常溫與高溫嗜油微生物的異同比較分析

常溫與高溫嗜油微生物的異同比較分析

李琳，羅明志，周遠(yuǎn)群，徐文碩，張強(qiáng)，邱國(guó)華，鄧林紅*

(常州大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)工程與健康科學(xué)研究院常州市呼吸醫(yī)學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 常州 213164)

摘要：石油污染的環(huán)境中存在可以降解石油烴的微生物.比較了高溫微生物(包括嗜油菌)和常溫微生物在菌體細(xì)胞的形態(tài)、結(jié)構(gòu)、生理生化的性質(zhì)、DNA(基因組)和蛋白質(zhì)(蛋白質(zhì)組)等方面的異同，并總結(jié)了一些高溫微生物可能的適應(yīng)機(jī)制，以期有助于進(jìn)一步提高高溫嗜油菌的應(yīng)用潛力.

關(guān)鍵詞：高溫微生物；常溫微生物；嗜油菌

中圖分類(lèi)號(hào)：Q932文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1008-5564(2015)03-0047-03

收稿日期：2015-02-03

基金項(xiàng)目：小麥精準(zhǔn)量化栽培技術(shù)研究及示范推廣項(xiàng)目(NC1306)

作者簡(jiǎn)介：張選厚(1964—)，男，陜西藍(lán)田人，陜西省西安市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心研究員，主要從事作物高產(chǎn)栽培技術(shù)研究與推廣.

ComparativeAnalysisonSimilaritiesandDifferencesofOilMicroorganismsatNormalandHighTemperature

LILin,LUOMing-zhi,ZHOUYuan-qun,XUWen-shuo,ZHANGQiang,QIUGuo-hua,DENGLin-hong

(ChangzhouKeyLaboratoryofRespiratoryMedicalEngineering,InstituteofBiomedicalEngineeringand

HealthSciencesofChangzhouUniversity,Changzhou213164,China)

Abstract：Microorganisms that can degrade petroleum hydrocarbons exist in the petroleum pollution environment.In this paper, similarities and differences of morphology, structure, physiological and biochemical properties, DNA (genome) and proteins (proteomics) of bacterial cells were compared for high temperature microorganisms (including oil bacteria) and normal temperature microorganisms, and some possible adaptation mechanisms of high temperature microorganisms were summarized to improve the potential application of oil bacteria at high temperature.

Keywords：hightemperaturemicroorganisms;normaltemperaturemicroorganisms;oilbacteria

石油微生物在石油開(kāi)采和含油污水的處理領(lǐng)域具有重要意義[1].在石油開(kāi)采方面，傳統(tǒng)的物理及化學(xué)采油方法缺點(diǎn)較多，如工藝復(fù)雜、成本高以及污染嚴(yán)重，特別是采收率低,僅60%～70%以上的原油在開(kāi)采后仍殘留于油藏中無(wú)法開(kāi)采，這些殘留的主要成分是重質(zhì)原油[2].嗜油菌可以使原油的組分和性質(zhì)發(fā)生變化(輕質(zhì)組分增加、粘度下降)，從而改善原油的流動(dòng)性；嗜油菌還可以產(chǎn)生有機(jī)溶劑、表面活性劑、酸和氣體等驅(qū)油物質(zhì)，提高驅(qū)油效率，從而提高原油的采收率.

微生物也被廣泛用于含油污水的處理.在采油、煉油、貯油及運(yùn)輸?shù)冗^(guò)程中產(chǎn)生大量含油污水，如果不加處理直接排入河流、湖泊或海灣，會(huì)對(duì)人類(lèi)、動(dòng)物和植物以及整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重危害，影響工業(yè)、農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)、養(yǎng)殖業(yè)和旅游業(yè)發(fā)展.尤其是石油中含有致癌烴，可被魚(yú)、貝富集并通過(guò)食物鏈危害人體健康[3].

目前，含油污水的處理方法很多，包括物理、化學(xué)和生物(如嗜油菌)等方法.其中嗜油菌方法費(fèi)用低、效率高，而且所能處理的污染物閾值低、殘留少，被視為一項(xiàng)具有廣闊前景的高新技術(shù)，是目前環(huán)境科學(xué)研究的熱點(diǎn)[4].

在土壤和水體中存在著大量能夠降解石油烴類(lèi)化合物的微生物[1,4]，目前已分離多個(gè)屬的細(xì)菌可利用原油或原油的某一組分為唯一碳源生長(zhǎng)，特別是在受油污染的水和沉積物中(比未受污染地區(qū)高出1～2個(gè)數(shù)量級(jí))，有70多個(gè)屬，140余種，包括細(xì)菌、放線(xiàn)菌、霉菌、酵母等，較為常見(jiàn)的有紅球菌屬[5]、假單胞菌屬[6]、不動(dòng)桿菌屬[6]、無(wú)色桿菌屬、產(chǎn)堿桿菌屬、節(jié)桿菌屬、芽孢桿菌屬、黃桿菌屬、棒桿菌屬、微桿菌屬、微球菌屬、放線(xiàn)菌屬、諾卡氏菌屬、分枝桿菌屬等等；真菌有：曲霉屬、毛霉屬、鐮刀霉屬、青霉屬、木霉屬和被孢霉屬；酵母菌有假絲酵母屬、紅酵母屬、球擬酵母屬和酵母屬[7].

但這類(lèi)常溫石油降解菌的最適溫度一般是15～50℃[8-9]，無(wú)法滿(mǎn)足更高溫度的要求，如沙漠土壤、半干旱的炎熱地區(qū)的油田和更深更熱的油井，以及高溫含油污水的處理等，因此很多學(xué)者開(kāi)始研究降解石油的高溫菌，其最適溫度一般在50～80℃之間，有的甚至能達(dá)到100℃以上[9].高溫菌可以分離自火山島[10]、草堆、煤堆、溫泉、地?zé)釁^(qū)土壤以及高溫油田原油樣品和油層采出水[11].目前已報(bào)道的有嗜熱嗜油桿菌屬[12]、熱微菌屬、芽孢桿菌屬、地芽孢桿菌屬、棲熱菌屬、嗜熱古細(xì)菌、硫礦硫化葉菌、嗜熱細(xì)菌中的海棲熱袍菌等.目前，在石油污水處理中應(yīng)用較多的是常溫嗜油菌，但在實(shí)際的處理過(guò)程中卻遇到了一些問(wèn)題.比如在污水處理工藝中，原油經(jīng)過(guò)三相分離之后的含油污水溫度為50～60 ℃，所以要在用常溫微生物進(jìn)一步降解之前，將含油污水進(jìn)行降溫，這就消耗了大量的電能，同時(shí)會(huì)將污水中的芳香烴等致癌物質(zhì)吹入空氣中，嚴(yán)重污染空氣.直接對(duì)高溫污水進(jìn)行微生物降解處理就變得更為急迫和重要.

目前，已有不少有關(guān)高溫嗜油菌的分離、篩選和鑒定等研究工作的報(bào)道，但也存在一些實(shí)際應(yīng)用的問(wèn)題.本文首先總結(jié)了常溫和高溫嗜油菌在降解石油方面的共同點(diǎn)，然后從細(xì)胞形態(tài)特征、生理生化特性、分子水平以及蛋白質(zhì)組和基因組等方面分析了常溫菌和高溫菌，特別是常溫和高溫嗜油菌之間的不同點(diǎn)，為進(jìn)一步改良高溫嗜油菌有效性能提供理論參考.

1嗜油菌降解石油的作用機(jī)理及相關(guān)因素

嗜油菌將石油組分及其降解物作為主要的碳源和能源[13].嗜油菌產(chǎn)生的表面活性物質(zhì)先乳化分散油脂形成懸浮于水中的微小油滴；表面活性物質(zhì)還可降低油滴與嗜油菌細(xì)胞壁的表面張力，使微小油滴吸附在嗜油菌的表面，最后進(jìn)入嗜油菌體內(nèi)而被分解或積累[3].

在石油烴中，直鏈烴類(lèi)易被氧化，芳烴和環(huán)烷烴的氧化困難.單末端氧化是最主要的方式[2]，如嗜油菌對(duì)正鏈烷的氧化首先是在單氧化酶系作用下，將氧分子的一個(gè)氧原子加入到烴中，使其形成相應(yīng)的醇，另一個(gè)氧原子與烴類(lèi)脫下的氫結(jié)合形成水.正鏈烷被氧化成相應(yīng)的醇后，在脫氫酶的作用下，接著被氧化成相應(yīng)的醛和酸.脂肪酸再通過(guò)β氧化和三羧酸循環(huán)進(jìn)一步氧化成二氧化碳和水[3].

對(duì)難降解的有機(jī)物，需要有多種酶和/或多種微生物的參與，其中的一種酶或微生物的產(chǎn)物可以成為另外一種酶或微生物的底物，形成降解鏈.在高溫條件下，原油本身的粘度相對(duì)于低溫或常溫下較低，更有利于石油降解.

參與降解有機(jī)物的催化反應(yīng)過(guò)程的酶多為誘導(dǎo)酶[14].通過(guò)對(duì)銅綠假單胞菌種烷烴代謝途徑的研究發(fā)現(xiàn)幾種酶能夠同時(shí)被誘導(dǎo)合成，實(shí)現(xiàn)短鏈烷烴的氧化作用，產(chǎn)生相應(yīng)的醛和脂肪酸[15].

嗜油菌代謝的功能還可以通過(guò)同種或不同種微生物之間的遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)移而實(shí)現(xiàn)的，隨著嗜油菌降解酶的基因在環(huán)境中的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移，嗜油菌對(duì)難降解有機(jī)物的降解能力也逐漸加強(qiáng)，遺傳物質(zhì)在嗜油菌種群間的轉(zhuǎn)移是嗜油菌對(duì)難降解有機(jī)物的適應(yīng)并利用的一種主動(dòng)機(jī)制(嗜油菌的馴化過(guò)程).

2細(xì)胞表層結(jié)構(gòu)

高溫菌內(nèi)的所有物質(zhì)(脂類(lèi)、核酸和蛋白質(zhì)等大分子)都必須耐熱，才能夠維持細(xì)胞的正常生長(zhǎng)和增殖[16].這就要求它們有一些特殊的成分和/或形成特殊的結(jié)構(gòu).

細(xì)胞壁是細(xì)菌的基本結(jié)構(gòu)，是細(xì)胞表面的堅(jiān)硬外殼，保護(hù)細(xì)胞免受損傷和滲透溶解[17].在一些極端條件如高溫中生長(zhǎng)的微生物中，其細(xì)胞表面通常會(huì)覆蓋一些特殊的結(jié)構(gòu)，如嗜熱棲熱菌的胞壁在電子顯微鏡下表現(xiàn)為一個(gè)復(fù)雜的4層結(jié)構(gòu)[18]，其中一層是由聚合糖蛋白單分子有規(guī)則排列的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，稱(chēng)為S-層(表面層).此S-層作為外層保護(hù)殼，也可作為分子篩和/或細(xì)胞胞外酶粘附位點(diǎn).在細(xì)菌中，S-層與肽聚糖或外膜的次生細(xì)胞壁聚合物有關(guān).在古細(xì)菌中，S-層蛋白被錨定在細(xì)胞質(zhì)膜上形成細(xì)胞壁的主要組成部分[18-19].

3細(xì)胞膜成分

細(xì)胞膜中含有大量的脂類(lèi)，如糖脂和脂肪酸，它們的種類(lèi)、結(jié)構(gòu)和含量在常溫菌和高溫菌之間也不同[2].嗜熱古細(xì)菌的細(xì)胞膜通常含有甘油—醚鍵，而常溫菌細(xì)胞膜中含有甘油—酯鍵.醚鍵比酯鍵更穩(wěn)定，酯鍵在酸堿和熱等條件下更容易降解[20].再如，大腸桿菌在高溫下生長(zhǎng)時(shí)，細(xì)胞膜中增加的是飽和脂肪酸的含量，降低的是不飽和脂肪酸的含量.同理，在高溫細(xì)菌中，長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸含量比不飽和脂肪酸的含量高，且隨著溫度的提高，細(xì)胞膜中的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸含量隨之繼續(xù)增加.

當(dāng)生長(zhǎng)溫度從40℃提高到60℃時(shí)，嗜熱脂肪芽孢桿菌細(xì)胞膜中的16碳脂肪酸的含量增加了3～4倍，而不飽和脂肪酸含量相應(yīng)減少.水生棲熱菌在50～70℃生長(zhǎng)時(shí)，其細(xì)胞膜中增加最多的是16碳支脂肪酸，而不飽和脂肪酸的含量則降低[20].高溫細(xì)菌可能是通過(guò)細(xì)胞膜中長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸含量增加來(lái)提高機(jī)體抗熱能力.

增加細(xì)胞膜中糖脂的含量也有利于提高棲熱細(xì)菌的抗高溫能力[21].棲熱細(xì)菌生長(zhǎng)75℃時(shí)，其細(xì)胞膜中總脂含量比50℃時(shí)高70%以上，其中糖脂增加了4倍.

由此可以看出，高溫微生物能夠在高溫環(huán)境中生長(zhǎng)并繁殖，有其獨(dú)特的適應(yīng)機(jī)制，如：特殊的胞被和細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，有不同的細(xì)胞膜脂的類(lèi)型和含量，如異型脂肪酸、穩(wěn)定型脂肪酸和環(huán)烷型脂肪酸等，為耐熱菌細(xì)胞膜耐受高溫提供了有利條件.

4生理生化特性比較

4.1蛋白質(zhì)比較

高溫菌在更高的溫度下生長(zhǎng)更快，其細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和酶抵抗變性的能力更強(qiáng)[10]，這些耐熱蛋白與耐熱酶的出現(xiàn)，有利于細(xì)胞適應(yīng)高溫環(huán)境，大大增加了機(jī)體的熱穩(wěn)定性，這就是氨基酸的突變適應(yīng)[2].

對(duì)常溫和高溫菌蛋白質(zhì)的比較研究后發(fā)現(xiàn)，氫鍵、鹽橋、疏水基團(tuán)之間的相互作用和氨基酸類(lèi)型、數(shù)量被認(rèn)為是影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的重要因素.

通過(guò)比較12個(gè)不同基因組的研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自高溫菌的蛋白質(zhì)比常溫菌蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)目少，而且?guī)щ姲被岬暮窟h(yuǎn)高于常溫菌.在高級(jí)結(jié)構(gòu)中，高溫菌中帶電氨基酸的距離一般是1～4個(gè)螺旋，有較多的鹽橋和側(cè)鏈-側(cè)鏈之間的氫鍵，且鹽橋的極性方向與螺旋偶極方向一致[22].此外，對(duì)高溫菌和常溫菌之間同源蛋白質(zhì)序列比較表明，在高溫菌的蛋白質(zhì)中，精氨酸和酪氨酸更頻繁，而胱氨酸和絲氨酸在嗜熱蛋白質(zhì)更少[23-24].在系統(tǒng)分析8個(gè)高溫和12個(gè)常溫菌完整基因組的可溶性蛋白質(zhì)序列后，找出了一些影響蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性的因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相對(duì)于常溫菌來(lái)說(shuō)，高溫菌的蛋白質(zhì)大小降低，增加參與β-鏈、螺旋和氫鍵的殘基數(shù)量，顯著增加了帶電氨基酸和疏水氨基酸的數(shù)量.在嗜熱蛋白質(zhì)中帶電荷氨基酸和疏水的β-支鏈氨基酸含量比常溫蛋白質(zhì)高，而不帶電荷的極性氨基酸的含量比常溫蛋白質(zhì)低.由此可見(jiàn)，減小蛋白質(zhì)長(zhǎng)度、增加參與形成氫鍵的氨基酸殘基的數(shù)目、通過(guò)鹽橋穩(wěn)定螺旋結(jié)構(gòu)、增加β-折疊的比例都可以增強(qiáng)蛋白質(zhì)的穩(wěn)定度[25].

另一方面，有研究從高分辨率X-射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)入手，試圖找出高溫菌蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性的因素.結(jié)果顯示：(1)在高溫菌中，絲氨酸和蘇氨酸的靈活性比較低；(2)在高溫菌的蛋白質(zhì)中谷氨酸和賴(lài)氨酸的比例高，絲氨酸和蘇氨酸的比例低.這些結(jié)果反映出高溫和常溫蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的差異，因此氨基酸替換可能改變蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性[26].比較高溫和常溫菌的鐵氧還蛋白、3-磷酸甘油醛脫氫酶和乳酸脫氫酶的氨基酸序列，結(jié)果表明常溫菌中的甘氨酸、絲氨酸、賴(lài)氨酸和天冬氨酸在高溫菌中分別被丙氨酸、蘇氨酸、精氨酸和谷氨酸所取代.這些并不改變蛋白質(zhì)分子骨架構(gòu)象的細(xì)微變化卻增加了蛋白質(zhì)的耐熱性.這種效應(yīng)是由于增加了蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水作用，減少了分子表面的疏水力，同時(shí)，丙氨酸增加了螺旋的穩(wěn)定性[27].

4.2DNA比較

高溫細(xì)菌的基因組中，G+C含量通常比常溫細(xì)菌高[28]，DNA的解鏈溫度(Tm)較高[20，29]，嗜熱脂肪芽孢桿菌基因的密碼子的第三位對(duì)G/C有偏愛(ài)，有利于高溫中保持DNA分子的穩(wěn)定性，而且高溫菌DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中氫鍵的數(shù)量大于常溫菌DNA的氫鍵數(shù)[30].

線(xiàn)性DNA通過(guò)鏈的分離很容易變性，但環(huán)狀DNA分子卻能夠耐受較高的變性溫度，因此DNA雙鏈在高溫條件下維持其二級(jí)結(jié)構(gòu)是完全可能的.而且，無(wú)論是正超螺旋還是負(fù)超螺旋，都能夠進(jìn)一步增加DNA的解鏈溫度.

特殊蛋白質(zhì)結(jié)合在DNA上可增加遺傳物質(zhì)對(duì)抗熱變性.例如在嗜熱棲熱菌中，一個(gè)顯著特征是罕見(jiàn)的細(xì)胞多胺的組合物，除了正常的多胺(腐胺、亞精胺和精)，還有包括長(zhǎng)多胺和支鏈多胺，這在其他細(xì)菌中少見(jiàn)[31]，提示這些多胺在高溫下的化學(xué)反應(yīng)中的重要作用.據(jù)報(bào)道，這樣的多胺對(duì)高溫菌的蛋白質(zhì)合成的是必不可少，有助于30S核糖體亞基、mRNA和起始氨酰tRNA之間形成適當(dāng)?shù)钠鹗紡?fù)合物結(jié)構(gòu)[32].多胺也能夠有效維持RNA和DNA熱穩(wěn)定性[31-32].極端嗜熱菌中tRNA轉(zhuǎn)錄后經(jīng)過(guò)相關(guān)的修飾有利于適應(yīng)高溫環(huán)境，RNA螺旋側(cè)面突起的堿基和近端酯鍵之間的配對(duì)也能夠避免結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定性[33].

5結(jié)語(yǔ)

綜上所述，與常溫菌相比，高溫菌細(xì)胞表層具有富含蛋白質(zhì)的S-層結(jié)構(gòu)；細(xì)胞膜中的醚鍵和長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸較多；蛋白質(zhì)較短、氫鍵較多、鹽橋結(jié)構(gòu)增強(qiáng)、蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水作用增加；DNA中G+C含量較高和特殊的多胺等，這些都可能是高溫菌的生存策略.

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[責(zé)任編輯馬云彤]

Vol.18No.3Jul.2015