改良的苯酚-硫酸法測(cè)定蛹蟲(chóng)草多糖含量

陰婉婷， 李 彤， 馬 辰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

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改良的苯酚-硫酸法測(cè)定蛹蟲(chóng)草多糖含量

陰婉婷， 李 彤*， 馬 辰

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院藥物研究所，北京 100050)

[目的]改良苯酚-硫酸法測(cè)定蛹蟲(chóng)草多糖含量。[方法]采用水提醇沉法制備多糖沉淀并溶解成供試品溶液。精密量取供試品溶液和葡萄糖對(duì)照溶液各1.0 ml，分別置10 ml具塞試管中，加1.0 ml水，緩慢加入7.0 ml濃硫酸，搖勻，恒溫放置1 h，加入1.0 ml 4%苯酚溶液，搖勻，40 ℃水浴35 min后冰水浴5 min，取出放置20 min，在487 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量。[結(jié)果]該方法在10.26～102.55 μg葡萄糖的回歸方程為Y=0.013 9X+0.007(r=0.999 9)；平均回收率為97.7%(RSD=2.3%)，精密度試驗(yàn)和重復(fù)性試驗(yàn)的RSD分別為1.4%和2.7%。不同來(lái)源蛹蟲(chóng)草多糖含量在1.21%～4.70%。[結(jié)論]該方法顯色穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性好、靈敏度高，可測(cè)定蛹蟲(chóng)草多糖含量并為蛹蟲(chóng)草質(zhì)量研究提供依據(jù)。

蛹蟲(chóng)草；多糖；苯酚-硫酸法；含量測(cè)定

蛹蟲(chóng)草(CordycepsmilitarisLink)，別名北冬蟲(chóng)夏草、北蟲(chóng)草。蛹蟲(chóng)草化學(xué)成分與冬蟲(chóng)夏草相似，含有蟲(chóng)草素、蟲(chóng)草酸、多糖等有效成分，以及多種對(duì)人體有益的物質(zhì)，如氨基酸、維生素、無(wú)機(jī)元素和超氧化物歧化酶(SOD)等，其中，蟲(chóng)草素和SOD在蛹蟲(chóng)草中的含量高于冬蟲(chóng)夏草，無(wú)機(jī)元素種類與冬蟲(chóng)夏草基本一致且含量豐富。蛹蟲(chóng)草能夠降低血脂，保護(hù)心、腦組織，同時(shí)，具有調(diào)節(jié)免疫、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤的作用，且安全無(wú)毒，可以作為冬蟲(chóng)夏草的代用品[1]。蛹蟲(chóng)草在新藥研究和保健品開(kāi)發(fā)方面有重大價(jià)值，且人工栽培已獲成功，其質(zhì)量控制是必不可少的內(nèi)容。由于蟲(chóng)草多糖有廣泛的生物活性[2]，如抗腫瘤、降血糖、抗氧化，且蛹蟲(chóng)草的免疫調(diào)節(jié)作用也主要與蟲(chóng)草多糖有關(guān)，因此，測(cè)定蟲(chóng)草多糖含量可以為蛹蟲(chóng)草質(zhì)量控制提供依據(jù)。苯酚-硫酸法是測(cè)定多糖含量的經(jīng)典方法之一[3-4]，但對(duì)顯色條件的要求較為嚴(yán)格[4]，操作難度較大，筆者通過(guò)改變顯色劑苯酚與濃硫酸的加入順序，顯著提高了蛹蟲(chóng)草多糖含量測(cè)定方法的穩(wěn)定性、可操作性和檢測(cè)靈敏度。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1儀器。He λ ios α紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(Thermo Spectronic)；RE-52AA水浴鍋(上海振捷實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)；XMTD-6000水浴鍋(北京市長(zhǎng)風(fēng)儀器儀表公司)；XP205型電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；CP224S型電子天平(德國(guó)賽多利斯公司)；DT5-2型低速臺(tái)式離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；KH-500B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；DZF-6020型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司，上海益恒實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)。

1.1.2試劑。硫酸(北京化工廠)，苯酚(北京化學(xué)試劑二廠)，葡萄糖(北京化學(xué)試劑公司)，無(wú)水乙醇(北京化工廠)，以上試劑均為分析純；娃哈哈純凈水。

1.1.3蛹蟲(chóng)草樣品。由不同生產(chǎn)廠家提供，分別編號(hào)為樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、樣品7和樣品8。

1.2 方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備。取葡萄糖適量，精密稱定，加水溶解并稀釋制成每1 ml含0.2 mg的溶液，作為對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取5 ml對(duì)照品儲(chǔ)備液置25 ml量瓶，加水稀釋制成每1 ml含40 μg葡萄糖的對(duì)照品溶液。

1.2.2供試品溶液的制備。蛹蟲(chóng)草樣品在60 ℃下干燥12 h，粉碎，過(guò)60目篩。取樣品約0.5 g，精密稱定，加入純凈水50 ml，稱重。90 ℃水浴回流提取2 h，冷卻后補(bǔ)重。4 000 r/min離心10 min，取上清液2.0 ml，加入無(wú)水乙醇8 ml，冰箱冷藏48 h，沉淀多糖。4 000 r/min離心90 min，傾出上清液，其沉淀用水溶解，定量轉(zhuǎn)移至5 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻，作為樣品儲(chǔ)備溶液。測(cè)定其吸光度后，將其稀釋制成適當(dāng)濃度的樣品溶液以備測(cè)定，或?qū)⑼ㄖ频玫某恋矶哭D(zhuǎn)移至適當(dāng)容積的量瓶中，制成濃度合適的供試品溶液。

1.2.3測(cè)定波長(zhǎng)的選擇。精密量取葡萄糖對(duì)照溶液1.0 ml置10 ml具塞試管中，加1.0 ml水，緩慢加入7.0 ml濃硫酸，搖勻，恒溫放置1 h，加入4%苯酚溶液1.0 ml，搖勻，40 ℃水浴35 min后冰水浴5 min，取出放置20 min。另取2.0 ml水，置10 ml具塞試管中，自“緩慢加入7.0 ml濃硫酸”起，同上平行操作，作為空白對(duì)照。于200～700 nm掃描，以最大吸收波長(zhǎng)為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.2.4顯色條件的優(yōu)化。按照“1.2.3”項(xiàng)的顯色及測(cè)定條件，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別優(yōu)化各顯色條件。①加入不同體積苯酚溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml；②分別加入濃硫酸4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 ml；③加入濃硫酸后放置不同時(shí)間10、20、30、45、60、120、180 min；④加入濃硫酸后，反應(yīng)溫度分別為10、20、25、30 ℃；⑤加入苯酚后，分別在20、40、60、80 ℃溫度下顯色35 min;⑥加入苯酚后，于40 ℃分別顯色15、20、25、30、35、40、45 min。測(cè)定各顯色條件下的吸光度，確定最佳顯色條件。

1.2.5方法學(xué)考察。

1.2.5.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，加水分別稀釋成10、20、40、60、80、100 mg/L葡萄糖溶液，精密量取上述葡萄糖溶液各1.0 ml，置10 ml具塞試管中，在最佳條件下顯色并測(cè)定吸光度。以葡萄糖質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.5.2精密度試驗(yàn)。將樣品1多糖沉淀定量轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶，加水溶解并定容、搖勻，制得供試品溶液。精密量取供試品溶液1.0 ml，在最佳條件下顯色并測(cè)定吸光度，平行測(cè)定6次。

1.2.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn)。精密量取“1.2.5.2”項(xiàng)供試品溶液1.0 ml，在最佳條件下顯色并測(cè)定吸光度，每5 min測(cè)定一次，連續(xù)測(cè)定2 h。

1.2.5.4回收率試驗(yàn)。精密量取“1.2.5.2”項(xiàng)供試品溶液0.5 ml置10 ml具塞試管中，低、中、高濃度組分別精密加入葡萄糖對(duì)照品溶液適量，每組平行3份，加水至2 ml。在最佳條件下顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率。

1.2.5.5重復(fù)性試驗(yàn)。取6份樣品1各0.5 g，精密稱定，按照“1.2.2”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在最佳條件下顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量及RSD。

1.2.6蛹蟲(chóng)草樣品多糖含量測(cè)定。按照“1.2.2”項(xiàng)方法分別制備蛹蟲(chóng)草樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、樣品7和樣品8的供試品溶液(n=3)，在最佳條件下顯色并測(cè)定吸光度，計(jì)算多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇按照“1.2.3”項(xiàng)方法顯色并掃描200～700 nm的吸光度，在487 nm處有最大吸收，確定487 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 顯色條件的優(yōu)化

2.2.1苯酚用量的選擇。加入苯酚溶液0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 ml時(shí)的吸光度分別為0.433、0.504、0.530、0.541、0.543。吸光度隨苯酚用量增加而增加，用量1.0 ml與1.2 ml的吸光度變化不大，確定1.0 ml為苯酚用量。

2.2.2濃硫酸用量的選擇。加入濃硫酸4.0、5.0、6.0、7.0、8.0 ml時(shí)的吸光度分別為0.190、0.346、0.474、0.588、0.525。加入7.0 ml濃硫酸時(shí)吸光度最大，確定7.0 ml為濃硫酸用量。

2.2.3加入硫酸后放置時(shí)間的考察。加入濃硫酸后分別放置10、20、30、45、60、120、180 min，吸光度分別為0.468、0.512、0.525、0.538、0.546、0.551、0.560。吸光度在60 min后基本不變，確定放置60 min。

2.2.4加入硫酸后放置溫度的考察。加入濃硫酸后于10、20、25、30 ℃放置，吸光度分別為0.567、0.531、0.524、0.488?？梢?jiàn)吸光度隨放置溫度的升高而降低，故應(yīng)保持放置中溫度的恒定。

2.2.5顯色溫度的選擇。加入苯酚后，分別在20、40、60、80 ℃溫度下顯色35 min，測(cè)得吸光度分別為0.537、0.589、0.546、0.481。在40 ℃時(shí)吸光度最高且穩(wěn)定，確定40 ℃為顯色溫度。

2.2.6顯色時(shí)間的選擇。加入苯酚后，分別考察40 ℃顯色15、20、25、30、35、40、45 min的吸光度，結(jié)果表明，35 min后，吸光度穩(wěn)定，確定顯色時(shí)間為35 min。

2.3 方法學(xué)考察以葡萄糖質(zhì)量(μg)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.013 9X+0.007(r=0.999 9)，表明葡萄糖在10.26～102.55 μg線性關(guān)系良好。供試品溶液平行測(cè)定6次，RSD=1.4%，表明精密度良好。顯色后溶液在2 h內(nèi)吸光度穩(wěn)定，平均回收率為97.7%，RSD為2.3%(表1)，表明回收率滿足要求。樣品1多糖含量RSD為2.7%(n=6)，表明重復(fù)性良好。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.4 蛹蟲(chóng)草樣品多糖含量經(jīng)測(cè)定，蛹蟲(chóng)草樣品1、樣品2、樣品3、樣品4、樣品5、樣品6、樣品7和樣品8的多糖含量分別是3.21%、3.68%、2.03%、2.59%、1.96%、1.21%、1.23%和4.70%。

3 討論

按照標(biāo)準(zhǔn)的多糖含量測(cè)定方法[3]，精密量取40 mg/L葡萄糖對(duì)照溶液1.0 ml，先加入適量苯酚溶液(0.2、0.6、1.0、1.4、1.8 ml)，后加入濃硫酸混勻，分別測(cè)定吸光度。吸光度隨苯酚用量增加而增加，且變化較大，表明苯酚溶液量的較小變化會(huì)對(duì)吸光度產(chǎn)生較大影響。苯酚-硫酸法測(cè)定多糖含量的機(jī)制是多糖在濃硫酸作用下水解成單糖并迅速脫水，生成糠醛衍生物，進(jìn)而與苯酚縮合成有色化合物。由于苯酚含有強(qiáng)致活基團(tuán)酚羥基，很容易與濃硫酸發(fā)生磺化反應(yīng)[5]，推測(cè)濃硫酸與糠醛衍生物競(jìng)爭(zhēng)苯酚。該試驗(yàn)改變顯色劑濃硫酸和苯酚的加入順序：先向糖溶液中加入濃硫酸，充分生成糠醛衍生物，再加入苯酚溶液，產(chǎn)物穩(wěn)定。結(jié)果表明，改良后的方法靈敏度顯著提高，測(cè)定方法重現(xiàn)性好。

該試驗(yàn)研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的苯酚-硫酸法對(duì)各個(gè)顯色條件要求均較為嚴(yán)格，若達(dá)不到要求，會(huì)影響結(jié)果的重復(fù)性，所以，該方法操作難度較大，與紀(jì)寶玉等報(bào)道[4]一致。改良后的方法，使每一步反應(yīng)完全，吸光度較為穩(wěn)定，易于得到良好的精密度和重復(fù)性，因此，改良后的方法對(duì)放置時(shí)間和顯色時(shí)間的要求較為寬松，這使方法的可操作性大大提高。

改良后的苯酚-硫酸法顯色穩(wěn)定，精密、準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，且靈敏度顯著提高，這有利于低濃度供試品溶液的分析，擴(kuò)大了可分析的樣品范圍。該方法可用于蛹蟲(chóng)草多糖含量的測(cè)定。

[1] 王建芳，楊春清.蛹蟲(chóng)草有效成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].中醫(yī)藥信息，2005，22(5)：30-32.

[2] 王普，鄭明，何軍邀，等.蟲(chóng)草多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)及藥理活性研究進(jìn)展[J].浙江工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，38(2)：129-133，172.

[3] 中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部.中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn) 食用菌中粗多糖含量的測(cè)定 NY/T 1676-2008[S].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2008.

[4] 紀(jì)寶玉，裴莉昕，陳隨清，等.葛根不同生長(zhǎng)期多糖含量的動(dòng)態(tài)積累研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19(16)：63-65.

[5] 邢其毅，裴偉偉，徐瑞秋，等.基礎(chǔ)有機(jī)化學(xué)，下冊(cè)[M].3版.北京：高等教育出版社，2005:837.

Determination of Polysaccharides inCordycepsmilitarisLink by Improved Phenol-sulfuric Acid Method

YIN Wan-ting, LI Tong*, MA Chen

(Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College, Beijing 100050)

[Objective] To determine polysaccharides inCordycepsmilitarisLink by improved phenol-sulfuric acid method. [Method] Prepare polysaccharides by water-extraction and alcohol-precipitation method and dissolve the polysaccharides in water to obtain the sample solution. Transfer accurately measured 1.0 ml of sample solution and glucose reference solution to 10 ml volumetric test tubes, respectively. To each tube, add 1.0 ml of water and slowly add 7.0 ml of sulfuric acid with the stream of acid being directed against the tube wall and shake each tube immediately upside down, then allow it to stand for 1 h at constant temperature. Add 1.0 ml of 4% phenol aqueous solution and shake and keep every tube in water bath at 40 ℃ for 35 min, then cool it in ice-water bath for 5 min. About 20 min after ice-water bath, measure the absorbance at the wavelength of 487 nm and calculate the content of polysaccharides inCordycepsmilitarisLink. [Result] The regression equation of absorbance(Y) and glucose mass(X) wasY=0.013 9X+0.007 (r=0.999 9) in the range of 10.26-102.55 μg of glucose; the average recovery was 97.7%(RSD=2.3%); the RSDs obtained in precision and repeatability experiments were 1.4% and 2.7%, respectively. The polysaccharides content inCordycepsmilitarisLink from different sources ranged from 1.21% to 4.70%. [Conclusion] The improved phenol-sulfuric acid method had higher sensitivity than before and stable color and good accuracy and repeatability, and therefore could be applied to determine polysaccharides inCordycepsmilitarisLink and provided reference for quality control ofCordycepsmilitarisLink.

CordycepsmilitarisLink; Polysaccharides; Phenol-sulfuric acid method; Content determination

“重大新藥創(chuàng)制”科技重大專項(xiàng)(2012ZX09301002-001)。

陰婉婷(1990- )，女，山西運(yùn)城人，碩士研究生，研究方向：藥物分析。*通訊作者，主管技師，從事藥物分析研究。

2014-12-17

S 567

A

0517-6611(2015)04-117-02