兔角膜堿燒傷制作人工角膜植入適應(yīng)證模型的實(shí)驗(yàn)研究

白華 王宗華 王麗強(qiáng) 黃一飛

?

·基礎(chǔ)研究·

兔角膜堿燒傷制作人工角膜植入適應(yīng)證模型的實(shí)驗(yàn)研究

白華 王宗華 王麗強(qiáng)＊黃一飛＊

目的 評(píng)估以兔角膜堿燒傷實(shí)驗(yàn)作為人工角膜植入適應(yīng)證模型的效果。方法 使用直徑為12 mm圓濾紙片蘸取濃度為1 mol/L的氫氧化鈉(NaOH)，貼于新西蘭兔(10只)角膜正中40 s，3個(gè)月后，進(jìn)行臨床、光學(xué)和電子顯微鏡檢查。結(jié)果 所有兔角膜形成帶有新生血管的角膜白斑，與臨床人工角膜患者相比，具有相似病理學(xué)特點(diǎn)，即角膜明顯增厚，呈不規(guī)則復(fù)層鱗狀上皮，基質(zhì)膠原排列紊亂，原有結(jié)構(gòu)消失，基質(zhì)層瘢痕化，充滿(mǎn)大量新生血管及炎細(xì)胞。掃描電子顯微鏡下可見(jiàn)，角膜上皮呈復(fù)層鱗狀上皮，基質(zhì)淺層可見(jiàn)炎細(xì)胞明顯，大量纖維母細(xì)胞排列。結(jié)論 用兔角膜堿燒傷可以模擬人工角膜植入的適應(yīng)證，并進(jìn)行與其相關(guān)的研究。(中國(guó)眼耳鼻喉科雜志，2015，15：324-326, 330)

人工角膜；角膜堿燒傷；化學(xué)傷；人工角膜移植

人工角膜的適應(yīng)證包括角膜移植排斥的高危病例、多次移植失敗、嚴(yán)重的新生血管和嚴(yán)重的干眼[1]。在實(shí)際臨床中，這些患者往往具有共同的病理學(xué)特點(diǎn)[2-3]：①高度角化的角膜上皮；②嚴(yán)重角膜新生血管；③眼表淚液分泌異常。因此，對(duì)人工角膜進(jìn)行的一系列研究需要一個(gè)動(dòng)物模型作為基礎(chǔ)。而且，目前植入人工角膜的患者中，角膜化學(xué)傷占很大比例，其眼表狀況基本具備這些病理學(xué)特點(diǎn)。因此，我們嘗試用兔角膜堿燒傷的方法模擬臨床人工角膜的適應(yīng)證來(lái)進(jìn)行動(dòng)物模型制作，并與臨床上的人工角膜患者置換下來(lái)的角膜病理做對(duì)比，現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 新西蘭白兔(中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)10只，體重2～2.5 kg，雌雄各半。右眼為實(shí)驗(yàn)眼。

1.2 方法 模型制作：在1%丁卡因表面麻醉下置開(kāi)瞼器，用直徑為12 mm的圓形濾紙片蘸取氫氧化鈉(NaOH)溶液(1 mol/L)，貼于兔角膜正中；40 s后，用生理鹽水迅速?zèng)_洗5 min，氧氟沙星眼膏和1%阿托品眼膏涂結(jié)膜囊。均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼。術(shù)后10 d內(nèi)每日涂氧氟沙星眼膏，并進(jìn)行臨床觀察。直至堿燒傷后3個(gè)月，角膜形成穩(wěn)定角膜白斑和全象限新生血管。

臨床大體觀察：主要從以下幾個(gè)方面加以觀察，包括結(jié)膜囊炎癥反應(yīng)、角膜水腫程度、新生血管范圍及有無(wú)相關(guān)并發(fā)癥。

組織病理學(xué)觀察：分別于堿燒傷后12周處死動(dòng)物，取材后角膜正中切開(kāi)，一半用4%多聚甲醛固定行光學(xué)顯微鏡檢查，另一半用2.5%戊二醛固定行電子顯微鏡檢查。

1)蘇木素-伊紅(hematoxylin eosin, HE)染色。石蠟包埋，5 μm切片，常規(guī)HE染色。

2)天狼猩紅染色。石蠟切片脫蠟至水，苦味酸天狼猩紅染液在室溫浸染1 h。流水沖洗，蘇木素復(fù)染細(xì)胞核1 min。95%～100%乙醇脫水，二甲苯透明，樹(shù)膠封固。結(jié)果判斷：采用苦味酸天狼猩紅染液染色，使用偏振光學(xué)顯微鏡觀察結(jié)果，可以在同一張切片上同時(shí)清晰顯示Ⅰ、Ⅲ型膠原纖維及其相互間的關(guān)系。粗大明亮紅、黃色纖維為Ⅰ型膠原纖維，纖細(xì)的綠色纖維為Ⅲ型膠原纖維。

3)Masson三色染色。石蠟切片3～4 μm脫蠟至水；Harris蘇木素染3 min流水沖洗,1%的鹽酸乙醇分化3～5 s流水沖洗,溫水返藍(lán)1 min流水沖洗；麗春紅酸性品紅加溫染3 min，蒸餾水沖洗,1%磷鉬酸分化1 min，不洗，擦凈載玻片上的磷鉬酸殘液；2%苯胺藍(lán)復(fù)染1 min，95%乙醇沖洗，95%乙醇及無(wú)水乙醇脫水，冷風(fēng)吹干，中性樹(shù)膠封片。

4)透射電子顯微鏡。樣品經(jīng)2%戊二醛內(nèi)固定。逐級(jí)脫水后，Epon812環(huán)氧樹(shù)脂浸潤(rùn)、包埋。制備2 μm厚的半薄切片，光學(xué)顯微鏡下定位，制備厚度為50 nm的超薄切片(矢狀位切片)。方法詳見(jiàn)文獻(xiàn)[1]。

2 結(jié)果

兔角膜堿燒傷后3個(gè)月，所有動(dòng)物形成了穩(wěn)定的角膜白斑和全象限新生血管(圖1)。

2.1 臨床觀察 術(shù)后3～5 d，流淚等刺激癥狀較明顯，角膜水腫明顯；平均1.5個(gè)月后眼前節(jié)炎癥完全消失，形成全象限的新生血管及角膜白斑。無(wú)角膜穿孔等嚴(yán)重并發(fā)癥。

2.2 組織病理學(xué)觀察

1)HE染色。角膜失去原有規(guī)律排列的結(jié)構(gòu)，變?yōu)閺?fù)層移行明顯的上皮細(xì)胞層，并且可見(jiàn)大量新生血管；角膜基質(zhì)可見(jiàn)大量炎細(xì)胞及新生血管，原有排列整齊的膠原消失，由瘢痕性組織替代(圖2)。

2)苦味酸天狼猩紅染色。 偏振光下，顯示角膜基質(zhì)層膠原多由Ⅲ 型逐漸過(guò)渡為成熟、鮮紅色的 Ⅰ 型膠原(圖3)。

3)Masson三色染色結(jié)果。角膜基質(zhì)由原有的膠原組織(藍(lán)色)變?yōu)榉悄z原組織(紅色)，炎細(xì)胞和新生血管明顯(圖4)。

4)透射電子顯微鏡。結(jié)果與光學(xué)顯微鏡結(jié)果一致，即：復(fù)層上皮細(xì)胞，基質(zhì)層大量炎細(xì)胞及纖維母細(xì)胞，膠原排列紊亂。

圖1. 兔角膜堿燒傷動(dòng)物模型：角膜白斑形成，全象限新生血管

圖2. 角膜上皮復(fù)層鱗狀上皮形成(箭頭)， 角膜基質(zhì)可見(jiàn)大量炎細(xì)胞及新生血管，原有排列整齊的膠原消失，被瘢痕性組織替代(×40，HE染色)

圖3. 偏振光下顯示，角膜基質(zhì)層膠原多由Ⅲ型逐漸過(guò)渡為成熟、鮮紅色的Ⅰ型膠原(×200，苦味酸天狼猩紅染色)

圖4. 角膜基質(zhì)由原有的膠原組織(藍(lán)色)變?yōu)榉悄z原組織(紅色)，炎細(xì)胞和新生血管明顯(×100，Masson三色染色)

3 討論

目前，人工角膜的研究[3-6]多圍繞人工材料的相容性、并發(fā)癥的改進(jìn)、表面的改性等方面進(jìn)行。很多實(shí)驗(yàn)是在體外[6-7]研究或正常動(dòng)物角膜內(nèi)[8-9]進(jìn)行，評(píng)估其結(jié)果。但是由于人工角膜臨床應(yīng)用于非正常角膜患者，因此尋找一種合適的動(dòng)物模型是展開(kāi)人工角膜研究的必要基礎(chǔ)。在以往的實(shí)驗(yàn)中，我們以兔角膜堿燒傷植入人工角膜來(lái)評(píng)估其結(jié)果[10]，實(shí)驗(yàn)中的參數(shù)生成的新生血管面積不夠，因此增加了濾紙片的直徑，濃度不變，使其角膜緣受損程度加大，制作更符合臨床情況的人工角膜適應(yīng)證動(dòng)物模型。

為了更好地對(duì)比，參考臨床2例人工角膜植入術(shù)后患者的角膜病理[11]?；颊?為化學(xué)傷(強(qiáng)堿)后角膜全象限新生血管，中央角膜白斑，予波士頓人工角膜Ⅰ型移植術(shù)(術(shù)者是中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院黃一飛教授)，隨訪半年，術(shù)后視力0.4(圖5)?；颊?為反復(fù)角膜炎后角膜全象限新生血管，予波士頓人工角膜Ⅰ型移植術(shù)(術(shù)者為中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院黃一飛教授，隨訪半年，術(shù)后視力0.3(圖6)。

與人的角膜病理相比，堿燒傷后的兔角膜具有類(lèi)似的病理特點(diǎn)：復(fù)層鱗狀上皮的角膜、基質(zhì)層瘢痕、角膜新生血管化。但是，模型的不足之處是，對(duì)于嚴(yán)重干眼、自身免疫性疾病患者，只能模擬其角膜的新生血管及輕度的淚液異常；對(duì)于伴有嚴(yán)重瘢痕血管化結(jié)膜，上下眼瞼瘢痕高度攣縮、瞼閉合不全的患者，需要摸索新的濃度或?yàn)V片停留時(shí)間。

我們可以得出初步結(jié)論：兔角膜堿燒傷可以較好地模擬人工角膜植入的適應(yīng)證，以便進(jìn)行與其相關(guān)的研究。

圖5. A.患者1，角膜堿燒傷后全象限角膜新生血管；B.患者1，角膜上皮復(fù)層鱗狀上皮，角膜全層可見(jiàn)大量炎細(xì)胞及新生血管，原有排列整齊的膠原消失(×40，HE染色)

圖6. A. 患者2，反復(fù)角膜炎，角膜全象限新生血管；B. 患者2，角膜上皮復(fù)層鱗狀上皮化，角膜基質(zhì)可見(jiàn)大量炎細(xì)胞及新生血管，原有排列整齊的膠原消失被瘢痕性組織替代(×40，HE染色)

[ 1 ] Dohlman CH, Schneider HA, Doane MG. Prosthokeratoplasty[J]. Am J Ophthalmol, 1974, 77(5):694-700.

[ 2 ] Gomaa A, Comyn O, Liu C. Keratoprosthesis in clinical practice - a review[J]. Clin Experiment Ophthalmol, 2010,38(2):211-224.

[ 3 ] Bradley JC, Hernandez EG, Schawb IR, et al. Boston type 1 keratoprosthesis: the University of California Davis experience[J]. Cornea, 2009,28(3):321-327.

[ 4 ] Magalh?es FP, Sousa LB, Oliveira LA. Boston type I keratoprosthesis: review[J]. Arq Bras Oftalmol, 2012 ,75(3):218-222.

[ 5 ] Patel S, Takusagawa H, Shen L, et al. Long-term complications associated with glaucoma drainage devices and Boston keratoprosthesis [J]. Am J Ophthalmol, 2012 ,154(1):207-208.

[ 6 ] Tan XW, Lakshminarayanan R, Liu SP, et al. Dual functionalization of titanium with vascular endothelial growth factor and β-defensin analog for potential application in keratoprosthesis[J]. J Biomed Mater Res B Appl Biomater, 2012, 100(8):2090-2100.

[ 7 ] Tan XW, Riau A, Shi ZL, et al.Invitroeffect of a corrosive hostile ocular surface on candidate biomaterials for keratoprosthesis skirt [J]. Br J Ophthalmol, 2012,96(9):1252-1258.

[ 8 ] Hicks CR, Chirila TV, Clayton AB. Clinical results of implantation of the Chirila keratoprosthesis in rabbits[J]. Br J Ophthalmol, 1998,82(1):18-25.

[ 9 ] Todani A, Behlau I, Fava MA, et al. Intraocular pressure measurement by radio wave telemetry[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2011,52(13): 9573-9580.

[10] 白華，高峰，黃一飛，等.新型PHEMA一體式人工角膜植入堿燒傷兔角膜的實(shí)驗(yàn)研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2003，28(12):1082-1083.

[11] Kiang L, Rosenblatt MI, Sartaj R, et al . Surface epithelialization of the type I Boston keratoprosthesis front plate: immunohistochemical and high-definition optical coherence tomography characterization[J]. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol, 2012,250(8):1195-1199.

(本文編輯 諸靜英)

Study of alkali burned rabbit cornea as animal model of indications related to keratoprosthesis implantation

BaiHua＊,WANGZong-hua,WANGLi-qiang,HUANGYi-fei＊.
DepartmentofOphthalmology,BeijingCommandMilitaryGeneralHospitalofPeople’sLiberationArmy,Beijing100700,China

HUANG Yi-fei, Email: 301yk@sina.com

Objective To evaluate feasibility of alkali burned rabbit corneas as animal model of keratoprosthesis implantation. Methods New Zealand rabbits corneas(n=10) were burned with a 12 mm diameter round cornea filter paper dipped in 1 mol/L NaOH for 40 s. The corneas were examined through slit lamp, light microscope and electron microscopy three months later. Results Neovascularization and leukoma were formed in all animal corneas after three months. The pathological findings were consistent with clinical characteristics of patients that had thickening cornea, stratified squamous epithelium corneal stroma scars, neovasculars and inflammatory cells. Conclusions The animal model with corneal alkali burns could be used for implant indications research of keratoprosthesis.(Chin J Ophthalmol and Otorhinolaryngol,2015,15:324-326, 330)

Keratoprosthesis; Alkali burned cornea; Chemical injury; Kerotopnsthesis implantation

中國(guó)人民解放軍北京軍區(qū)總醫(yī)院眼科 北京 100700；＊中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院眼科 北京 100853

通迅作者：黃一飛(Email:301yk@sina.com)

10.14166/j.issn.1671-2420.2015.05.006

2014-02-13)