豬細(xì)小病毒河南分離株全基因組克隆及序列分析

陳龍彪， 高曉云， 吳宇陽(yáng)， 馮亞瓊， 陳紅英， 崔保安， 馬世杰， 郭官鵬

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002)

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豬細(xì)小病毒河南分離株全基因組克隆及序列分析

陳龍彪， 高曉云， 吳宇陽(yáng)， 馮亞瓊， 陳紅英， 崔保安*， 馬世杰， 郭官鵬

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州 450002)

[目的]進(jìn)一步了解河南地區(qū)豬細(xì)小病毒(PPV)的變異特點(diǎn)。[方法]利用PCR方法，對(duì)河南鄭州、周口、濟(jì)源等地采集的疑似PPV感染的病料進(jìn)行檢測(cè)。PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的病料經(jīng)處理后，同步接種豬睪丸細(xì)胞盲傳6代，對(duì)4株P(guān)PV全基因組進(jìn)行分段克隆及測(cè)序，并與GenBank登錄的國(guó)內(nèi)外PPV流行株全基因組進(jìn)行比較。[結(jié)果]獲得的4株P(guān)PV全基因組序列全長(zhǎng)均為4 679 bp。4個(gè)毒株之間的核苷酸同源性介于99.6%～99.8%，與其他毒株間核苷酸同源性為98%～100%，遺傳進(jìn)化較為穩(wěn)定。[結(jié)論]為PPV在河南地區(qū)分子流行病學(xué)調(diào)查及遺傳變異分析奠定了基礎(chǔ)。

豬細(xì)小病毒；全基因組；克??；序列分析

豬細(xì)小病毒(Porcine parvovirus，PPV)是引起母豬繁殖障礙的主要病原體之一，主要表現(xiàn)為胎兒和胚胎的感染和死亡。受感染母豬會(huì)產(chǎn)出死胎、畸形胎、木乃伊胎及病弱仔豬，而受感染母豬本身通常并不表現(xiàn)臨床癥狀。仔豬會(huì)出現(xiàn)生長(zhǎng)受阻，同時(shí)伴有仔豬的皮炎和腹瀉癥狀。感染公豬則表現(xiàn)為精液品質(zhì)下降。PPV 又常同豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬瘟(CSFV)、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)等混合感染而加重其危害[1]。同時(shí)，PPV對(duì)熱極其穩(wěn)定，對(duì)很多常用消毒劑都具有很強(qiáng)的抵抗力，因此污染的豬舍常是PPV的主要儲(chǔ)藏所，導(dǎo)致該病的流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。

自1967年Cartwright等[2]首次從豬流產(chǎn)胎兒臟器中分離到PPV以來(lái)，各國(guó)豬群血清學(xué)調(diào)查陽(yáng)性檢出率都較高，我國(guó)血清學(xué)調(diào)查的陽(yáng)性率為80%[3-5]，其中有些豬場(chǎng)經(jīng)產(chǎn)母豬和5日齡內(nèi)仔豬PPV的HI陽(yáng)性率高達(dá)99%～100%。我國(guó)先后在北京、上海、吉林、四川、浙江等地分離到多株P(guān)PV，這些PPV毒株雖然分離自不同地區(qū)，但都屬于同一血清型。

近年來(lái)，因PPV感染而造成的危害呈上升趨勢(shì)。為了解河南地區(qū)PPV的變異特點(diǎn)，筆者從河南鄭州、周口、濟(jì)源、焦作等地采集疑似感染PPV的病料中分離出4株P(guān)PV，測(cè)序4毒株的全基因組序列，并與GenBank登錄的PPV參考毒株進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析，旨在為進(jìn)一步分析PPV基因組的結(jié)構(gòu)、功能以及PPV防控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 組織病料及細(xì)胞株將2010～2012年從河南鄭州、周口、濟(jì)源、焦作等疑似PPV感染發(fā)病的豬中采集死胎胎衣及肝臟、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等組織，-80 ℃保存?zhèn)溆?。豬睪丸(ST)細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.2 主要試劑TaqTM酶、蛋白酶 K、pMD-18載體等購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自Promega公司；DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清和胰蛋白酶購(gòu)自Solarbio公司；十二烷基硫酸鈉(SDS)購(gòu)自上海生物工程有限公司，其余試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。

1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成參考GenBank已發(fā)表的PPV序列[6]，設(shè)計(jì)并合成4對(duì)相互重疊的特異引物(表1)。引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.4 組織病料中PPV DNA的PCR檢測(cè)將采集的死胎胎衣及肝臟、脾臟、肺臟、淋巴結(jié)等組織混合，剪碎后研磨成勻漿，按1∶5(W/V)加入滅菌PBS液，制成懸液，反復(fù)凍融3次后，融化，8 000 r/min離心10 min。取上清液200 μl，按常規(guī)的酚氯仿抽提法提取病毒DNA。利用PPV檢測(cè)引物[7]，PCR檢測(cè)PPV DNA。取5 μl PCR產(chǎn)物用10 g/L瓊脂糖凝膠(含0.5 μg/ml EB)進(jìn)行電泳檢測(cè)PCR的結(jié)果。

1.5 病毒的分離與培養(yǎng)將PCR檢測(cè)為陽(yáng)性的病料，剪成小塊并研碎凍融3次，加入少量DMEM培養(yǎng)液稀釋?zhuān)? 000 r/min 離心10 min，在上清液中加入青霉素1 000 U/ml和鏈霉素1 000 U/ml，37 ℃作用2 h，經(jīng)0.22 μm的細(xì)菌濾器過(guò)濾除菌。將處理后的病料按培養(yǎng)液量的10%同步接種到ST細(xì)胞中，置于5%CO237 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h。收獲接毒細(xì)胞，反復(fù)凍融3次收集病毒，8 000 r/min離心30 min去除細(xì)胞碎片，此為第一代毒。盲傳至ST細(xì)胞出現(xiàn)較穩(wěn)定的細(xì)胞病變(CPE)時(shí)，按2%進(jìn)行接毒[8]，連續(xù)盲傳至第6代。傳代過(guò)程中，觀察細(xì)胞病變，直至收獲病毒，并用PPV檢測(cè)引物，PCR檢測(cè)PPV[8-9]。

表1 所用引物

1.6 DNA片段的克隆、鑒定和測(cè)序?qū)PV分離株感染的ST細(xì)胞毒，凍融3次，12 000 r/min離心4 min。取上清，按“1.4”方法抽提細(xì)胞毒DNA。利用表1中PPV特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將回收純化的DNA片段克隆于pMD18-T載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12～16 h。PCR和酶切鑒定為陽(yáng)性的重組菌，送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序[10-12]。

1.7 PPV全基因組序列分析利用DNAstar軟件包進(jìn)行PPV全基因組序列拼接，并對(duì)PPV分離株全基因組序列及由ORF所推導(dǎo)的氨基酸序列與GenBank上讀取的PPV參考毒株(表2)序列進(jìn)行分析，分析它們之間的同源性及變異程度。

表2 PPV參考毒株的國(guó)家、采樣時(shí)間、全基因組長(zhǎng)度及登錄號(hào)

2 結(jié)果與分析

2.1 PPV的細(xì)胞培養(yǎng)將PCR檢測(cè)為PPV陽(yáng)性的鄭州、周口、濟(jì)源、焦作等地組織勻漿液接種ST細(xì)胞，盲傳6代，分離到4株P(guān)PV。從各代次中均檢測(cè)出PPV特異性的目的片段，而正常ST細(xì)胞核酸為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果為陰性。表明病毒已適應(yīng)ST細(xì)胞。將分離出的4株P(guān)PV分別命名為G、H、I和K。

2.2 PPV基因組的克隆與序列測(cè)定用所設(shè)計(jì)的4對(duì)引物P1/P2、P3/P4、P5/P6和P7/P8進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳結(jié)果顯示，分別擴(kuò)增出約1 600、1 500、700和1 900 bp的條帶(圖1)，與預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物大小相符。每個(gè)分離株4個(gè)基因片段大小分別為1 608、1 482、675和1 857 bp，與預(yù)期產(chǎn)物大小一致。經(jīng)拼接獲得的4個(gè)分離株全基因組序列均為4 679 bp。所測(cè)序列已上傳NCBI，獲得序列登錄號(hào)分別為KF429252、KF429253、KF429254、KF429255。

2.3 PPV全基因組序列分析利用DNAstar軟件，將4株P(guān)PV與GenBank收錄的具有代表性的PPV全序列進(jìn)行序列分析。4個(gè)分離株之間的核苷酸同源性為99.6%～99.8%，所有PPV株基因組間核苷酸同源性在98%～100%。由圖2可知， I和K株與NADL-2(M38367.1、NC_001718.1)株、中國(guó)分離株JT(JN968975.1)的親緣關(guān)系較近，而G株和H株與廣西分離株N(HM989009.1)親緣關(guān)系較近(圖2)。

2.4 PPV NS1基因及推導(dǎo)的氨基酸分析利用DNAstar軟件將PPV NS1基因及所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，并繪制進(jìn)化樹(shù)。所有PPV株NS1基因核苷酸序列同源性位于98.1%～100%。4株分離株處于同一分支，與NADL-2株的親緣關(guān)系較近(圖3)。其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性在98.2%～100%，僅存在個(gè)別氨基酸差異：G、I、K株在59位N→D，K株在155位S→G，I株在173位K→E，G、H、I株在513位N→H。

2.5 PPV VP1基因及推導(dǎo)的氨基酸分析利用DNAstar軟件將PPV各毒株的VP1基因及所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有PPV株VP1基因核苷酸序列同源性位于98.6%～100%，推導(dǎo)的氨基酸序列同源性在98.%～100%。與參考毒株NADL-2相比，4株P(guān)PV與一些PPV毒株相同，在219、318、539、730和739位點(diǎn)發(fā)生氨基酸置換(219-→Y，318R→S，539-→L，730L→I和739K→E)，而分離株在37、352和388等位點(diǎn)出現(xiàn)了獨(dú)特的突變(表3中斜體下劃線(xiàn)標(biāo)示)，但無(wú)一定規(guī)律性。

表3 PPV各毒株VP1蛋白的氨基酸差異

接下表

續(xù)表3

注：與參考毒株NADL-2 (NC_001718)的氨基酸序列相比，相同的用“.”做標(biāo)記，不編碼氨基酸的位點(diǎn)用“-”表示。

2.6 VP2基因及推導(dǎo)的氨基酸分析利用DNAstar軟件將各分離株的VP2基因及所推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有PPV株VP2基因核苷酸同源性位于98.3%～100%，變異較小，沒(méi)有發(fā)生插入或移位突變，僅存在點(diǎn)突變。其推導(dǎo)的氨基酸序列同源性在97.1%～100%，突變位點(diǎn)在45S→T，144E→A，378G→D，555N→K，565K→R較為一致。而分離株在其他位點(diǎn)，如178、214、320等位點(diǎn)出現(xiàn)了獨(dú)特的突變(表4中斜體下劃線(xiàn)標(biāo)示)，但無(wú)一定規(guī)律性。

表4 PPV各毒株VP2蛋白的氨基酸差異

注：與參考毒株NADL-2 (NC_001718)的氨基酸序列相比，相同的用“.”做標(biāo)記，不編碼氨基酸的位點(diǎn)用“-”表示。

3 討論

豬細(xì)小病毒全長(zhǎng)約5 000 bp，成熟的粒子只含有負(fù)鏈DNA。PPV與其他自主性細(xì)小病毒相似，兩端均有發(fā)夾結(jié)構(gòu)，3′端的102nt的回文序列被其中的2個(gè)10nt的短回文序列中斷，折疊形成Y型結(jié)構(gòu)；5′端有一個(gè)127nt的回文序列，中間被一個(gè)24nt的短回文序列中斷，折疊形成U型結(jié)構(gòu)[13]。這種復(fù)雜的末端結(jié)構(gòu)導(dǎo)致PCR方法只能對(duì)PPV的編碼基因進(jìn)行擴(kuò)增。一般認(rèn)為細(xì)小病毒都較保守，而按照實(shí)驗(yàn)室建立的PPV檢測(cè)和分離鑒定方法得到的這4個(gè)分離株在核苷酸序列上同其他毒株差別不大，該研究結(jié)果證實(shí)了這一點(diǎn)。但基于遺傳和變異的特性，即使很細(xì)微的點(diǎn)突變長(zhǎng)期積累下來(lái)也會(huì)造成較大的變化。

近年來(lái)對(duì)于PPV的研究主要集中于結(jié)構(gòu)蛋白VP2和非結(jié)構(gòu)蛋白NS1上，對(duì)于其他基因的研究很少，而研究表明其他部分基因在PPV的復(fù)制、傳播過(guò)程中同樣起著至關(guān)重要作用。其中非結(jié)構(gòu)蛋白NS1在病毒DNA的復(fù)制中起著重要作用，是病毒基因組本身編碼的反式激活蛋白，對(duì)病毒的早期和晚期轉(zhuǎn)錄都發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，起始病毒DNA的復(fù)制，與細(xì)小病毒的組裝密切相關(guān)。從NS1蛋白的核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)可以看出，這4株P(guān)PV的NS1蛋白在一個(gè)分支上，相似性非常高，符合其應(yīng)具有的高度保守性。而對(duì)NS2和NS32這2個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白的報(bào)道較少，因此其功能尚不清楚。

結(jié)構(gòu)蛋白VP1、VP2和VP3共同構(gòu)成了病毒的核衣殼，其中VP1可能在病毒從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)起作用，據(jù)報(bào)道抗VP1血清抗體保護(hù)率(100%)比VP2、VP3血清抗體(保護(hù)率50%～70%)具有更強(qiáng)的中和病毒能力[14]。而VP2蛋白是主要結(jié)構(gòu)蛋白，也是主要的保護(hù)性抗原，在體外表達(dá)后不僅有良好的免疫原性而且可以自我裝配成病毒樣顆粒，將該顆粒接種動(dòng)物后能誘導(dǎo)產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答反應(yīng)[15]。VP3通常認(rèn)為是VP2翻譯后切割加工的產(chǎn)物。通過(guò)對(duì)VP1和VP2基因序列以及氨基酸序列的分析可以發(fā)現(xiàn)，該次獲得的4株P(guān)PV基因變異不大，沒(méi)有出現(xiàn)一定規(guī)律的突變點(diǎn)，符合PPV病毒的保守性特點(diǎn)，而VP1蛋白和VP2蛋白核苷酸序列進(jìn)化樹(shù)形態(tài)較為相似：I、K株同NADL-2 (美國(guó)，M38367.1、NC_001718.1)弱毒侏關(guān)系較近，而G、H株同N(中國(guó)廣西，HM989009.1)關(guān)系較近。同時(shí)4株分離株都具有VP1/VP2終止子處的兩段完整127 bp重復(fù)單元，符合PPV弱毒的特征[13]。但從2種蛋白的推導(dǎo)氨基酸進(jìn)化樹(shù)上可以看出，盡管核苷酸序列的相似度較高，但氨基酸序列的差異較大。由此可見(jiàn)，PPV的變異應(yīng)屬于基因漂移而發(fā)生的改變，與地域及藥物選擇沒(méi)有直接的相關(guān)性，而對(duì)于PPV基因漂移對(duì)抗原性的影響還有待進(jìn)一步研究[16]。

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Cloning and Sequence Analysis of the Complete Genome of Porcine Parvovirus from Henan Province

CHEN Long-biao，GAO Xiao-yun，WU Yu-yang, CUI Bao-an*et al

(College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine, Henan Agricultural University, Zhengzhou, Henan 450002)

[Objective] Sample suspiciously infected with porcine parvovirus(PPV)were collected from several regions in Henan Province and detected by PCR. [Method]Positive cases were treated and inoculated in swine testicular (ST) cells, 4 isolates were isolated and passaged blindly in ST cell for 6 generations. According to the published complete genome sequences of PPV in GenBank, a pair of specific primers was designed and synthesized.The complete genomes of the PPV isolates were cloned，sequenced and analyzed.[Result] The results showed that the genomes homologies among the 4 isolates were 99.6%-99.8%，and they shared 98%-100% homologies with other PPV strains.Phylogenetic tree showed that the 4 PPV isolates were closely related.[Conclusion]The study provided some basis for studying the molecular epidemiology，variation and prevention of PPV in Henan.

Porcine parvovirus; Complete genome;Cloning; Sequence analysis

河南省重大科技專(zhuān)項(xiàng)(111100110300)。

陳龍彪(1989- )，男，河南洛陽(yáng)人，碩士研究生，研究方向：分子病原學(xué)。*通訊作者。

2014-12-17

S 852.65+1

A

0517-6611(2015)04-026-04