RP-HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地白蘞藥材中沒(méi)食子酸的含量

樂(lè)佳美，熊筱娟，畢寶寶，陸文銓

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院，上海 200003；2.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000；3.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南開(kāi)封 475000)

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RP-HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地白蘞藥材中沒(méi)食子酸的含量

樂(lè)佳美1，2，熊筱娟2，畢寶寶3，陸文銓1*

(1.第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院，上海 200003；2.宜春學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江西宜春 336000；3.河南大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，河南開(kāi)封 475000)

[目的]建立白蘞藥材中沒(méi)食子酸的RP-HPLC含量測(cè)定方法，為白蘞藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供依據(jù)。[方法]采用Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)色譜柱，以乙腈- 0.2%磷酸(3∶97)為流動(dòng)相進(jìn)行等度洗脫。流速為1.0 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為270 nm。[結(jié)果]沒(méi)食子酸檢測(cè)濃度在3.15～202 μg/ml的范圍內(nèi)與峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系(R2=0.999 9)；平均回收率為102.8%，RSD為1.15%。[結(jié)論]該方法快速，重現(xiàn)性好，準(zhǔn)確度高，操作簡(jiǎn)便，可用于白蘞藥材的質(zhì)量控制。

白蘞；沒(méi)食子酸；反相高效液相色譜法；質(zhì)量控制

白蘞(Ampelopsisjaponica( Thunb·)Makino)，葡萄科植物，又名野葡萄秧、鵝抱蛋、白草等。據(jù)《中藥大辭典》記載，白蘞以塊根入藥，具有清熱解毒、生肌止疼、消腫的功效，既可內(nèi)服，又可外敷，主要用于醫(yī)治癰腫瘡瘍、燙傷、扭挫傷等[1-2]。臨床廣泛應(yīng)用于治療化膿性皮膚感染、細(xì)菌性痢疾等疾病，療效顯著[3-4]。現(xiàn)代研究表明白蘞中主要含有沒(méi)食子酸、大黃素、大黃素甲醚、大黃酚、蘆薈大黃素、羽扇豆醇等化合物，沒(méi)食子酸為白蘞中抗菌、抗病毒的主要藥效成分，且其含量較高[5-6]。目前在藥典中，白蘞藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)只有定性分析而無(wú)定量分析。為更好地控制白蘞生藥材質(zhì)量，更好地利用白蘞生藥資源和適應(yīng)中藥現(xiàn)代化的發(fā)展要求，該研究基于2015年版《中國(guó)藥典》科研課題，采用定量研究白蘞中沒(méi)食子酸含量的高低來(lái)評(píng)價(jià)白斂生藥材質(zhì)量，以期為制定白蘞藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1研究對(duì)象。白蘞干燥藥材由第二軍醫(yī)大學(xué)附屬長(zhǎng)征醫(yī)院藥材科提供，經(jīng)第二軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)征醫(yī)院陳萬(wàn)生教授鑒定為白蘞A.japonica。

1.1.2主要儀器。Agilent 1260 HPLC系統(tǒng)(Agilent Technologies，美國(guó))，包括G1311A四元泵、G1322A真空脫氣機(jī)、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱和G4212B DAD檢測(cè)器，使用Chem Station軟件數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；BAS124S-CW萬(wàn)分之一電子分析天平(Sartorius，德國(guó))；BP110S十萬(wàn)分之一電子分析天平(Sartorius，德國(guó))；XW-01定時(shí)可調(diào)速漩渦混合器(上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠)；KUDOS SK7200H 超聲波清洗器(上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司)；TDL-4A 低速離心機(jī)(上海菲恰爾分析儀器有限公司)；AG 22331 Humberg超高速離心機(jī)(Eppendorf，德國(guó))；Eppendorf Research plus 可調(diào)量程移液器(Eppendorf，德國(guó))。

1.1.3主要試劑。沒(méi)食子酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，供含量測(cè)定用，批號(hào)110831-201204)；甲醇和乙腈均為色譜純?cè)噭?Fisher Scientific，美國(guó))；甲酸和磷酸均為色譜級(jí)試劑；水為超純水。

1.2 方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備。精密稱取沒(méi)食子酸對(duì)照品適量，加50%甲醇溶液制成每1 ml含202 μg的溶液，即得。

1.2.2供試品溶液的制備。取本品粉末(過(guò)四號(hào)篩)5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理60 min后，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

1.2.3色譜分析條件。色譜柱Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)，柱號(hào)99903；乙腈-0.2%磷酸(3∶97)為流動(dòng)相；流速1.0 ml/min，柱溫30 ℃，檢測(cè)器為DAD，波長(zhǎng)為270 nm。

1.2.4方法學(xué)考察。

1.2.4.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。分別吸取對(duì)照品溶液及供試品溶液各10 μl，在“1.2.3”色譜條件下，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，記錄色譜圖，考察系統(tǒng)適應(yīng)性。

1.2.4.2線性關(guān)系的考察。將沒(méi)食子酸對(duì)照品貯備液用50%甲醇稀釋制成每1 ml含202、 101、50.5、25.25、12.625、6.312 5、3.156 25 μg的系列溶液，分別吸取10 μl注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以進(jìn)樣濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算線性回歸方程。

1.2.4.3檢測(cè)限和定量限的考察。將沒(méi)食子酸對(duì)照品逐步稀釋后進(jìn)樣測(cè)定，以色譜圖中信噪比(S/N)為3時(shí)的進(jìn)樣量為最低檢測(cè)限(LOD)，信噪比(S/N)為10時(shí)的進(jìn)樣量為最低定量限(LOQ)。

1.2.4.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一供試樣品溶液，按“1.2.3”項(xiàng)色譜分析條件分別于0、4、8、12、24 h進(jìn)樣，進(jìn)樣量10 μl，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算RSD。

1.2.4.5精密度試驗(yàn)。取按“1.2.1”方法制備的對(duì)照品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算峰面積的RSD值。

1.2.4.6重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批號(hào)的樣品按“1.2.2”方法制備供試品溶液6份(樣品批號(hào)為白蘞02)，按“1.2.3”項(xiàng)下色譜分析條件，進(jìn)樣量為10 μl，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均含量和RSD。

1.2.4.7加樣回收試驗(yàn)。取同一批號(hào)已知含量的樣品6份(樣品批號(hào)為白蘞02)，精密加入分別與樣品中沒(méi)食子酸含量相等的對(duì)照品，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，進(jìn)樣量為10 μl，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均回收率和RSD。

1.2.5樣品的含量測(cè)定。按“1.2.2”方法分別精密稱取10批不同產(chǎn)地的藥材粉末配制成供試品溶液各2份，按“1.2.4.2”方法對(duì)樣品進(jìn)行含量測(cè)定，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算不同產(chǎn)地白蘞藥材中沒(méi)食子酸的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)。圖1表明，在“1.2.4.1”條件下，樣品譜圖中沒(méi)食子酸的保留時(shí)間為14 min左右，與其他化學(xué)成分能達(dá)到基線分離，其色譜峰與相鄰色譜峰分離度良好(與相鄰峰的分離度均大于1.5)，符合高效液相色譜定量分析的要求。理論塔板數(shù)以沒(méi)食子酸計(jì)為10 000以上。

2.1.2線性關(guān)系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，峰面積分別為5 674.47、2 785.17、1 372.87、695.40、342.73、163.00、77.10，以進(jìn)樣濃度X(μg/ml)為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示，計(jì)算得線性回歸方程為Y=28.103X-22.027(R2=0.999 9)，表明沒(méi)食子酸在3.15～202 μg/ml的范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.1.3檢測(cè)限和定量限的考察。按“1.2.4.3”方法操作，結(jié)果表明，沒(méi)食子酸的檢測(cè)限和定量限分別為0.002 2和0.006 3 μg。

2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。按“1.2.4.4”方法操作，計(jì)算得出峰面積積分值的RSD為0.80%，表明沒(méi)食子酸在24 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.1.5精密度試驗(yàn)。按“1.2.4.5”方法操作，計(jì)算得峰面積的RSD為0.20%，表明在此試驗(yàn)條件下精密度良好。

2.1.6重復(fù)性試驗(yàn)。按“1.2.4.6”方法操作，計(jì)算得平均含量為0.027%，RSD為2.30%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.7加樣回收試驗(yàn)。由表1可見(jiàn)，平均回收率為102.8%，RSD為1.15%，表明該方法準(zhǔn)確、可靠，可用于白蘞藥材中沒(méi)食子酸的含量測(cè)定。

2.2 含量測(cè)定由表2可知，大部分產(chǎn)地的白蘞藥材中沒(méi)食子酸含量為0.02%～0.03%，而產(chǎn)自湖北的白蘞藥材(編號(hào)01)中的沒(méi)食子酸含量明顯比其他產(chǎn)地的高，為0.052 25%。

3 結(jié)論與討論

3.1 對(duì)照品純度檢查方法采用HPLC等度洗脫，采用DAD檢測(cè)器檢測(cè)，樣品在190～400 nm范圍內(nèi)，除樣品峰外均沒(méi)有檢測(cè)到其他峰，樣品峰峰面積百分比達(dá)100%；增加進(jìn)樣量達(dá)到樣品出現(xiàn)平頭峰時(shí)，仍然未檢測(cè)出其他色譜峰。樣品峰的峰純度分析報(bào)告顯示，峰純度達(dá)98%。對(duì)照品核磁共振圖譜顯示沒(méi)有其他雜質(zhì)信號(hào)。

3.2 色譜條件的選擇

3.2.1色 譜 柱 的 選 擇。該試驗(yàn)對(duì)以下3種型號(hào)的C18柱進(jìn)

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果(n=2)

行考察：Grace Smart RP18(250×4.6 mm，5 μm)，柱號(hào)0170301737；Agilent C18(250×4.6 mm，5 μm)，柱號(hào)880975-902；Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)，柱號(hào)99903。結(jié)果表明三者均能較好地分離沒(méi)食子酸且峰形較好，出于成本考慮，選用Dikma Diamonsil C18(250×4.6 mm，5 μm)。

3.2.2柱溫的選擇?？疾炝瞬煌鶞?25、30、35 ℃)對(duì)分離效果的影響，結(jié)果表明柱溫對(duì)分離效果的影響不大，在合適的流動(dòng)相條件下，沒(méi)食子酸峰均能與其他峰達(dá)到基線分離，但考慮到其可操作性，在此選用30 ℃。

3.2.3流動(dòng)相的選擇。選擇了乙腈-0.2%甲酸、乙腈-0.2%磷酸2種流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行測(cè)定試驗(yàn)，結(jié)果表明，在2種流動(dòng)相系統(tǒng)條件下沒(méi)食子酸的分離效果差異不大，但乙腈-0.2%磷酸條件下峰形更好，因此最后選擇了乙腈- 0.2%磷酸(3∶97)作為流動(dòng)相，且每次分析結(jié)束時(shí)加強(qiáng)對(duì)色譜柱和液相系統(tǒng)的沖洗和維護(hù)。

3.2.4檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇。取沒(méi)食子酸對(duì)照品的甲醇溶液，用DAD全波長(zhǎng)掃描，在220、273 nm波長(zhǎng)處有最大吸收。該試驗(yàn)按照《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄ⅤA[7]的有關(guān)規(guī)定，先檢查了所使用的乙腈溶劑在供試品測(cè)定所用波長(zhǎng)附近是符合要求的，結(jié)合其他相關(guān)文獻(xiàn)[8-9]，選擇270 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

因此該試驗(yàn)采用了“1.2.3”項(xiàng)下色譜條件。

3.3 供試品溶液制備方法的選擇

3.3.1提取方法的選擇。采用2種不同的提取方法(超聲、加熱回流)提取白蘞中的沒(méi)食子酸，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，2種方法提取的沒(méi)食子酸含量分別為0.173 4、0.169 1 mg/g，表明超聲法提取效果略優(yōu)于加熱回流提取法，操作簡(jiǎn)單，故選用超聲法。

3.3.2提取溶劑的選擇。選用了不同溶劑(20%甲醇、40%甲醇、50%甲醇、60%甲醇、80%甲醇)進(jìn)行超聲提取，結(jié)果表明，沒(méi)食子酸含量分別為0.132 8、0.142 8、0.173 3、0.157 3、0.135 3 mg/g，表明用50%甲醇作為提取溶劑的提取效果略優(yōu)于其他溶劑，故選用50%甲醇作為提取溶劑。

3.3.3提取藥液比的選擇。選用不同提取藥液比(1∶10、1∶25、1∶50、1∶80、1∶100)進(jìn)行超聲提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸含量分別為0.229 0、0.159 8、0.151 9、0.158 4、0.148 0 mg/g，表明提取藥液比為1∶10時(shí)沒(méi)食子酸含量最高，提取效果最好，故采用提取藥液比為1∶10。

3.3.4提取時(shí)間的選擇。分別考察超聲時(shí)間(20、30、40、60、90 min)對(duì)沒(méi)食子酸的提取效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)沒(méi)食子酸含量分別為0.128 4、0.143 3、0.146 6、0.147 1、0.134 7 mg/g，表明超聲60 min時(shí)提取效果略優(yōu)于其他時(shí)間，故采用超聲提取60 min。

因此該試驗(yàn)采用了“1.2.2”項(xiàng)下供試品溶液制備方法。

3.4 小結(jié)根據(jù)10批不同產(chǎn)地樣品的測(cè)定結(jié)果，建議本品(按干燥品計(jì)算)含沒(méi)食子酸(C7H6O5)不得少于0.02%。采用HPLC法，以沒(méi)食子酸為指標(biāo)性成分，可有效地控制白蘞藥材的質(zhì)量，且該方法重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，為進(jìn)一步制定白蘞藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。

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Determination of Gallic Acid in Prepared Slices ofAmpelopsisjaponicaby RP-HPLC

LE Jia-mei1,2, XIONG Xiao-juan2, BI Bao-bao3, LU Wen-quan1*

(1.Changzheng Hospital， Second Military Medical University, Shanghai 200003; 2. College of Chemical and Biological Engineering, Yichun University, Yichun, Jiangxi 336000; 3. School of Chemistry and Chemical Engineering, Henan University, Kaifeng, Henan 475000)

[Objective] To establish an RP-HPLC method for determination of gallic acid inAmpelopsisjaponica. [Method] The analysis was carried out on an Dikma Diamonsil C18column(250×4.6 mm, 5 μm)and the mobile phase was acetonitrile -0.2%phosophorie acid (3∶97) at the flow rate of 1.0 ml/min; the detection wavelength was 270 nm and the column temperature was 30 ℃. [Result] The linear range for gallic acid was 3.15-202 μg/ml (R2= 0.999 9 ). The average recovery was 102.8% (RSD= 1.15% ). [Conclusion] This method is simple, rapid, accurate, and it can be used for the quality control of the prepared slices ofAmpelopsisjaponica.

Ampelopsisjaponica; Gallic acid; RP-HPLC; Quality control

2015版中國(guó)藥典項(xiàng)目“白蘞藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究”。

樂(lè)佳美(1990- )，女，江西撫州人，碩士研究生，研究方向：天然藥物活性成分與中藥質(zhì)量控制研究。*通訊作者，副主任藥師，博士，碩士生導(dǎo)師，從事醫(yī)院藥學(xué)研究。

2014-12-15

S 567

A

0517-6611(2015)04-108-03