香菇高產(chǎn)胞外多糖優(yōu)良菌株的篩選

胡 雯,蕭 晟,張冬冬,湯 強

蕪湖職業(yè)技術學院生物工程學院，安徽蕪湖，241003

?

香菇高產(chǎn)胞外多糖優(yōu)良菌株的篩選

胡 雯,蕭 晟,張冬冬,湯 強

蕪湖職業(yè)技術學院生物工程學院，安徽蕪湖，241003

對20個香菇菌株進行了胞外多糖產(chǎn)量等指標比較，依據(jù)菌絲生長速度、菌絲致密度、液體搖瓶菌球的干重、密度、大小以及胞外多糖產(chǎn)量等生物學性狀進行初步篩選。在此基礎上，篩選出性狀較優(yōu)良菌株Le06、Le10和Le16。并對這3個菌株胞外多糖產(chǎn)量的穩(wěn)定性進行分析比較，最終篩選出了具有菌球生物量大、胞外多糖產(chǎn)量高和穩(wěn)定的香菇菌株Le10，該菌株的生物量和產(chǎn)胞外多糖量達到0.98 mg·mL-1和0.78 mg·mL-1，具有較好的應用潛力。

香菇；胞外多糖；菌株篩選

中國香菇栽培歷史悠久，近年來香菇產(chǎn)業(yè)得到了迅猛發(fā)展，當前年產(chǎn)量達250 萬t，已居世界第一位，香菇已成為多地農(nóng)業(yè)中的支柱性產(chǎn)業(yè)[1]。但由于香菇存在著菌種老化、品種退化等問題，嚴重制約香菇產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2-3]。安徽省是我國香菇栽培面積最大的省份之一，但現(xiàn)有的香菇種質資源有限，無法滿足市場需求，對香菇優(yōu)良菌種的需求量不斷加大。安徽省的香菇野生種質資源較為豐富，具有研究和開發(fā)野生高產(chǎn)菌株的巨大潛力，其野生資源主要分布于皖西大別山和皖南山區(qū)[4]。當前香菇研究中有很多關于高產(chǎn)菌株的報道[5-7]。劉振欽等在吉林省多地采集野生香菇菌株，通過分離、篩選、出菇試種，選育出香菇9101為優(yōu)良的高產(chǎn)菌株，為下一步的優(yōu)良香菇種質資源奠定基礎[7]。

香菇多糖是研究較為深入的多糖之一，具有增強人體免疫力、抗腫瘤、抑菌、降血脂、防治動脈血管硬化以及抗氧化等多種功能[8-9]。近年來在國內(nèi)外形成了研究香菇多糖的熱潮，但在現(xiàn)有報道中，有關香菇產(chǎn)高產(chǎn)胞外多糖菌株篩選的報道卻很少見，僅見于對5個常見栽培菌株的發(fā)酵條件及培養(yǎng)基成分的初步優(yōu)化，從中篩選了菌株1363A為高產(chǎn)香菇胞外多糖的菌株[10]。而關于安徽野生香菇種質資源利用的相關研究少有報道，特別是有關安徽野生香菇菌株篩選高產(chǎn)胞外多糖的研究未見報道。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 供試菌株

選擇生長性狀良好的20株香菇菌株用于試驗，其中4株為香菇的栽培品種，分別來源于安徽舒城、上海市、浙江省和福建省，16株為采集于安徽皖南山區(qū)和大別山區(qū)的野生香菇菌株。供試菌株編號、來源詳見表1。

表1 供試香菇菌株來源及生態(tài)類型

1.1.2 培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基(PDA)：馬鈴薯(去皮切碎，沸水煮30 min后過濾)200 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，瓊脂20 g·L-1，復合維生素B 20 mg，pH自然，蒸餾水定容。

液體培養(yǎng)基：黃豆粉(沸水煮30 min后4層紗布過濾)20 g·L-1，葡萄糖20 g·L-1，酵母10 g·L-1，KH2PO450 mg·L-1，MgSO4·7H2O 50 mg·L-1。

栽培袋培養(yǎng)料配方：麩皮25 kg，木屑100 kg，過磷酸鈣(生石灰)0.5 kg，石膏粉2.5 kg，蔗糖1 kg，水130 kg。

1.2 實驗方法

1.2.1 單孢分離

孢子的收集：2010-2012年從安徽省各地采集16株野生香菇菌株，并從4個菌種廠分別采摘菇形優(yōu)良、無病蟲害的栽培株進行室內(nèi)分離。采用貼附法彈射孢子，剪取一小塊成熟的菌褶或小塊菌蓋，貼附在無菌培養(yǎng)皿(121℃高溫滅菌20 min)皿蓋上，皿內(nèi)放有濕棉花進行保濕，經(jīng)6～12 h，待孢子落下后(培養(yǎng)皿上有白色孢子)，立即將培養(yǎng)皿中彈射的孢子移到另一消毒過的空試管，封口保存?zhèn)溆?用于孢子單核體的制備)。

單孢分離：在無菌接種臺上從已產(chǎn)孢的香菇菌株培養(yǎng)皿中，用小勺挖取一定量孢子到裝有20 mL無菌水的三角瓶中，用高速分散器(1 000 r/min)打散10 min后，梯度稀釋香菇孢懸液至20 mL，鏡檢觀察直到每滴稀釋液中只有一個孢子，當發(fā)現(xiàn)單個菌落時，轉到新PDA培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)，并在培養(yǎng)過程中通過不斷鏡檢以確定是否為單孢菌落。

1.2.2 菌株生長速度測定

將保存于4℃冰箱的20株香菇菌株的斜面放入25℃恒溫培養(yǎng)箱，進行12 h的活化培養(yǎng)備用。分別將20個香菇菌株進行拮抗對峙試驗，試驗結果表明，各菌株間均產(chǎn)生明顯的拮抗線，表明各菌株為不同種類。采用王偉、許月明的菌株生長速度測定方法測定香菇的平均生長速度[11-12]。

1.2.3 菌球密度、直徑及干重的測定

使用5 mL移液槍分別將20個香菇菌株定量(10%的接種量)接到液體培養(yǎng)基中，置于25℃下150 r/min 培養(yǎng)7 d，每菌株設置3個重復。培養(yǎng)好的發(fā)酵液澄清、無異味、含有大量的菌球，菌球大小均勻、帶刺，并且直徑在1 mm左右。

菌球數(shù)量測定：用微量移液器在培養(yǎng)好的搖瓶中吸取l mL發(fā)酵液攤勻于培養(yǎng)皿中，用無菌水稀釋10倍，再用放大鏡直觀計數(shù)菌球數(shù)量，每菌株取3次求平均值(個·mL-1)。

菌球直徑測定：用移液槍分別取1 mL發(fā)酵液，倒入空培養(yǎng)皿中，測量15個菌球在培養(yǎng)皿中排成一列的總長度，按1 mL發(fā)酵液含菌球的大小的數(shù)量比，然后計算單個菌球的直徑，每菌株取3次求平均值(mm)。

菌絲體生物量測定：將液體發(fā)酵液用4層紗布過濾，取出菌球并用蒸餾水洗滌3次，然后放入100℃干燥箱烘干2 h至恒重，用電子分析天平分別稱量各菌株菌絲體干重(g·mL-1)，每菌株均為3個重復。

1.2.4 胞外粗多糖的測定

香菇多糖的制備：按文獻[14]的方法；多糖的含量測定采用苯酚-濃硫酸法[13]。

1.2.5 香菇高產(chǎn)株的遺傳穩(wěn)定性測試

將3株高產(chǎn)胞外多糖菌株Le06、Le10和Le16接種于PDA斜面培養(yǎng)基上傳代10次，傳代前后分別在平板上培養(yǎng)7 d，再液體培養(yǎng)5 d后分別將3個菌株以10%的接種量接到液體培養(yǎng)基中，每菌株設置3個重復，置25℃下150 r/min 培養(yǎng)7 d，分別測其傳代前、第5代和第10代的產(chǎn)胞外多糖含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

對試驗數(shù)據(jù)采用SPSS (17.0) 數(shù)據(jù)處理軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結果與分析

2.1 菌絲生長性狀的測定

由表2可知，各菌種在培養(yǎng)基上的生長性狀差異較大，菌株Le02、Le06、Le10、Le16和Le19的日生長量最大，分別達到0.56、0.59、0.54、0.56和0.59 cm，統(tǒng)計分析表明與其他15種菌株差異達到極顯著水平，而且Le02、Le06、Le10、Le16和Le19菌株的菌絲濃密、生長粗壯且菌落表面潔白；而菌株Le20的生長速度最慢，平均生長速度僅為0.22 cm·d-1。

表2 菌株的生長性狀測定

2.2 搖瓶菌球生長情況的測定

由表3可以看出，20株菌株在液體培養(yǎng)基中長勢存在一定差異，菌株Le06、Le10、Le16和Le19的菌絲體生物量較大，分別為0.95、0.98、0.97和0.94 mg·mL-1；菌株Le17、Le18和Le20的菌絲體生物量最小；菌株Le06、Le10和Le16的菌球密度最多，分別為796.80個、787.20和791.50個，菌球濃密且大小均勻。綜合考慮，菌株Le06、Le10、Le16和Le19搖瓶培養(yǎng)基中均長勢好，菌絲體生物量大，菌絲球呈現(xiàn)出均勻的細小顆粒，其外圍仍然表現(xiàn)出凸起的小尖刺。

表3 菌株的菌球生長情況測定

2.3 胞外粗多糖含量的測定

表4顯示，不同菌種在液體培養(yǎng)基中產(chǎn)胞外多糖量差異較大，菌株Le06、Le10和Le16的產(chǎn)多糖量較大，分別為0.79、0.78和0.76 mg·mL-1，菌株Le20產(chǎn)糖量最小，僅為0.34 mg·mL-1。因此，選用Le06、Le10和Le16這3個菌株進行下一步的穩(wěn)定性復篩試驗。

2.4 菌株產(chǎn)胞外多糖的穩(wěn)定性

對3個性能優(yōu)良的突變株Le06、Le10和Le16經(jīng)過10次轉接，考察經(jīng)過轉接后菌株產(chǎn)胞外多糖含量的穩(wěn)定性。結果顯示，菌株Le06和Le16經(jīng)過傳10次轉接后，產(chǎn)胞外多糖的平均值下降了23%和 21.9%；而菌株Le10傳代10次后產(chǎn)胞外多糖的平均值僅下降了3.8%(表5)，表明菌株Le10產(chǎn)胞外多糖比較穩(wěn)定，選擇該菌株作為下一步研究菌株。

表4 菌株的胞外多糖含量測定

表5 高產(chǎn)胞外多糖菌株遺傳穩(wěn)定性測定

3 討 論

目前香菇菌種市場出現(xiàn)比較嚴重的品種混雜，同種異名、同名異種等現(xiàn)象，直接影響了香菇產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展，因此需要加大香菇菌種的規(guī)范化管理。不同菌株之間的遺傳特性表現(xiàn)出菌絲間的拮抗反應，拮抗試驗對于鑒定不同食用菌菌株具有操作簡單、結果準確等優(yōu)點[13]。本試驗采用野外采集、室內(nèi)單孢分離法共獲得16株香菇野生菌株和4株香菇栽培菌株，通過拮抗試驗表明，各菌株間有較大的遺傳特性差異，屬于不同的香菇菌株，有效避免了對相同菌株的重復篩選。

采用菌株生長速度、深層培養(yǎng)的菌球生長特性和菌株產(chǎn)胞外多糖進行進行初篩，并對產(chǎn)胞外多糖的穩(wěn)定性進行復篩的方法，有利于快速地從大量香菇菌株中獲得產(chǎn)胞外多糖優(yōu)良菌株。本試驗主要通過觀察菌落生長速度、菌絲致密度、長勢和液體菌球的生長特性，以篩選出菌絲體生長快、菌絲生物量大、菌球密度適宜，并且胞外多糖產(chǎn)量高、產(chǎn)量穩(wěn)定的菌株，最終篩選出菌株Le10，其胞外多糖產(chǎn)量達0.78 mg·mL-1，并且傳代10代后，產(chǎn)胞外多糖僅下降了3.8%，選擇該菌株作為下一步研究菌株。

試驗證明菌絲生長速度和菌株的胞外多糖產(chǎn)量之間有一定的正向關系，菌絲體的生長速度可以作為優(yōu)良菌株篩選的重要依據(jù)。同時相關研究表明，野生香菇種質資源的合理利用是獲得優(yōu)良菌種的一種行之有效的育種手段[14-15]。安徽省野生香菇種質資源十分豐富，應充分利用這一優(yōu)勢資源促進香菇的育種工作。

[1]路新彥.香菇多糖的深層發(fā)酵與分離純化研究[D].杭州:浙江農(nóng)林大學林業(yè)與生物技術學院,2010:5-7

[2]梅光明,郝強,張小軍,等.酸提香菇多糖的分離純化及結構鑒定[J].現(xiàn)代食品科技,2014,30(9):79-84

[3]王廣慧,戴明,魏雅冬.香菇多糖的提取工藝研究[J].食品科技,2013,38(1):192-194

[4]王子迎,王書通.安徽野生香菇遺傳多樣性及雜種優(yōu)勢的RAPD分析[J].中國農(nóng)學通報,2005,21(9):31-33,42

[5]Gerardo M,Philippe D,Jean M S.Selection of strains of Lentinula edodes and Lentinula boryana adapted for efficient mycelial growth on wheat straw[J].Revista iberoamericana de micología,2001，18:118-122

[6]鄒莉,高博,李梅英.香菇優(yōu)良栽培菌株的篩選[J].中國林副特產(chǎn),2009(5):28-29

[7]劉振欽,劉曉龍,李玉.香菇“91010”菌株選育研究報告[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報,2002,24(2):18-22,41

[8]Ina K,Kataoka T,Ando T.The use of lentinan for treating gastric cancer[J].Anti-cancer Agents in Medicinal Chemistry,2013,13(5):681-688

[9]Attia S M,Harisa G I,Abd-Allah A R,et a1.The influence of lentinan on the capacity of repair of DNA damage and apoptosis induced by paclitaxel in mouse bone marrow cells[J].Journal of Biochemical and Molecular oxicology,2013,27(7):370-377

[10]高玉梅.香菇液體發(fā)酵培養(yǎng)胞外多糖高產(chǎn)菌株的篩選及抗氧化活性研究[D].吉林:吉林大學生命科學學院,2009：20

[11]王偉.富硒平菇的研究香菇新菌株Cr-72選育及推廣應用[D].合肥:安徽農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,2010:26-42

[12]許月明.平菇優(yōu)良菌株的篩選[J].中國食用菌,2013(5):12-13

[13]戴耀紅.香菇優(yōu)良雜交菌株的初步選育[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術學院,2011:21-25

[14]竇會娟,李超敏,李林珂.原生質體誘變篩選香菇多糖高產(chǎn)菌株[J].中國釀造,2009(2):74-76

[15]劉勇,王波,甘炳成,等.四川德昌野生香菇種質資源遺傳差異分析[J].西南農(nóng)業(yè)大學學報,2008,21(1):125-129

(責任編輯：汪材印)

Screening of High-yielding Strains of Exopolysaccharide fromLentinusedodes

HU Wen,XIAO Sheng,ZHANG Dongdong,TANG Qiang

School of Life Sciences,Wuhu Institute of Technology,Wuhu Anhui,241003

The present study examined the difference of growth rate,sturdy level,dry weight,density and diameter of mycelium among 20 strains of L.edodes.Three strains Le06, Le10 and Le16 with good results in the previous tests were selected for the further content analysis of the exopolysaccharide yield.The results showed that the strain of Le10 is the best in the 20 tested strains and the maximum biomass was 0.98mg/mL and exopolysaccharide yield was 0.78 mg/mL. The strain showed great potential for sustainable cultivated.

Lentinula edobes;Exopolysaccharide;Strain screening

10.3969/j.issn.1673-2006.2015.06.026

2015-02-10

安徽省高校自然科學研究一般項目“蔬菜有害生物菜青蟲重要病原真菌玫煙色棒束孢高毒力菌株的篩選及其田間應用評估”(KJ2012 B218);安徽省質量工程校企合作實踐教育基地項目“食品技術人才實訓中心”(2013sjjd036)。

胡雯(1983-)，安徽蕪湖人，碩士，助教，主要研究方向：食用菌的開發(fā)利用。

*通訊作者：湯強(1981-)，安徽蕪湖人，博士，副教授，主要研究方向：應用微生物。

Q93-331

A

1673-2006(2015)06-0096-04