乳源黃嘌呤脫氫酶和黃嘌呤氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)研究概述

郭曉蕾，施 斌，張 婷

(無限極(中國)有限公司，廣東廣州 510641)

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乳源黃嘌呤脫氫酶和黃嘌呤氧化酶的晶體結(jié)構(gòu)研究概述

郭曉蕾，施 斌，張 婷

(無限極(中國)有限公司，廣東廣州 510641)

在全球范圍內(nèi)，高尿酸血癥近年來發(fā)病率逐漸提高。黃嘌呤脫氫酶(XDH)、黃嘌呤氧化酶(XO)等是參與痛風(fēng)發(fā)生與發(fā)展的關(guān)鍵酶，是開發(fā)抗痛風(fēng)藥物的重要靶標(biāo)。通過抑制嘌呤代謝關(guān)鍵酶活性，可有效降低血漿尿酸水平。本文主要概述了在2.1-?分辨率下牛乳來源的二聚XDH的晶體結(jié)構(gòu)及在2.5-?分辨率下XO的晶體結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)每個(gè)分子由一個(gè)含兩鐵硫中心的氨基端20 kDa域、一個(gè)中央40 kDa黃素腺嘌呤二核苷酸域和一個(gè)85 kDa鉬喋呤結(jié)合域。此外，對黃嘌呤脫氫酶轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶的主要變化歷程進(jìn)行概述。

黃嘌呤脫氫酶；黃嘌呤氧化酶；晶體結(jié)構(gòu)

乳源黃嘌呤氧化酶是一種典型的酶，最初被認(rèn)為是一種醛氧化酶，后來充當(dāng)了整個(gè)復(fù)雜金屬黃素蛋白質(zhì)類的基準(zhǔn)物[1]。黃嘌呤氧化還原酶可從各種各樣的生物(微生物、人等)中分離獲得。它能廣泛地催化嘌呤、嘧啶、喋呤和醛類的羥基化反應(yīng)[2-3]。催化次黃嘌呤和黃嘌呤羥基化的哺乳動物酶，即作用在尿酸形成的最后2個(gè)步驟，可以合成脫氫形式的黃嘌呤脫氫酶(XDH)，并且在細(xì)胞主要以這種形式存在，但很容易被含巰基殘留物氧化或發(fā)生水解作用，而轉(zhuǎn)化為氧化形式的黃嘌呤氧化酶(XO)。XDH在黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)反應(yīng)區(qū)域，催化反應(yīng)向NAD+減少的方向進(jìn)行，然而XO不與NAD+反應(yīng)，就只能將分子氧作為反應(yīng)底物，生成超氧化物陰離子和過氧化氫[2]。黃嘌呤氧化還原酶類是一種針對痛風(fēng)和高尿酸血癥的藥物，可將XDH轉(zhuǎn)化成XO，因其涉及氧自由基誘發(fā)組織損傷類型疾病(如缺血后再灌注損傷等)已受到廣泛關(guān)注。最近研究表明，XO還可能具有降血壓的作用[4]。

黃嘌呤氧化還原酶類的活化型是分子質(zhì)量達(dá)290 kDa的同型二聚體。每個(gè)單體在反應(yīng)中發(fā)揮著各自的催化作用。每個(gè)亞基有1個(gè)鉬喋呤輔因子、2個(gè)不同光譜[2Fe-2S]中心和1個(gè)FAD輔因子。黃嘌呤的氧化發(fā)生在鉬喋呤中心(Mo-pt)，電子進(jìn)而通過分子內(nèi)電子轉(zhuǎn)移迅速分配到其他中心。與其他羥化酶不同的是，XDH最終用一個(gè)水分子作為氧原子來源并入產(chǎn)物中。

來自各種來源的黃嘌呤氧化還原酶類的氨基酸序列已通過單獨(dú)反向轉(zhuǎn)錄DNA(cDNAs)或基因工程推導(dǎo)出來。這些酶類約由1 330個(gè)氨基酸組成，而且高度同源，例如牛奶酶類(1 332個(gè)殘基)中90%的氨基酸序列與人類肝臟酶(1 333個(gè)殘基)具有同一性[2,5-6]。哺乳動物的XDH用胰蛋白酶限制性蛋白水解作用后，可得到3個(gè)片段(分子量分別為20、40和85 kDa)，與此同時(shí)自身將轉(zhuǎn)化為黃嘌呤氧化酶。序列經(jīng)對比后表明，2個(gè)鐵硫中心位于在N端20 kDa片段，黃素腺嘌呤二核甘酸(FAD)位于中間40 kDa片段，而鉬中心位于C端的85 kDa片段[2]。

表1 收集到和修正的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)

注：Rcryst=Σhkl︱Fobs-Fcalc︱/Fobs，F(xiàn)ob和Fcalc是觀察和計(jì)算的結(jié)構(gòu)系數(shù)，反射總和也相應(yīng)地用于優(yōu)化模型。

XO晶體可以從牛奶的酶類中提純出來，但提取的量并不足以用作更深入的分析。由于缺乏對黃嘌呤氧化還原酶2種形式中任意一種的結(jié)構(gòu)信息，這類酶的結(jié)構(gòu)-機(jī)制相關(guān)性研究僅通過遠(yuǎn)親酶類推斷出來，如來自巨大脫硫孤菌屬的醛氧化酶(ALO,23% FeS-和Mo-pt域同一性；醛氧化酶缺乏黃素輔因子域)和來自食羧假單胞菌的一氧化碳脫氫酶(COD,17%的S、M和亞基具同一性)[7-9]。盡管這種方法為反應(yīng)機(jī)理提供良好的模型，特別是鉬喋呤亞位點(diǎn)[4,8]，但幾乎沒有關(guān)于FAD位點(diǎn)的相關(guān)信息。顯然，現(xiàn)在僅通過觀察包括人類和老鼠這2種哺乳動物的黃嘌呤氧化還原酶類催化活性變化，還不能理清從原來的XDH形式變化到XO形式伴隨著的結(jié)構(gòu)變化歷程。有文獻(xiàn)展示了牛奶黃嘌呤氧化還原酶在2.1-?分辨率下XDH形式和在2.5-?分辨率下的XO形式。通過對比這2種分子結(jié)構(gòu)，可以識別出誘導(dǎo)XDH轉(zhuǎn)變成XO所發(fā)生的重要蛋白水解變化。

1 鑒定黃嘌呤脫氫酶、黃嘌呤氧化酶的方法

按照Nishino等方法制備XO形式的酶[10]。為了制備穩(wěn)定和可結(jié)晶的XDH，對已建立的提純方法進(jìn)行改進(jìn)，用去除蛋白酶的脂肪酶水解方法代替用標(biāo)準(zhǔn)胰酶制劑或丁醇處理的方法，是其中最重要的一步。在復(fù)雜的水楊酸抑制劑環(huán)境中可以提高XDH和XO形式晶體的衍射質(zhì)量。牛奶XDH晶體屬于C2空間群，晶胞參數(shù)a=169.9 ?，b=124.8 ?，c=148.6 ?，β=90.9°，還包含在不對稱單位的2個(gè)亞基。XO在空間群的晶胞參數(shù)a=117.8 ?，b=167.7 ?，c=154.5 ?，還包含在不對稱單位的一個(gè)亞基。在100 K狀態(tài)下，分別收集從2.1-?分辨率下XDH到2.5-?的XO速凍晶體的參數(shù)。MAD數(shù)據(jù)是測量3個(gè)波長段峰附近的XDH晶體而得到 (表1)。所有數(shù)據(jù)組均用DENZO和SCALEPACK方法處理[11]。結(jié)合分子置換(MR)和XDH的Fe/S中心的鐵原子反相，可探明XDH和XO的結(jié)構(gòu)。最初分子置換法是以XO的原始數(shù)據(jù)和一個(gè)D.gigasALO亞基作為搜索模型[12]，運(yùn)用分塊切除術(shù)項(xiàng)目演變而來。因?yàn)樗阉髂Ｐ臀瓷婕拜o因子，此時(shí)相應(yīng)位置可見的電子密度就擔(dān)當(dāng)一個(gè)額外檢驗(yàn)方案正確性的指示劑角色。XO晶型的解決方案提出0.231的相關(guān)系數(shù) (CC)和一個(gè)57.4%的R因子(R)，然而平均背景值CC= 0.189，R=59.0%。二聚體是由分子置換法XO晶體對稱性定義的，一個(gè)關(guān)于XDH的重要方案發(fā)現(xiàn)CC=0.263，R=56.1%，而并非平均值為CC=0.205，R=58.2%。由MAD的解決方案[13]可知，4個(gè)鐵位點(diǎn)可以相當(dāng)于SOLVE程序中XDH晶體里4個(gè)預(yù)期Fe/S集群。然而，利用以上信息尚不能獲得單一鐵原子的定位信息。因此，計(jì)算過程完全基于MAD的信息，但未能充分闡釋電子密度圖。一旦分子置換方案確認(rèn)了Fe/S集群的位點(diǎn)，定義了Fe/S集群的取向，MAD階段將在SHARP程序應(yīng)用下提升到數(shù)據(jù)全析的高度[14]。最終的參數(shù)為離心0.42，中心反射0.38。為充分利用這2個(gè)獨(dú)立來源的相位信息，部分重建和改進(jìn)模型相結(jié)合，MAD階段將按照程序SIGMAA執(zhí)行[15]。溶劑扁平化和在4.0 ?下以平均2倍密度的相延伸會在DM中發(fā)生[16]。由此產(chǎn)生的電子密度圖就可以在O程序輔助下大致追蹤每個(gè)亞基中1 280個(gè)片段[17]。這個(gè)模型使用程序CNS而得到進(jìn)一步校正，通過27.3%的R因子 (游離 R =30.0%)得以修正。內(nèi)含2 049個(gè)水分子(平均B-因子為39.8?2)的XDH模型通過非晶體學(xué)對稱的約束條件，用19.8%的R-因子(Rfree=23.8%)進(jìn)行修正。經(jīng)修正后XDH模型轉(zhuǎn)移到XO電子密度圖中，經(jīng)CNS程序校正，將通過O程序進(jìn)行重建[18]。在最后的模型中，XO結(jié)構(gòu)內(nèi)含597個(gè)水域(平均B-因子為51.1 ?2)， 由21.2%的R-因子 (Rfree=27.5%)校正。表1中列出的是收集到的參數(shù)和修正數(shù)據(jù)。

2 黃嘌呤脫氫酶、黃嘌呤氧化酶的結(jié)構(gòu)對比

XDH二聚體的分子結(jié)構(gòu)主要分成3個(gè)區(qū)域和2個(gè)連接環(huán)。從N末端到 C末端，出現(xiàn)的分別域是鐵/硫中心域(3～165殘基)、FAD域(226～531殘基)和Mo-pt域(590～1331殘基)。

XDH單體可以分為3個(gè)域。小N端域(1～165殘基)有鐵/硫輔助因子，并且通過166～225個(gè)殘基組成的長條物，連接到第2個(gè)FAD-捆綁域 (226～531殘基)， 其中第166～191個(gè)殘基是看不到電子密度的。FAD域由另一個(gè)連接段(532～589殘基)連接到第3個(gè)域，連接段部分無序，晶體結(jié)構(gòu)中也看不到第532～536個(gè)殘基的結(jié)構(gòu)。第590～1 332個(gè)殘基的第三個(gè)大域隔離了靠近結(jié)合Fe/S和FAD域界面的鉬喋呤輔因子。C端第1 310～1331個(gè)殘基在晶格中接觸到另一個(gè)分子，使得它們在電子密度更清晰可見。然而，在不斷變化中，它們很可能是無序的C末端晶體。

因?yàn)槊芏炔蛔愣г赬DH模型中的殘基位于分子表面。亮氨酸Leu 219和賴氨酸Lys 569的胰酶位點(diǎn)切割的C端殘基位于多變的FAD域連接段。在老鼠XDH中，胰蛋白酶切斷Lys 184和Lys 551后部。這些殘基屬于相應(yīng)的連接段，但是只有這種Lys 551的酶切割方式才能導(dǎo)致轉(zhuǎn)換[19]。這種溫和的蛋白水解能將XDH同型二聚體轉(zhuǎn)換成一對異三聚體，亞基結(jié)構(gòu)與生理活性相同[9]。這2種氨基酸之一的半胱氨酸Cys 992被氟二硝基苯修飾，引發(fā)XDH和XO形式之間的可逆轉(zhuǎn)換，成為Mo-pt域的一部分[19]。位于連接FAD域和Mo-pt域多變段的Cys 535是另外一個(gè)被該反應(yīng)修飾的殘基。

2.1 鉬喋呤域盡管目前的分辨率水平還不能僅依靠電子密度確定束縛鉬離子的原子化學(xué)性質(zhì)，但之前文獻(xiàn)報(bào)道已確定3個(gè)配體和2個(gè)喋呤輔因子亞硫酸鹽[3]。在XDH結(jié)構(gòu)中，氧化型酶中有一個(gè)雙鍵硫原子、雙鍵氧原子和一個(gè)作為鉬離子配體的單鍵氧原子。單鍵氧原子是從溶劑水中補(bǔ)給鉬中心的，會在催化反應(yīng)中被轉(zhuǎn)移作為酶反應(yīng)基底[13]。在用于結(jié)晶的蛋白質(zhì)制備中，約25%的XDH含有一個(gè)硫原子被一個(gè)氧原子取代的Mo-pt非活性中心。為了保護(hù)Mo-pt的活性部位，可在2種酶形式的提純和結(jié)晶過程中，加入1 mol/L水楊酸鈉。水楊酸鹽已被證實(shí)是一種與鉬活性部位底物競爭性結(jié)合的抑制劑[2-3]。在XDH晶體結(jié)構(gòu)中，在活性部位距離鉬離子6.5 ?處發(fā)現(xiàn)有水楊酸分子。盡管水楊酸本身不綁定到Mo-pt輔因子，但是它阻礙生成金屬絡(luò)合物的潛在基底通道。

水楊酸分子通過幾個(gè)氫鍵和靜電相互作用穩(wěn)定在活性部位，其所含的一對羧酸鹽原子靠近Arg 880的胍基(3.0和3.1 ?)；同時(shí)，它們也綁定到Thr 1010(3.0 ?) 的羥基側(cè)鏈以及通過水分子230通道綁定到Glu 1261的羧酸鹽。鉬離子附近的Glu-H2O相互作用已被D.gigasALO結(jié)構(gòu)預(yù)測推斷出來[7-8]。水楊酸的羥基使得酰胺主干和Thr 1010 (分別為3.2和2.9 ?) 的羥基側(cè)鏈之間形成氫鍵。芳香族抑制劑與距離3.5 ?的Phe 914環(huán)平行對齊，但2個(gè)芳香環(huán)僅略有重疊。同時(shí)，Phe 1009的苯基環(huán)通過最近距離為3.7 ?的通道，與水楊酸環(huán)中心發(fā)生交互側(cè)立?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，可以建立二環(huán)底物結(jié)合模型，例如有垂直于黃嘌呤六元環(huán)的Phe 1009，還有位于底物五元環(huán)頂上的能與其中一個(gè)鉬配體形成共價(jià)鍵的Phe 914疊加平面?；钚圆课挥袔讉€(gè)有序排列的水分子，但由于有水楊酸和氧化性輔因子的存在，還不能確定具體是由哪個(gè)水分子提供氧原子，進(jìn)而并入產(chǎn)物中。

2.2 鐵/硫域XDH的N端域包含2個(gè)結(jié)構(gòu)排列非常類似于D.gigasALO[7]和O.carboxidovoransCOD[9]中鐵硫域的Fe/S綁定簇子域。N端子域有一個(gè)[2Fe-2S]簇。它能協(xié)調(diào)至Cys 43、Cys 48、Cys 51、Cys 73，并且位于接近核黃素環(huán)的7α，8α-甲基團(tuán)[20]。C端子域則有一個(gè)四螺旋束，其簇能在Mo-pt活性部位協(xié)調(diào)至Cys 113、Cys 116、Cys 148和Cys150。

根據(jù)各自不同的電子順磁共振信號(EPR)，分別指定兩個(gè)簇為Fe/S I和Fe/S II。Fe/S I的信號與菠菜鐵氧還蛋白中的相似，而且在溫度達(dá)到40 K時(shí)易觀察到。然而，另一個(gè)Fe/S II的信號大體上是更大片的線條，而且只可在低于22 K時(shí)觀察得到[3]。這2個(gè)簇的氧化還原勢也不同于在-235 mV下測得Fe/S II的氧化還原勢和在-310 mV 25 ℃下測得Fe/S I的氧化還原勢[21]。至于大鼠肝酶，這2個(gè)EPR信號通過定點(diǎn)誘變分配給各自的排列基序。綁定到非一般C端簇 -Cys-Xaa2-Cys-//-Cys-Xaa1-Cys- 的圖形顯示了Fe/S I信號，而Fe/S II信號是屬于N端簇的[22]。通過結(jié)合電子順磁共振測量和晶體研究成果，可了解COD的等價(jià)分配[23]。

有趣的是，替換的Cys 43可以通過絲氨酸作為Fe/S II中心的一個(gè)鐵原子配位體，導(dǎo)致它的EPR譜和氧化還原勢發(fā)生變化[22]。與此相反，Cys 51位的類似突變卻對另一個(gè)鐵原子配體的特性無明顯影響。晶體結(jié)構(gòu)顯示了鐵a與核黃素7α甲基的碳原子有7.8 ?的距離。與最近Fe/S I的鐵原子有12.4 ?的距離。這兩段間距明顯要比Cys 51配體鐵原子b間距、FAD或Fe/S I輔因子中的最近原子間距 (分別為8.1和14.1 ?)小得多。鉬鐵間距和Fe/S I簇最短鐵原子間距是14.7 ?，確立了基于2個(gè)順磁中心間的計(jì)算估計(jì)量為14 ?。根據(jù)上述幾何分布及中心的氧化還原勢，電子從鉬原子到2個(gè)Fe/S中心的轉(zhuǎn)移是一個(gè)熱力學(xué)有利的變化過程[24]。除Mo-pt和Fe/S I的相互作用(Mo-pt的2個(gè)氨基取代基和Cys150的Sγ之間的范德華力)，明顯沒有連接其他輔因子的“貫穿綁定”通道。既然它們的間距比14 ?要小，那么隧道效應(yīng)是最可能的電子運(yùn)輸機(jī)制[25-26]。

2.3 FAD域FAD域是黃素蛋白家族的遠(yuǎn)親，還包含香草基醇氧化酶(VAO)和UDP-N-乙酰基烯醇式丙酮酸葡萄糖胺還原酶 (MurB)。MurB是一種參與細(xì)菌細(xì)胞壁生物合成的酶[27]。COD的FAD綁定亞基M是該家族另一個(gè)成員。將XDH的FAD域和COD進(jìn)行比較后，發(fā)現(xiàn)當(dāng)該域被分成2個(gè)子域后與XDH中的殘基413和COD中的殘基176有更精確的匹配。當(dāng)將XDH中殘基233～413的Cα原子位置與COD中殘基5～176的進(jìn)行比照時(shí)，顯示出1.4 ?的均方根偏差。而另一半FAD域 (XDH中殘基 414～526和COD中殘基177～285)均方根偏差是1.7 ?。雖然相比于XDH， COD中黃素環(huán)位置傾斜到結(jié)合囊中，但是2個(gè)域之間的相似點(diǎn)也延伸到圍繞異咯嗪環(huán)嘧啶部分的氫鍵模式。FAD并合成一個(gè)處于深裂中的擴(kuò)展構(gòu)象，其異咯嗪環(huán)在Si-面上高度親溶劑。NAD分子有足夠的空間伸展煙酰胺環(huán)方向，使之與異咯嗪平行。畜禽類如雞的XDH殘基Tyr 419經(jīng)親和標(biāo)記后，使用對氟磺酰苯甲酰腺苷鹽酸鹽進(jìn)行NAD結(jié)合干擾[28]。畜牧類如牛的XDH中相應(yīng)的殘基(Tyr 393)位于靠近FAD結(jié)合裂縫的表面?？梢韵胂蟮牡剑绱她嫶蟮幕鶊F(tuán)被加入到其環(huán)中足以阻礙與NAD的結(jié)合。盡管有FAD輔因子的便捷通道，XDH卻展現(xiàn)出相對較低的氧活性。酶基質(zhì)中黃素中性半醌的穩(wěn)定化處理，可以用來闡明這個(gè)現(xiàn)象[2]。

在黃素輔因子一側(cè)的Phe 337側(cè)鏈，與異咯嗪環(huán)嘧啶部分發(fā)生π-π反應(yīng)。相當(dāng)于牛奶XDH中Phe 337的殘基，被保留在已知的黃嘌呤氧化還原酶中，畜牧類如牛的ALO芳香族氨基酸為亮氨酸所取代。還應(yīng)該指出的是，Asp 429帶負(fù)電荷的側(cè)鏈距離黃素的C6只有3.6 ?，附近并沒有直接電荷補(bǔ)償。只有幾個(gè)環(huán)繞著Asp 429的水分子依次與FeyS II醛酮類主干結(jié)合成環(huán)。一般的靜電效應(yīng)可以通過異咯嗪環(huán)和一些醛酮類主干間7α-和 8α-甲基原子團(tuán)短時(shí)間接觸而增加。8α-甲基碳原子距離Thr 262的羰基3.5 ?，距離Glu 45的羰基3.3 ?。7α-甲基碳原子則距離Gly 46的羰基3.2 ?。Glu 45和Glu 46屬于Fe/S II中心的緊密循環(huán)結(jié)合，同時(shí)將Fe/S 簇與黃素環(huán)分隔開。

2.4 XDH和XO形式的比較XDH和X O的電子密度圖之間最明顯的區(qū)別在于， XO的圖中沒有更長的多肽鏈，如在XDH的氨基酸529～570組成一個(gè)α螺旋、一個(gè)β折疊和一個(gè)環(huán)，共同跨越約70 ?的距離。盡管可以把在XDH晶體結(jié)構(gòu)丟失的電子密度歸屬于相應(yīng)的殘基遷移率(酶在十二烷基磺酸鈉SDS凝膠中以單波段運(yùn)行)，可想而知在XO形式中，考慮到蛋白水解物的性質(zhì)，丟失的氨基酸實(shí)際上是從蛋白質(zhì)分子中遷移了。XDH和XO的全折疊依然非常相似，在2個(gè)Fe/S中心或附近和Mo-pt中心無觀顯著變化。XDH和XO中結(jié)合Fe/S域和Mo-pt域之間Cα位置的均方根偏差為889Cα原子的0.34 ?。一般的結(jié)構(gòu)保持與動力學(xué)研究相一致，說明2種結(jié)合酶的形式之間和Mo-pt中心用于催化的底物間無顯著性差異[2]。從XDH到XO的可逆轉(zhuǎn)換可以通過修飾Cys 535和Cys 992而獲得[19, 29]。Cys 992的Cα原子和殘基537相距 15.7 ?。二硫鍵的形成是其中一種可能的轉(zhuǎn)換機(jī)制。關(guān)于氧化性XDH/XO轉(zhuǎn)換的更加深入的結(jié)構(gòu)解釋，要等半胱氨酸修飾蛋白的晶體衍射特性明晰之后才能得到。XDH的胰蛋白酶水解作用于Lys 551后或胰酶裂解Leu 219和Lys 569后，導(dǎo)致XO不可逆轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)換。XO分子晶體可通過胰酶水解作用制備出來，因此其可能是在Leu 219和Lys 569后被裂解。但是，在XO中，它們依然是兩段高度活躍或不存在的鏈中延伸碎片的一部分。

FAD的活性位點(diǎn)發(fā)生了從XDH轉(zhuǎn)換為XO最大變化的酶的一部分[2-3]。令人驚訝的是，所有在轉(zhuǎn)換過程起作用的氨基酸都位于FAD域活性位點(diǎn)裂解入口的對立側(cè)。它們距離黃素輔因子至少有18 ?，因此直接影響FAD周圍結(jié)合位點(diǎn)的殘基定向是不大可能的。但是，在XDH中，Phe 549周圍的鏈緊貼著Arg 427的側(cè)鏈；因斷裂成肽鏈而去除這種XO的交互作用，可能引發(fā)大量穿過對面黃素環(huán)Si側(cè)的高度帶電荷環(huán)(Gln 423-Lys 433)的結(jié)構(gòu)重排。這種轉(zhuǎn)換從它與黃素環(huán)的C6原子近距離接觸，進(jìn)而用Arg 426側(cè)鏈取代它作為黃素最近的基團(tuán)，最終清除Asp 429的側(cè)鏈，也徹底改變黃素外界的靜電勢。在這個(gè)過程中，一些XDH形式的酶殘基相對于原來的位置移動了多達(dá)20 ?。相比之下，在XDH到XO的轉(zhuǎn)換過程中，除堆疊越過黃素嘧啶部分的Phe 337有輕微移動外，黃素環(huán)re側(cè)的結(jié)構(gòu)性特性在很大程度上未受到干擾。

2種形式酶間發(fā)生的靜電分歧強(qiáng)有力地證明了先前發(fā)現(xiàn)的XDH 通過多于4個(gè)pH單位轉(zhuǎn)移了可電離取代基的pK的研究。假設(shè)Gln 423-Lys 433環(huán)的新位置之后，限制了基底NAD+通向 FAD輔因子的通道。這種變化在沒有干擾交替基底、氧氣和異咯嗪環(huán)間的相互作用前提下限制了脫氫酶活性。動力學(xué)差異以及XDH和XO的氧化還原反應(yīng)可以解釋NAD+結(jié)合位點(diǎn)的存在，同時(shí)FADH/FADH2對能夠大幅降低還原電位，相當(dāng)于在XDH和XO的黃素半醌穩(wěn)定化處理。

3 小結(jié)與展望

哺乳動物的黃嘌呤氧化還原酶類，主要催化尿酸形成的最后2個(gè)步驟，可以合成脫氫形式的XDH，但也很容易被含巰基殘留物氧化或發(fā)生蛋白水解作用，而轉(zhuǎn)化為氧化形式的XO。XDH外露閉環(huán)的裂解，導(dǎo)致類似于黃素閉環(huán)(谷氨酰胺Gln 423-賴氨酸olys 433)主要結(jié)構(gòu)的重排。該轉(zhuǎn)化歷程將部分阻礙把煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)基質(zhì)變化成FAD的輔助因子，減少活性部位的靜電環(huán)境變化，反映這2種形式酶的底物專一性轉(zhuǎn)化。但是，為了更好地界定從XDH轉(zhuǎn)換到XO的結(jié)構(gòu)依據(jù)，需要用更高的分辨率去擴(kuò)展對XDH和XO的分析。

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Study on Xanthine Dehydrogenase and Xanthine Oxidase Structure from Dairy

GUO Xiao-lei, SHI Bin, ZHANG Ting

(R&D Infinitus (China) Ltd, Guangzhou, Guangdong 510641)

Recent years, hyperuricemia has became more and more popular worldwidely. Xanthine dehydrogenase (XDH) and xanthine oxidase (XO) are two key enzymes that participate the occurrence and the development of gout, which are very important targets for gout therapy. By inhibiting those enzyme activities, the uric acid level in blood plasma could be decreased. The crystal structure of the dimeric (Mr, 290,000) bovine milk XDH at 2.1-? resolution and XO at 2.5-? resolution were presented. Besides, the major changes that occur on the proteolytic transformation of XDHto the XO form were described as well.

Xanthine dehydrogenase; Xanthine oxidase; Structure analysis

郭曉蕾(1975-)，女，遼寧鐵嶺人，中級工程師，碩士，從事保健食品開發(fā)。

2014-12-17

S 188；TS 202.3

A

0517-6611(2015)04-001-04