基于飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)降解檢材的插入缺失遺傳多態(tài)性檢驗(yàn)

馮 銳，周建波(.湖南省公安廳 刑偵總隊(duì)，湖南長(zhǎng)沙40000;.永州市公安局 刑偵支隊(duì)，湖南永州45000)

基于飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)降解檢材的插入缺失遺傳多態(tài)性檢驗(yàn)

馮 銳1，周建波2
(1.湖南省公安廳 刑偵總隊(duì)，湖南長(zhǎng)沙410000;2.永州市公安局 刑偵支隊(duì)，湖南永州425000)

目的 通過采用飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)對(duì)插入缺失遺傳多態(tài)性遺傳標(biāo)記的檢驗(yàn)，探討該技術(shù)對(duì)降解檢材的DNA分型策略。方法 提取切片DNA，在用STR試劑盒檢測(cè)未能獲得分型結(jié)果的情形下，采用多重PCR和飛行質(zhì)譜技術(shù)對(duì)常染色體上的30個(gè)InDel位點(diǎn)進(jìn)行分型檢測(cè)。結(jié)果對(duì)于STR分型失敗的切片，InDel分型獲得成功。結(jié)論對(duì)于切片等微量、降解的生物學(xué)檢材，若常染色體STR基因座分型失敗，可嘗試進(jìn)行InDel位點(diǎn)的分型，以獲得更多的遺傳信息。

法醫(yī)遺傳學(xué);插入缺失遺傳多態(tài)性;飛行時(shí)間質(zhì)譜

在法醫(yī)學(xué)實(shí)踐中，經(jīng)常會(huì)遇到一些降解嚴(yán)重的生物學(xué)檢材，普遍采用的STR檢測(cè)試劑盒或MiniSTR檢測(cè)試劑盒往往得不到理想的分型結(jié)果。這種情形下，選用其他遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢測(cè)，往往能獲得一定的信息量。本研究針對(duì)一起特殊的個(gè)體識(shí)別案件，采用飛行質(zhì)譜分型技術(shù)成功地進(jìn)行了插入缺失遺傳多態(tài)性遺傳標(biāo)記(Insertion/Deletion polymorphism，InDel)檢驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 樣本

醫(yī)院保存的石蠟包埋組織切片，編為1號(hào);人體毛發(fā)，編為2號(hào)。

1.2 試劑與儀器

384微孔板(美國(guó)SEQUENOM公司);IdentifilerTM試劑盒(美國(guó) AB公司);MinifilerTM試劑盒(美國(guó) AB公司);9700型擴(kuò)增儀(美國(guó)AB公司);3500XL型遺傳分析儀(美國(guó)AB公司);芯片(MassARRAY SpectroCHIP，美國(guó)Sequenom公司);MALDI-TOF質(zhì)譜儀(美國(guó)Sequenom公司)。

1.3 基因組DNA的提取

基因組DNA的制備采用Chelex-100法。

1.4 常染色體STR基因座分型

采用 IdentifilerTM試劑盒對(duì)常染色體上 15個(gè)STR基因座進(jìn)行分型檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系總體積為12.5 μL，PCR組分及反應(yīng)條件參照說明書。

1.5 常染色體MiniSTR基因座分型

采用MinifilerTM試劑盒對(duì)常染色體上8個(gè)STR基因座進(jìn)行分型檢測(cè)。PCR反應(yīng)體系總體積為12.5 μL，PCR組分及反應(yīng)條件參照說明書。

1.6 InDel位點(diǎn)的選擇

參照李成濤等［1］的文章，選定在常染色體上的30個(gè)InDel位點(diǎn) (見表1)，PCR擴(kuò)增體系的為15.0 μL，包括 MasterMix 7.5 μL，Q-solution 1.5 μL，PrimerMix 3.0 μL，模板DNA 3.0 μL。PCR擴(kuò)增條件為:95℃11 min;94℃ 30 s，57℃ 90 s，72℃ 90 s，共30個(gè)循環(huán);60℃延伸60 min。PCR反應(yīng)在9700擴(kuò)增儀上進(jìn)行。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，用蝦堿性磷酸酶(Shrimp Alkaline Phosphatase，SAP)酶進(jìn)行酶切反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)? 37℃40min;85℃5min。接著，進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)(體積為2 μL)，體系中含10×iPlex緩沖液0.2 μL，iPlex終止反應(yīng)液0.1 μL，Plex酶0.02 μL，0.94 μL延伸引物。延伸反應(yīng)程序?yàn)?94℃ 30 s;94℃ 5 s，(52℃5 s，80℃5 s)5次小循環(huán)，40次大循環(huán);72℃3min。將產(chǎn)物用樹脂純化，轉(zhuǎn)移至表面覆蓋基質(zhì)的芯片，用MALDI-TOF質(zhì)譜儀檢測(cè)，TYPER軟件分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果，獲得分型數(shù)據(jù)。

表1 30個(gè)InDel位點(diǎn)信息

2 結(jié)果

2.1 常染色體STR基因座分型結(jié)果

提取切片的DNA后，采用IdentifilerTM試劑盒、MinifilerTM試劑盒對(duì)常染色體上的STR基因座進(jìn)行檢測(cè)，均未檢見PCR產(chǎn)物。

2.2 InDel位點(diǎn)的分型結(jié)果

切片DNA經(jīng)多重PCR體系的擴(kuò)增，30個(gè)InDel位點(diǎn)均獲得分型結(jié)果，與對(duì)照毛發(fā)比對(duì)發(fā)現(xiàn)，兩者基因型一致。經(jīng)計(jì)算，似然率為5.56×1024。

3 討論

本案中切片組織是唯一的線索，對(duì)切片DNA遺傳信息的獲取對(duì)于案件的偵破具有重要意義。通過對(duì)切片DNA進(jìn)行傳統(tǒng)的STR檢測(cè)，均未獲得有效的分型結(jié)果，因此嘗試采用新的技術(shù)如SNP分型或插入缺失分型也許能夠獲得較好效果。InDel作為一種特殊的二態(tài)性遺傳標(biāo)記，與SNP具有相近的突變率，其突變率顯著低于STR。同時(shí)，InDel的兩個(gè)等位基因表現(xiàn)為片段長(zhǎng)度多態(tài)性，這又與STR等位基因的特征類似，因而成為法醫(yī)DNA鑒定關(guān)注的熱點(diǎn)［2］。

本實(shí)驗(yàn)參照李成濤課題組的研究成果，對(duì)切片DNA成功進(jìn)行了30個(gè)InDel位點(diǎn)的檢測(cè)，獲得了有效的遺傳信息，為本案?jìng)善铺峁┝酥匾€索。對(duì)于選擇的這30個(gè)InDel位點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)采用了另外一種技術(shù)平臺(tái)即飛行時(shí)間質(zhì)譜。該技術(shù)源自美國(guó)Sequenom公司研發(fā)的SNP檢測(cè)系統(tǒng)，判讀SNP分型結(jié)果的方法簡(jiǎn)便易行［3-4］。在質(zhì)譜圖上，每一個(gè)SNP位點(diǎn)有3條線，對(duì)應(yīng)3個(gè)質(zhì)量的檢測(cè):第一條線對(duì)應(yīng)的是未延伸引物(UEP);第二、三條線對(duì)應(yīng)兩個(gè)等位基因，哪條線出峰，就代表具有對(duì)應(yīng)的等位基因;若均不出峰，表明為陰性結(jié)果。本研究的30個(gè)InDel位點(diǎn)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度范圍為88～128bp，比Minifiler試劑盒的擴(kuò)增產(chǎn)物短，這也是能夠分型成功的可能原因。該案例的分型成功，提示InDel對(duì)于STR、MiniSTR分型失敗的微量、降解檢材可能是一種有效的補(bǔ)充工具。

［1］Chengtao Li，Suhua Zhang，Shumin Zhao.Genetic analysis of 30 InDel markers for forensic use in five different Chinese populations［J］.Genet.Mol.Res，2011，10(2):964-979.

［2］Mills RE，Luttig CT，Larkins CE，et al.An initial map of insertion and deletion (INDEL)variation in the human genome［J］.Genome Res，2006，16(9):1182-1190.

［3］Hofstadler SA，Hall TA，Sannes-Lowery KA，et al.Analysis ofDNA forensic markers using high throughputmass spectrometry［J］.Forensic Sci Int.Genetics Supplement Series，2009，(2):524-526.

［4］Planz J，Budowle B，Hall T，et al.Enhancing resolution and statistical power by utilizing mass spectrometry for detection of SNPs within the short tandem repeats［J］.Forensic Sci Int. Genetics Supplement Series，2009，(32):529-531.

(本文編輯:李成濤)

InDeI Typing of Degraded DNA by Time-of-fIight Mass Spectrometry

FENG Rui1，ZHOU Jian-bo2
(1.Criminal Investigation Corps of Public Security Bureau of Hunan Provice，Changsha 410000，China; 2.Criminal Investigation Detachment of Yongzhou Public Security Bureau，Yongzhou 425000，China)

Objective The method for DNA typing of insertion/deletion polymorphism markers from degraded DNA was explored based on the technology of time-of-flight mass spectrometry.MethodGenomic DNA was prepared from slice samples，and multiplex PCR was carried out.When no typing results were obtained using STR kits，samples were further analyzed using 30 InDels by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF).ResuItsFull profiles of InDels loci were obtained.ConcIusionFor typing of DNA from trace or degraded biological samples，analysis of InDel markers by MALDI-TOF can provide more genetic information even when STR genotyping fails.

forensic genetics;insertion/deletion polymorphism;time-of-flight mass spectrometry

DF795.4

A

10.3969/j.issn.1671-2072.2015.06.010

1671-2072-(2015)06-0057-03

2015-03-12

馮銳(1984-)男，法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)物證學(xué)鑒定。E-mail:277038570@qq.com。