin resistance[J].Circ Res,2008,102(4):401-14.

[5] He XX,Yang J,Ding YW,et al.Increased epithelial and serum expression of macrophage migration inhibito-ry factor (MIF)in gastric cancer:potential role of MIF in gastric carcinogenesis[J].Gut,2006,55(6):797-802.

[6] Wu IC,Wu MT,Chen YK,et al.Apoptotic effect of Hel-icobacter pylori on oesophageal squamous-cell carcinoma cells in vitro[J].Eur J Clin Invest,2008,38(10):760-5.

[7] Zhang H,Fang DC,Lan CH,et al.Helicobacter pylori infection induces apoptosis in gastric cancer cells through the mitochondrial pathway[J].J Gastroenterol Hepatol,2007,22(7):1051-6.

[8] 馬培奇.抗腫瘤新藥替吉奧鉀研究進展[J].中國醫(yī)藥導刊，2007，9（6）：499-502.

Effect of Compound Tegafur and Oteracil Potassium Sustained Capsules (S-1) on the Expression of gC1qR in H.Pylori Associated Gastric Cancer*

XU Bing-guo1,WANG Shu-qing2,LIU Cheng-wei2**,GAO Ling-juan3**
1Department of Abdominal Surgery,Tumour Hospital of Mudanjiang City,Mudanjiang Heilongjiang 157009;2Department of Abdominal Surgery,First Affiliated Hospital of Jiamusi University,Jiamusi Heilongjiang 154009;3Department of Clinical Laboratory,Nanjing Maternity and Child Health Care Hospital,Nanjing 210004

Objective:To investigate the effect of compound tegafur and oteracil potassium sustained capsules (S-1)on the expression of gC1qR gene and H.pylori (Hp)in gastric cancer.Methods:The expression of gC1qR mRNA and Hp was detected by Real time PCR and Hp DNA PCR in 40 matched pairs of gastritis and gastric cancer specimens.In vitro experiment,the apoptosis of gastric cancer cell line-treated with S-1 was assessed by flow cytometry,meanwhile,the migration of gastric cancer cell was detected via transwell assay.Results:The levels of gC1qR mRNA were significantly decreased and Hp was significantly increased in gastric cancer specimens.S-1 could induce the overexpression of gC1qR and inhibit the infection of Hp,and induce the apoptosis and inhibit the migration of gastric cancer cell. Conclusions:These resultsindicate thatS-1 inducesthe expression ofgC1qR,and effectsthe development of Hp-infected gastric cancer,S-1 is the first selective drug for controlling gastric cancer.

Compound Tegafur and Oteracil Potassium Sustained Capsules (S-1);gC1qR gene;H. pylori;Gastric cancer

R963；R979.1

A

1673-7806（2015）02-104-03

南京市醫(yī)學科技發(fā)展基金（No.201308041）；南京市科技計劃項目（No.201303019）

徐炳國，男，副主任醫(yī)師 E-mail:xubingguo1973@163.com

**通訊作者劉程偉，男，主任醫(yī)師 E-mail:njsctgzgq@163.com高玲娟，女，副主任技師 E-mail:gaolingjuan@njmu.edu.cn

2014-11-19

2014-12-08