c-kit蛋白表達(dá)與小細(xì)胞肺癌患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系

劉暉群 徐國(guó)輝 黃 強(qiáng) 齊淑軼 劉敏知 熊林楷 鄒俊韜

小細(xì)胞肺癌(SCLC)是肺癌較常見(jiàn)的1種類型，約占所有肺癌的15% ～20%［1］。值得注意的是，SCLC的預(yù)后較差，盡管目前化療藥物不斷更新，但是其預(yù)后仍未得到顯著改善。在此背景下，SCLC的分子生物學(xué)研究有望成為改善患者預(yù)后的方法之一。既往研究認(rèn)為SCLC的發(fā)生可能與其表達(dá)c-kit基因存在一定的關(guān)系［2-3］，本研究旨在探討 SCLC組織表達(dá)c-kit蛋白與患者臨床特征及預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取2011年3月至2014年5月江西省腫瘤醫(yī)院收治的159例SCLC患者作為研究對(duì)象，男性116例、女性43例，年齡47～72歲，中位年齡57歲。納入標(biāo)準(zhǔn):①經(jīng)病理檢查診斷為SCLC;②初次診斷并入院接受治療;③相關(guān)檢查均得到完善，臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①既往曾接受治療的SCLC患者;②隨訪丟失的患者。

1.2 c-kit蛋白表達(dá)檢測(cè)方法

步驟如下:①對(duì)石蠟切片進(jìn)行脫蠟至水，方法為二甲苯2次，30 min/次;無(wú)水酒精2次，5 min/次;95%酒精2次，5 min/次;80%酒精1次，5 min/次;75%酒精1次，5 min/次;蒸餾水1次，5 min/次。②去除石蠟切片的內(nèi)源性過(guò)氧化物酶:3%H2O2室溫孵育，時(shí)間為10～15 min。③沖洗切片:在0.01 M磷酸鹽緩沖液(PBS)中震蕩洗滌玻片，連續(xù)3次，3 min/次。④石蠟切片的抗原修復(fù)與暴露:在0.01 M檸檬酸緩沖液中浸泡玻片，微波爐加熱修復(fù)抗原12 min。室溫冷卻玻片，PBS洗滌，3 min/次，洗滌過(guò)程中輕微震蕩片刻。⑤滴加特異性第一抗體，孵育30 min，孵育完畢后用0.01 M PBS洗滌3次，5 min/次，振動(dòng)清洗。⑥滴加Envision系統(tǒng)(將二抗與酶連接成一個(gè)多聚體)，37℃孵育30 min，0.01 M PBS 洗滌 3 次，5 min/次，振動(dòng)清洗。⑦二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色:在1 ml蒸餾水中滴加DAB顯色試劑A液、B液、C液各1 d，配制DAB顯色劑。顯色3～5 min，蒸餾水終止顯色。⑧蘇木精復(fù)染:在陳舊蘇木精溶液浸泡1 min，復(fù)染細(xì)胞核，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)1～3 min。⑨酒精梯度脫水干燥，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。⑩設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照，已知陽(yáng)性的胃腸道間質(zhì)瘤切片為陽(yáng)性對(duì)照，PBS代替一抗作為陰性對(duì)照。

1.3 c-kit蛋白表達(dá)結(jié)果判斷

①細(xì)胞著色陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn):黃色或者棕黃色顆粒呈彌漫性分布，背景清晰，與陽(yáng)性對(duì)照染色強(qiáng)度一致或者稍弱定義為陽(yáng)性，未著色定義為陰性。②細(xì)胞計(jì)數(shù)方法:在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù)，放大倍數(shù)為400倍，選擇10個(gè)具有代表性的高倍鏡視野，在免疫組化染色最強(qiáng)區(qū)域計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，共計(jì)數(shù)1 000個(gè)腫瘤細(xì)胞。③計(jì)算標(biāo)記指數(shù)，標(biāo)記指數(shù)=陽(yáng)性細(xì)胞總數(shù)/1 000×100%，當(dāng)標(biāo)記指數(shù)≥50%時(shí)定義為c-kit蛋白表達(dá)陽(yáng)性，反之為陰性。

1.4 隨訪方式

所有患者在治療結(jié)束后均接受隨訪，隨訪方式主要是門診就診、電話隨訪等，本組患者均得到有效隨訪。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料用百分率表示。組間性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史、腫瘤大小、腫瘤部位、M分級(jí)比較采用四格表χ2檢驗(yàn)，組間T分級(jí)、N分級(jí)比較采用秩和檢驗(yàn);生存率計(jì)算采用Kaplan-Meier法，組間生存率比較采用 Log rank檢驗(yàn);P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 觀察組與對(duì)照組臨床特征的比較

2組患者性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史、腫瘤大小、N分級(jí)、M分級(jí)方面相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，觀察組T分級(jí)顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P ＜0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 兩組患者1年生存率的比較

觀察組、對(duì)照組 1年生存率分別為 82.4%、91.3%。觀察組1年生存率顯著低于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。

表1 觀察組與對(duì)照組臨床特征的比較(例，%)

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率、死亡率最高的惡性腫瘤，目前已成為全球重要的公共衛(wèi)生問(wèn)題之一。根據(jù)肺癌的生物學(xué)特性，WHO將其分為非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)、SCLC兩大類，其中NSCLC較為常見(jiàn)。與NSCLC完全不同的是，SCLC腫瘤細(xì)胞的倍增時(shí)間短、病情進(jìn)展快，2/3的 SCLC患者在確診時(shí)已為廣泛期［4］，因此目前臨床上較少采用手術(shù)治療SCLC患者，而化療、放療成為SCLC的主要治療手段。需要引起臨床重視的是，SCLC患者的預(yù)后極差，未經(jīng)治療的SCLC患者中位生存期不足4個(gè)月，2年生存率不足1%，即使經(jīng)過(guò)治療，95%的SCLC患者在發(fā)病后5年內(nèi)死亡［5］。盡管目前化療藥物不斷更新，但是SLCL患者的預(yù)后仍未得到顯著改善。在上述背景下，各種與惡性腫瘤預(yù)后密切相關(guān)的分子生物學(xué)指標(biāo)成為SCLC研究的重要課題。

c-kit基因是SCLC研究較多的分子生物學(xué)指標(biāo)之一。值得注意的是，有關(guān)SCLC組織表達(dá)c-kit蛋白與患者臨床特征、預(yù)后的研究，不同研究的結(jié)論存在著較大的區(qū)別，有時(shí)甚至截然相反［2，6-7］，其原因可能包括某些研究的樣本量過(guò)少、抽樣誤差過(guò)大，c-kit蛋白表達(dá)陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)不同、個(gè)人主觀因素影響等方面。為分析c-kit蛋白與SCLC之間的確切關(guān)系，本研究采用了較大的樣本量進(jìn)行研究，結(jié)果顯示SCLC組織表達(dá)c-kit蛋白與與患者性別、年齡、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史、腫瘤大小、N分級(jí)、M分級(jí)無(wú)相關(guān)性，但是與T分級(jí)、預(yù)后有一定的關(guān)系。

分析本研究產(chǎn)生上述結(jié)果的原因，得先從c-kit基因的特征入手。c-kit基因定位于人類染色體4q11-12，其編碼產(chǎn)物c-kit蛋白為分子量為145 kD的跨膜糖蛋白。c-kit蛋白屬于受體酪氨酸激酶家族成員，包括細(xì)胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)、細(xì)胞內(nèi)酪氨酸激酶區(qū)等3個(gè)區(qū)域，其配體為干細(xì)胞因子(SCF)。當(dāng)SCF特異性結(jié)合c-kit蛋白以后，后者的酪氨酸激酶活性被激活，進(jìn)一步通過(guò)多種機(jī)制啟動(dòng)Raf-1、Ras、絲裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3激酶等多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，通過(guò)上述通路將細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)至細(xì)胞內(nèi)部，活化細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而控制細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化［8-9］。值得注意的是，SCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化直接影響著患者的T分級(jí)，從而進(jìn)一步影響患者的預(yù)后。綜上所述，c-kit蛋白可作為SCLC預(yù)后判斷的指標(biāo)之一，這也預(yù)示著酪氨酸激酶抑制劑有可能用于c-kit蛋白表達(dá)陽(yáng)性SCLC患者的治療。

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