NO供體型吉西他濱衍生物的設計、合成及其抗腫瘤活性*

李祥華，王學敏，徐辰俊，黃俊凱，何黎琴**，凌 勇**

1安徽中醫(yī)藥大學，安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，合肥 230031；2南通大學藥學院，南通 226001

NO供體型吉西他濱衍生物的設計、合成及其抗腫瘤活性*

李祥華1，王學敏2，徐辰俊2，黃俊凱1，何黎琴1**，凌 勇2**

1安徽中醫(yī)藥大學，安徽省現(xiàn)代中藥重點實驗室，合肥 230031；2南通大學藥學院，南通 226001

在吉西他濱（gemcitabine）的N4位偶聯(lián)上不同的二醇取代的苯磺酰基呋咱氮氧化物，設計合成了10個新型NO供體型吉西他濱衍生物9a～9e和10a～10e。體外抗腫瘤活性結(jié)果表明，化合物9b～9d和10b～10d顯示較強的抗腫瘤活性，尤其化合物10c不僅對HepG2、HCT116和SW620抗增殖活性（IC50=2.44～3.57 μmol·L-1）強于吉西他濱（IC50=3.87～7.52 μmol· L-1），而且釋放出高濃度的NO。然而，加入NO清除劑后10c的抗腫瘤活性降低了近50%，提示NO供體型衍生物的抗腫瘤作用與NO釋放有關。

一氧化氮；苯磺?；辉郏患魉麨I；抗腫瘤活性

惡性腫瘤是當今危害人類健康最重要的疾病之一，近年來現(xiàn)有的抗腫瘤藥物在腫瘤治療方面仍然存在著局限性[1]。臨床上各種核苷類藥物廣泛地應用于癌癥的治療，其中吉西他濱是一種周期特異性抗代謝核苷類藥物[2]，主要用于胰腺癌、膀胱癌、乳腺癌及其他實體腫瘤的治療[3-7]。然而，在臨床使用過程中存在如下缺點：脂溶性差、跨膜能力差；容易被脫氨酶降解失活，從而導致半衰期短，生物利用度低等[8]。因此，本課題組基于吉西他濱在臨床使用過程中存在的不足，設計及合成新型吉西他濱衍生物具有重要意義。

文獻報道[9-10]，吉西他濱的修飾主要是針對吉西他濱嘧啶環(huán)上的N4氨基進行修飾，使其形成酰胺鍵。例如，口服N4位丙戊酸修飾的吉西他濱（LY2334737，見圖1-1）已經(jīng)進入臨床Ⅰ期試驗，LY2334737可以避免吉西他濱進入體內(nèi)后的快速降解，并且可以耐受胃腸道不同的酸堿環(huán)境[11-12]。吉西他濱N4氨基引入十八烷基的C18dFdC（見圖1-2），不僅可以避免被體內(nèi)的脫氨酶降解，而且可以改善吉西他濱在體內(nèi)代謝的生物利用度[13]。

NO作為重要的信使物質(zhì)和效應分子在生理和病理過程扮演一個關鍵的角色[14]。文獻報道，高濃度的NO不僅可以誘導細胞凋亡，抑制腫瘤細胞轉(zhuǎn)移，而且對化療、免疫治療、放療的腫瘤細胞更加敏感[15-16]。在NO供體型衍生物中，選擇能夠產(chǎn)生高濃度NO的苯磺?；辉鄣趸镒鳛镹O供體，不僅具有較好的親脂性，而且能抑制腫瘤細胞的生長[17-19]。基于上述的研究，將苯磺?；辉酆图魉麨I通過丁二酸偶聯(lián)獲得目標化合物9a～9e和10a～10e，期望能釋放高濃度的NO，進一步提高吉西他濱衍生物的抗腫瘤效果。

圖1 吉西他濱衍生物化學結(jié)構(gòu)式

1 合成路線

目標化合物9a～9e和10a～10e具體合成路線如圖2所示。首先5a～5e參照文獻合成方法[17，20]，以苯硫酚1為原料，在氫氧化鈉作用下，加入碳酸鈉和氯乙酸的混合溶液，得到白色棒狀晶體化合物2；化合物2與30%的過氧化氫反應，以冰醋酸作為溶劑得到化合物3；然后化合物3與95%的發(fā)煙硝酸反應，得到白色針狀晶體化合物4。化合物4與不同取代基的二醇在氫氧化鈉作用下，反應得到化合物5a～5e；化合物5a～5e與丁二酸酐在縮合劑4-二甲氨基吡啶（DMAP）作用下，反應生成化合物6a～6e；7與二碳酸二叔丁酯（Boc2O）以氫氧化鉀作為縛酸劑，反應得到化合物8；化合物6a～6e與8在N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（EDCI）、4-二甲氨基吡啶（DMAP）作用下得到目標化合物9a～9e；化合物9a～9e在三氟乙酸（TFA）作用下，脫保護得到目標化合物10a～10e。

圖2 目標化合物9a～9e和10a～10e具體合成路線圖

2 實驗部分

2.1 化學實驗

XT4A型熔點儀（北京科儀電光儀器廠）；Nicolet Avatar 370 DTGS型紅外光譜儀 （美國 Thermo Electron公司）；Brucker AV-300型核磁共振儀（瑞士Brucker公司）；HP 1100LC/MSD質(zhì)譜儀（美國Agi-lent公司）；Elementar Vario ELⅢ型元素分析儀（德國Elementar公司）；GF254色譜硅膠 （青島海洋化工廠）；試劑均為市售化學純或分析純產(chǎn)品。吉西他濱（連云港金康醫(yī)藥科技有限公司，純度大于98%）。

4-（2-（（3-羧基丙基）氧基）乙氧基）-3-（苯基磺酰基）-1，2，5-噁二唑-2-氧化物（6a）

將5a（0.29g，1.00mmol）、DMAP（0.06g，0.50mmol）及1，4-丁二酸酐（0.12 g，1.20 mmol）加入50 mL圓底燒瓶，以二氯甲烷為溶劑，加畢，油浴回流反應。反應5 h后薄層色譜（TLC）檢測(乙酸乙酯-石油醚，4∶1）反應完全。停止攪拌，室溫冷卻后將反應液傾入50 mL水中，二氯甲烷（3×30 mL）萃取，合并有機層并用飽和氯化鈉水洗一次，無水硫酸鈉干燥。過濾、濾液減壓濃縮至干，得到淡黃色固體，產(chǎn)率90.0%。MS（ESI）m/z 387[M+H]+。

4-（2-（（3-羧基丙基）氧基）丙氧基）-3-（苯基磺酰基）-1，2，5-噁二唑-2-氧化物（6b）

參照6a的合成方法，5b代替5a與1，4-丁二酸酐、DMAP反應最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率92.0%。MS（ESI）m/z 401[M+H]+。

4-（2-（（3-羧基丙基）氧基）丁氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（6c）

參照6a的合成方法，5c代替5a與1，4-丁二酸酐、DMAP反應最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率88.0%。MS（ESI）m/z 415[M+H]+。

4-（（4-（（3-羧基丙）氧基）丁-2-基）氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（6d）

參照6a的合成方法，5d代替5a與1，4-丁二酸酐、DMAP反應最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率85.0%。MS（ESI）m/z 415[M+H]+。

4-（2-（（3-羧基丙基）氧基）戊氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（6e）

參照6a的合成方法，5e代替5a與1，4-丁二酸酐、DMAP反應最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率91.5%。MS（ESI）m/z 429[M+H]+。

4-氨基-1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁氧基羰基）氧基）-5-（（（叔丁氧基羰基）氧基）甲基）-3，3-二氟-四氫呋喃-2-基）嘧啶-2-（1H）-酮（8）

將7（2.63 g，10.00 mmol）溶于2 mol·L-1KOH（80 mL）中，冰浴條件下進行攪拌，將 Boc2O（10.90 g，50.00 mmol）溶于四氫呋喃（80 mL）中，N2保護下將其緩慢滴加至7的混合溶液中，滴加完畢，撤除冰浴恢復室溫反應2 h，減壓蒸出四氫呋喃，并將其傾入200 mL水中，乙酸乙酯（3×50 mL）萃取，合并有機層制砂過柱純化（二氯甲烷-甲醇，50∶1～20∶1），得到白色固體，產(chǎn)率88.6%。MS（ESI）m/z 464[M+H]+。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁氧基羰基）氧基）-5-（（（叔丁氧基羰基）氧基）甲基）-3，3-二氟-四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁酰基）氧基）乙氧基）-3-（苯基磺酰基）-1，2，5-噁二唑-2-氧化物（9a）

將 6a（0.19 g，0.50 mmol）、NHS（0.07 g，0.60 mmol）、EDCI（0.12 g，0.60 mmol）、DMAP（0.01 g，0.10 mmol）加入50 mL圓底燒瓶，以無水CH2Cl2為溶劑加畢，常溫條件下N2保護進行反應。反應2 h后TLC檢測（石油醚-乙酸乙酯，1∶4）反應完全。將8（0.25 g，0.50 mmol）在N2保護下緩慢加入反應液中，常溫條件下進行反應18 h后，TLC檢測 （石油醚-乙酸乙酯，1∶1）反應完全。停止攪拌，后將反應液傾入50 mL水中，二氯甲烷（3×30 mL）萃取，合并有機層制砂過柱純化（石油醚-乙酸乙酯，5∶1～1∶1），得淡黃色固體，產(chǎn)率52.0%。IR（KBr，cm-1）：3460，2929，2848，1663，1619，1552，1447，1162；mp：142～145℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.18（s，1H，NH），8.20（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.00（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.73（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.21（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.22（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），5.76（m，1H，NCH），5.31（m，1H，OCH），4.59（m，2H，OCH2），4.40（m，2H，OCH2），3.98（m，1H，OCH），3.80（m，1H，CH2O），3.65（m，1H，CH2O），2.74（m，2H，OCCH2），2.63（m，2H，OCCH2），1.26（s，18H，6×CH3）；MS（ESI）m/z 832[M+H]+；C33H39F2N5O16S元素分析，理論值：C，47.65；H，4.73；N，8.42；實測值：C，47.50；H，4.87；N，8.30。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁氧基羰基）氧基）-5-（（（叔丁氧基羰基）氧基）甲基）-3，3-二氟-四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┍趸?3-（苯基磺酰基）-1，2，5-噁二唑-2-氧化物（9b）

參照 9a的合成方法，6b代替 6a與 NHS、DMAP、EDCI及8反應，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率57.0%。IR（KBr，cm-1）：3487，2925，2833，1661，1618，1562，1448，1160；mp：158～160℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.16（s，1H，NH），8.24（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.09（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.82（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.26（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.36（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.18（m，1H，NCH），5.37（m，1H，OCH），4.42（m，2H，OCH2），4.09（m，2H，OCH2），3.89（m，1H，OCH），3.83（m，1H，CH2O），3.60（m，1H，CH2O），2.67（m，2H，OCCH2），2.58（m，2H，OCCH2），2.16（m，2H，CH2），1.26（s，18H，6×CH3）；MS（ESI）m/z 846[M+H]+；C34H41F2N5O16S元素分析，理論值：C，48.28；H，4.89；N，8.28；實測值：C，48.39；H，5.02；N，8.12。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁氧基羰基）氧基）-5-（（（叔丁氧基羰基）氧基）甲基）-3，3-二氟-四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┒⊙趸?3-（苯基磺酰基）-1，2，5-噁二唑-2-氧化物（9c）

參照 9a的合成方法，6c代替 6a與 NHS、DMAP、EDCI及8反應，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率51.0%。IR（KBr，cm-1）：3400，2939，2874，1698，1622， 1557，1453，1161；mp：165～166℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.17（s，1H，NH），8.26（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.06（d，J=7.5 Hz，1H，CH=CHN），7.88（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.27（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.35（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.19（m，1H，NCH），5.36（m，1H，OCH），4.47（m，2H，OCH2），4.06（m，2H，OCH2），3.88（m，1H，OCH），3.82（m，1H，CH2O），3.64（m，1H，CH2O），2.74（m，2H，OCCH2），2.61（m，2H，OCCH2），1.82（m，2H，CH2），1.67（m，2H，CH2），1.28（s，18H，6× CH3）；MS（ESI）m/z 860[M+H]+；C35H43F2N5O16S元素分析，理論值：C，48.89；H，5.04；N，8.15；實測值：C，48.72；H，5.19；N，8.03。

4-（（4-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁氧基羰基）氧基）-5-（（（叔丁氧基羰基）氧基）甲基）-3，3-二氟四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┒?2-基）氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（9d）

參照9a的合成方法，6d代替6a與NHS、DMAP、EDCI及8反應，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率53.0%。IR（KBr，cm-1）：3450，2928，2852，1664，1613，1496，1448，1150；mp：144～146℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.12（s，1H，NH），8.29（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.02（d，J=7.5Hz，1H，CH=CHN），7.87（t，1H，J=7.5Hz，Ar-H），7.29（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.34（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.16（m，1H，NCH），5.39（m，1H，OCH），4.37（m，2H，OCH2），4.02（m，1H，OCH），3.87（m，1H，OCH），3.79（m，1H，CH2O），3.62（m，1H，CH2O），2.79（m，2H，OCCH2），2.59（m，2H，OCCH2），1.87（m，2H，CH2），1.29（s，18H，6×CH3），1.22（m，3H，CH3）；MS（ESI）m/z 860 [M+H]+；C35H43F2N5O16S元素分析，理論值：C，48.89；H，5.04；N，8.15；實測值：C，48.72；H，5.22；N，8.01。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-4-（（叔丁基二甲基甲硅烷基）氧基）-5-（（（叔丁基二甲基甲硅烷基）氧基）甲基）-3，3-二氟-四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┪煅趸?3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（9e）

參照 9a的合成方法，6f代替 6a與 NHS、DMAP、EDCI及8反應，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率59.0%。IR（KBr，cm-1）：3469，2922，2853，1677，1615，1551，1447，1165；mp：172～174℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.12（s，1H，NH），8.26（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.02（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.88（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.24（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.36（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.18（m，1H，NCH），5.34（m，1H，OCH），4.49（m，2H，OCH2），4.12（m，2H，OCH2），3.87（m，1H，OCH），3.82（m，1H，CH2O），3.68（m，1H，CH2O），2.79（m，2H，OCCH2），2.56（m，2H，OCCH2），1.82（m，2H，CH2），1.64（m，2H，CH2），1.53（m，2H，CH2），1.26（s，18H，6×CH3）；MS（ESI）m/z 874[M+H]+；C26H29F2N5O12S元素分析，理論值：C，49.48；H，5.19；N，8.01；實測值：C，49.26；H，5.38；N，7.90。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-3，3-二氟-4-羥基-5-（羥甲基）四氫呋喃-吡啶-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┮已趸?3-(苯基磺酰基）-1，2，5-噁二唑-2-氧化物（10a）

將9a（0.20 g，0.23 mmol）溶于5 mL無水二氯甲烷溶液中，緩慢滴加0.5 mL TFA，冰浴條件下反應0.5 h，TLC檢測原料點反應完全，減壓蒸出反應液溶劑，粗品通過柱層析純化（二氯甲烷-甲醇，50∶1～20∶1）得到淡黃色固體，產(chǎn)率86.7%。IR（KBr，cm-1）：3465，2927，2844，1662，1617，1558，1445，1160；mp：172～175℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.10（s，1H，NH），8.24（d，2H，J=7.5Hz，Ar-H），8.02（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.90（t，1H，Ar-H），7.24（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.34（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.13（m，1H，NCH），5.33（m，1H，HOCH），4.48（m，2H，OCH2），4.42（m，2H，OCH2），3.89（m，1H，OCH），3.80（m，1H，CH2OH），3.65（m，1H，CH2OH），2.78（m，2H，OCCH2），2.58（m，2H，OCCH2）；MS（ESI）m/z 632[M+H]+；C23H23F2N5O12S元素分析，理論值：C，43.74；H，3.67；N，11.09；實測值：C，43.53；H，3.77；N，11.21。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-3，3-二氟-4-羥基-5-（羥甲基）四氫呋喃-吡啶-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁酰基）氧基）丙氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（10b）

參照10a的合成方法，9b代替9a與TFA的二氯甲烷溶液反應，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率82.8%。IR（KBr，cm-1）：3481，2927，2830，1663，1616，1560，1444，1160；mp：182～185℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.18（s，1H，NH），8.26（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.07（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.88（t，1H，J=7.5Hz，Ar-H），7.29（d，2H，J=7.5Hz，Ar-H），6.32（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.16（m，1H，NCH），5.30（m，1H，HOCH），4.43（m，2H，OCH2），4.06（m，2H，OCH2），3.88（m，1H，OCH），3.82（m，1H，CH2OH），3.61（m，1H，CH2OH），2.68（m，2H，OCCH2），2.56（m，2H，OCCH2），2.11 （m，2H，CH2）；MS （ESI）m/z 646[M+H]+；C24H25F2N5O12S元素分析，理論值：C，44.65；H，3.90；N，10.85；實測值：C，44.38；H，4.08；N，11.00。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-3，3-二氟-4-羥基-5-（羥甲基）四氫呋喃-吡啶-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁酰基）氧基）丁氧基）-3-（苯基磺?；?1，2，5-噁二唑-2-氧化物（10c）

參照10a的合成方法，9c代替9a與TFA的二氯甲烷溶液反應，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率81.6%。IR（KBr，cm-1）：3407，2934，2876，1696，1624，1559，1454，1165；mp：205～208℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.12（s，1H，NH），8.23（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.02（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.89（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.23（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.33（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.17（m，1H，NCH），5.31（m，1H，HOCH），4.41（m，2H，OCH2），4.08（m，2H，OCH2），3.89（m，1H，OCH），3.80（m，1H，CH2OH），3.65（m，1H，CH2OH），2.72（m，2H，OCCH2），2.60（m，2H，OCCH2），1.80（m，2H，CH2），1.68（m，2H，CH2）；MS（ESI）m/z 660[M+H]+；C25H27F2N5O12S元素分析，理論值：C，45.52；H，4.13；N，10.62；實測值：C，45.29；H，4.28；N，10.80。

4-（（4-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-3，3-二氟-4-羥基-5-（羥甲基）四氫呋喃-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┒?2-基）氧基）-3-（苯基磺酰基）-1，2，5-噁二唑-2-氧化物（10d）

參照10a的合成方法，9d代替9a與TFA的二氯甲烷溶液反應，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率86.3%。IR（KBr，cm-1）：3455，2927，2856，1668，1614，1499，1444，1152；mp：195～197℃；1H NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.16（s，1H，NH），8.27（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.04（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.86（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.28（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.39（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.12（m，1H，NCH），5.36（m，1H，HOCH），4.38（m，2H，OCH2），4.00（m，1H，OCH），3.83（m，1H，OCH），3.80（m，1H，CH2OH），3.67（m，1H，CH2OH），2.77（m，2H，OCCH2），2.57（m，2H，OCCH2），1.89（m，2H，CH2），1.21（m，3H，CH3）；MS（ESI）m/z 660[M+H]+；C25H27F2N5O12S元素分析，理論值：C，45.52；H，4.13；N，10.62；實測值：C，45.79；H，4.27；N，10.82。

4-（2-（（4-（（1-（（2R，4R，5R）-3，3-二氟-4-羥基-5-（羥甲基）四氫呋喃-吡啶-2-基）-2-氧代-1，2-二氫嘧啶-4-基）氨基）-4-氧代丁?；┭趸┪煅趸?3-（苯基磺酰基）-1，2，5-噁二唑-2-氧化物（10e）

參照10a的合成方法，9e代替9a與TFA的二氯甲烷溶液反應，最終得到淡黃色固體，產(chǎn)率77.8%。IR（KBr，cm-1）：3466，2929，2858，1672，1618，1552，1447，1162；mp：218～220℃；1H-NMR（DMSO-d6，300 MHz）δ：11.11（s，1H，NH），8.25（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），8.03（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），7.87（t，1H，J=7.5 Hz，Ar-H），7.26（d，2H，J=7.5 Hz，Ar-H），6.34（d，1H，J=7.5 Hz，CH=CHN），6.19（m，1H，NCH），5.32（m，1H，HOCH），4.47（m，2H，OCH2），4.11（m，2H，OCH2），3.89（m，1H，OCH），3.82（m，1H，CH2OH），3.66（m，1H，CH2OH），2.78（m，2H，OCCH2），2.55（m，2H，OCCH2），1.83（m，2H，CH2），1.62（m，2H，CH2），1.52（m，2H，CH2）；MS（ESI）m/z 674[M+H]+；C26H29F2N5O12S元素分析，理論值：C，46.36；H，4.34；N，10.40； 實測值：C，46.11；H，4.42；N，10.58。

2.2 藥理活性實驗

2.2.1 MTT法 參照ATCC（American Type Cul-true Collection）相關說明，將含每孔2×104～4×104個人源腫瘤細胞株包括人肝癌細胞（HepG2），人結(jié)腸癌細胞（HCT116，SW620），人胃癌細胞（SGC7901），所有細胞均培養(yǎng)于含10%熱滅活胎牛血清，青霉素100 U·mL-1和鏈霉素100 U·mL-1的RPMI1640培養(yǎng)基或DMEM細胞培養(yǎng)基的96孔板中，過夜。加入含有不同濃度的受試化合物，吉西他濱作為陽性對照藥，37℃、5%CO2培養(yǎng)48 h。加入5 mg·mL-1噻唑藍（MTT）溶液于96孔板中的細胞孔中，每孔30 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h。棄上清液，加150 μL/孔二甲亞砜（DMSO），平板搖床上振搖10 min。用酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀在波長為570 nm處測定每孔的吸光度，分別計算各濃度下的細胞抑制率。用LOGIT法（Graph Pad Prism Version 4.03軟件）計算受試化合物IC50。

2.2.2 體外NO釋放實驗 參照NO試劑盒相關說明，采用Griess重氮化反應法測試了目標化合物NO的釋放量[21]。HepG2和HCT116細胞培養(yǎng)過程參照“2.2.1”的實驗方法。受試化合物用DMSO溶解后用PBS稀釋，受試物濃度為10-4mol·L-1。按50 μL/孔，在96孔板中加入樣品。于300 min時間點離心沉淀取上清液，在各孔中加入Griess試劑，室溫放置10 min，在540 nm處測吸收值，根據(jù)標準曲線計算NO濃度。NO的釋放量以其相當于硝酸鹽（NO3-）/亞硝酸鹽（NO2-）的量表示。

2.2.3 NO清除劑阻滯實驗 HepG2細胞培養(yǎng)過程參照“2.2.1”的實驗方法，受試化合物所選濃度為5、10 μmol·L-1。Hemoglobin相對于受試化合物提前1 h加入培養(yǎng)基中，且分別采用 0、1、5、10 μmol·L-1Hemoglobin未見顯著的細胞毒性。受試化合物處理48 h后，檢測并計算細胞抑制率。

3 結(jié)果與討論

3.1 化合物9a～9e和10a～10e體外細胞增殖抑制活性

通過MTT法測試化合物9a～9e和10a～10e對4種人癌細胞 系 HepG2、HCT116、SGC7901和SW620抑制活性，以吉西他濱作為陽性對照。如表1所示，化合物9b～9d和10b～10d顯示較強的抗腫瘤活性，尤其目標物10c對HepG2、HCT116和SW620抗腫瘤活性（IC50=2.44～3.57 μmol·L-1）強于吉西他濱（IC50=3.87～7.52 μmol·L-1）。

表1 化合物9a～e和10a～e體外細胞增殖抑制活性

3.2 化合物9b～9d和10b～10e體外NO釋放檢測

為考察NO供體型衍生物的NO釋放與其抗腫瘤活性之間的關聯(lián)，選擇9b～9d、10b～10e和吉西他濱測定了它們的體外NO釋放，如圖3所示。發(fā)現(xiàn)細胞毒性最強化合物10c的NO釋放量最大，在300 min時達到最大值28.6 μmol·L-1；而細胞毒性相對較弱的化合物9b～9d、10e的NO釋放量較低。此結(jié)果與文獻報道[22]的高濃度NO對腫瘤細胞具有較強細胞毒作用的結(jié)論是一致的。

圖3 NO供體型衍生物9b～9d和10a～10e體外NO釋放檢測

3.3 NO清除劑對NO供體型吉西他濱衍生物10c活性的阻滯作用

為了進一步闡明化合物10c細胞毒性與NO釋放的相關性，考察了NO釋放較高的10c其NO釋放水平與抑制HepG2細胞之間的關系。如圖4所示，選取5、10 μmol·L-1的10c在細胞培液中加入不同濃度 0、1、5、10 μmol·L-1的 NO清除劑 Ho-moglobin。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Homoglobin能劑量依賴性地促使目標物10c的細胞抑制率下降，在Homoglobin最大劑量下能夠使得10c的抗腫瘤活性降低50%，提示NO供體型衍生物的抗腫瘤作用與NO釋放有關。

圖4 Homoglobin對NO供體型吉西他濱衍生物10c活性抑制

3.4 構(gòu)效關系研究

根據(jù) NO供體型吉西他濱衍生物 9a～9e和10a～10e抗腫瘤活性發(fā)現(xiàn)，連接鏈的長短和Boc基團對偶聯(lián)物的抗腫瘤活性有較大影響。例如，在不同鏈長的二醇化合物中，發(fā)現(xiàn)鏈長為3～4個碳鏈較其它長度的連接片段具有更強的體外抗腫瘤活性；此外，發(fā)現(xiàn)脫保護的化合物10a～e的體外抗腫瘤活性明顯強于未脫保護的化合物9a～9e。

4 小 結(jié)

本研究設計合成了一系列NO供體型吉西他濱衍生物9a～9e和10a～10e，體外抗腫瘤實驗表明，大部分化合物具有較強的抗腫瘤活性，尤其是化合物10c不僅展現(xiàn)抗增殖活性強于吉西他濱，而且能釋放高濃度的NO。NO清除劑hemoglobin能夠明顯降低了10c對HepG2細胞近50%的抑制率，表明NO供體型衍生物發(fā)揮體外抗腫瘤活性與高濃度的NO釋放密切相關。

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2015年3月美國FDA公布的藥品安全信息

1 FDA要求限制睪酮藥物的使用，警惕其心血管風險

FDA認為，睪酮治療對于年齡相關的低睪酮水平男性并不合適，因為它可能與心血管事件風險增加相關。

FDA當局要求修改所有睪酮類產(chǎn)品的藥品標簽，明確它們的合理使用范圍。FDA同時警告稱“任何使用這種激素的患者都存在心臟病發(fā)作和中風風險增加的可能性”。睪酮僅被批準用于特殊疾病狀況的男性，但現(xiàn)在這類療法被超標簽地用于年齡相關的低睪酮水平男性患者中已是一種普遍情況。

低睪酮（low testosterone）即“Low T”處方量在過去10年來猛漲，這主要是由于與年齡增長相關的低睪酮水平中年男性對這類處方藥使用量的增加所致。隨著年齡增長，睪丸功能減退，導致男性睪酮水平逐漸下降。低睪酮的癥狀包括性欲減退、肌肉質(zhì)量下降、疲勞及抑郁。

根據(jù)FDA公布的數(shù)據(jù)，從2009至2013年，處方睪酮藥物的男性患者數(shù)量激增75%至230萬例，其中70%患者年齡在40～64歲之間。FDA此次發(fā)布的條令，將禁止制藥商在年齡相關性低睪酮群體中營銷或推廣其產(chǎn)品。

根據(jù)從研究和FDA顧問委員會所獲得的證據(jù)，F(xiàn)DA認為使用睪酮類產(chǎn)品可能會增加心血管風險。這些研究包括了老年男性使用睪酮治療。有些研究認為使用睪酮治療會增加心臟病、中風或死亡的風險，但也有些研究報告不這樣認為。具體細節(jié)可查閱《FDA安全通告》的資料匯總。

FDA僅批準睪酮類藥品用于替代治療因睪丸、腦垂體或腦部疾病引起性腺機能減退而導致的睪酮水平低下。但該藥品的實際使用范圍被擴大為緩解因年齡因素導致睪酮水平降低而產(chǎn)生的癥狀——而這種用法的效益和安全性還有待研究。

FDA建議醫(yī)療專業(yè)人員僅對由于疾病因素導致的、并且經(jīng)過實驗室檢查確定的睪酮水平低下的男性患者使用睪酮類產(chǎn)品。在決定開始或繼續(xù)使用睪酮類產(chǎn)品時，應讓患者知道可能會增加心血管風險?；颊咴谑褂迷擃惍a(chǎn)品后出現(xiàn)心臟病或中風的癥狀時應立即就醫(yī)，如：胸痛、呼吸急促或呼吸困難、身體部分或一側(cè)無力，或口齒不清。

2 戒必適（瓦倫尼克林，Chantix）或與癲癇和降低酒精耐受性相關

FDA發(fā)出警示，憑處方銷售的戒煙藥戒必適（瓦倫尼克林）可能會改變使用者對酒精的耐受性。戒必適與酒精的相互作用會導致一些人醉酒加重，有時會伴有攻擊性行為和（或）健忘。另外，有報道稱極少數(shù)患者在使用戒必適治療時出現(xiàn)癲癇。FDA已要求戒必適修改標簽，加入上述風險的警告內(nèi)容。

戒必適是FDA批準用于幫助成人戒煙的處方藥。該藥由美國輝瑞公司生產(chǎn)，于2006年被FDA批準上市。此前，F(xiàn)DA已要求廠家更新過標簽說明，并附帶了一份黑框警告說明，突出說明了該藥物對神經(jīng)、精神方面的潛在副作用，包括自殺念頭、攻擊性和焦慮。

醫(yī)療專業(yè)人員在給患者使用戒必適之前，應權衡癲癇的風險和潛在的收益，尤其對有癲癇史或其他因素可能降低癲癇發(fā)作閾的患者。應告知患者在使用戒必適期間感覺煩亂、產(chǎn)生敵意、有攻擊性行為，情緒低落、行為或想法與往常不同、有自殺的想法或行為時需立即停藥。

除非清楚戒必適對其酒精耐受的影響程度，患者都應該減少酒精的攝入量。當患者使用戒必適期間發(fā)生癲癇，應立即停藥并進行治療。

（由江蘇省藥品不良反應監(jiān)測中心提供）

Synthesis and Biological Evaluation of Nitric Oxide-releasing Hybrids of Gemcitabine and Phenylsulfonyl Furoxans as Anti-tumor Agents*

LI Xiang-hua1,WANG Xue-min2,XU Chen-jun2, HUANG Jun-kai1,HE Li-qin1**,LING Yong2*
1Anhui Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine,Anhui University of Chinese Medicine, Hefei 230031,China;2School of Pharmacy,Nan-tong University,Nantong,226001,PR China

A series of novel gemcitabine derivatives 9a-9e and 10a-10e were designed and synthesized by coupling phenylsulfonyl furoxans with gemcitabine through various diol linkers,and their biological activities were evaluated in vitro. Compounds 9b-9d and 10b-10d exhibited more potentanticanceractivities.Especially,compound 10c showed excellentanti-proliferative activities (IC50=2.44-3.57 μmol·L-1)which were better than gemcitabine(IC50=3.87-7.52 μmol·L-1).However,the inhibitory rates of 10c partially reduced by pretreatment with hemoglobin,demonstrating that their anticancer activities were associated with their NO release.

Nitric oxide;Phenylsulfonyl furox-ans;Gemcitabine;Anti-tumor activity

R914.5；R979.1

A

1673-7806（2015）02-097-07

國家自然科學基金（No.81302628）；安徽省教育廳自然科學重點科研項目（No.KJ2013A168）；江蘇省自然科學基金（No.BK2011389）

李祥華，男，碩士生 E-mail:lixianghua28@yeah.net

**通訊作者何黎琴，女，教授 E-mail:Hlq661125@126.com凌勇，男，副教授 E-mail:lyyy111@sina.com

2015-03-02

2015-03-20