MMP-2、MMP-9在老年結(jié)直腸癌中的表達(dá)及與其臨床病理特征的關(guān)系

陳 翔 吳曙輝 陸寶華 袁 杰 耿春華 曾小兵

結(jié)直腸癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一，近幾年來(lái)，發(fā)病率明顯上升，臨床上判斷預(yù)后多通過(guò)分析腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、分期、組織分級(jí)等?；|(zhì)金屬蛋白酶中的基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)主要降解VI型膠原，參與腫瘤血管形成、腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［1］。本文通過(guò)免疫組織化學(xué)法檢測(cè)老年結(jié)直腸癌患者中MMP-2、MMP-9的表達(dá)，探討兩者與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取于2012年3月至2014年9月在我院普外科住院行結(jié)直腸癌根治術(shù)患者86例作為實(shí)驗(yàn)組，均經(jīng)過(guò)病理組織學(xué)切片檢查明確診斷，其中男性49例，女性37例，年齡63～84歲，平均年齡(65.2±5.3)歲。組織學(xué)類型:腺癌63例，其他類型23例。病理學(xué)分級(jí):高分化32例，中分化33例，低分化21例。腫瘤直徑＜5 cm者37例，5～10 cm者34例，＞10 cm者15例;局部有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者49例，無(wú)轉(zhuǎn)移者37例;TNM分期:Ⅰ期23例，Ⅱ期31例，Ⅲ期26例，Ⅳ期6例。取該組病例距腫瘤邊緣5 cm以上相應(yīng)癌旁正常組織作為對(duì)照組。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療或生物治療。

1.2 試劑及儀器

兔抗人MMP2、MMP-9多克隆抗體、SP通用型試劑盒、DAB試劑盒、多聚賴氨酸、檸檬酸抗原修復(fù)液、PBS、過(guò)氧化氫、二甲苯，無(wú)水乙醇，石蠟，蘇木精，中性樹膠(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

超凈工作臺(tái)(Formal205型，美國(guó));倒置顯微鏡(Olympus，日本);水浴箱(江蘇金坑市醫(yī)療儀器廠);組織包埋機(jī)(SAKURA，日本);脫水機(jī)(TIYODA，日本);超薄切片機(jī)(Leica，德國(guó));臺(tái)式恒溫振蕩器(中國(guó)上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司);高壓鍋(美的，中國(guó));電熱風(fēng)干燥箱(中國(guó)上海圣欣科學(xué)儀器有限公司);耐高溫塑料染色架(中國(guó)福州邁新生物科技有限公司);計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(惠普，美國(guó))。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

福爾馬林液固定;脫水、透明;浸蠟、包埋;切片、貼片、烤片;脫蠟、脫水;高壓熱修復(fù);阻斷:3%過(guò)氧化氫孵育10 min;封閉:山羊血清封閉液室溫孵育10 min;加一抗50 μl室溫靜置1 h;加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗50 μl靜置10 min;加鏈霉親和素-過(guò)氧化物酶50 μl靜置10 min;顯色;終止;蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化;常規(guī)脫水、透明;封片;顯微鏡下觀察。

1.4 判斷標(biāo)準(zhǔn)

以已知的該指標(biāo)的免疫組化染色陽(yáng)性片作為陽(yáng)性對(duì)照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，HE切片作為對(duì)照觀察。

MMP-2、MMP-9陽(yáng)性結(jié)果判定以細(xì)胞核不染色，細(xì)胞膜或胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)棕色或棕黃色顆粒為陽(yáng)性染色，陰性(-):染色細(xì)胞數(shù)≤10%;弱陽(yáng)性(+):染色細(xì)胞數(shù)11% ～25%;陽(yáng)性(++):染色細(xì)胞數(shù)26% ～50%;強(qiáng)陽(yáng)性(+++):染色細(xì)胞數(shù)＞50%。以上均以(-)為陰性;(+)～(+++)為陽(yáng)性。圖像分析:計(jì)算機(jī)圖像系統(tǒng)拍照，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，并記錄。

2 結(jié)果

2.1 MMP-2、MMP-9在兩組中的表達(dá)情況

對(duì)兩組組織進(jìn)行免疫組化SP法檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組 MMP-2強(qiáng)陽(yáng)性(+++)28例，陽(yáng)性率73.26%，MMP-9強(qiáng)陽(yáng)性(+++)表達(dá)32例，陽(yáng)性率69.77%;對(duì)照組 MMP-2、MMP-9 均無(wú)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為11.63%、9.30%，兩組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(MMP-2 χ2=66.853，MMP-9 χ2=65.765，P 均＜0.01)，見表1。

表1 MMP-2、MMP-9在兩組中的表達(dá)情況

2.2 MMP-2、MMP-9表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系

MMP-2和MMP-9的表達(dá)水平均與患者性別、腫瘤部位、腫瘤大小和病理學(xué)類型、組織學(xué)類型無(wú)關(guān)，而與腫瘤浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)(P ＜0.05)，見表 2。

3 討論

結(jié)直腸癌作為常見的惡性腫瘤，老年人的發(fā)病率逐年升高，是由多因素、多基因、多階段參與的，其惡性程度主要由浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移特性決定，而這種特性又是由惡性腫瘤細(xì)胞的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)的降解及大量血管生成決定的［2］。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs)是蛋白水解酶家族，主要依賴鋅離子，能夠降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)，參與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移［3］。MMP-2是非糖化明膠酶，研究表明MMP-2能夠?qū)е履[瘤細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)降解，參與腫瘤新生血管形成、腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移［4］。除此之外，MMP-2還能調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附，降低細(xì)胞間粘附力，腫瘤細(xì)胞易于脫落形成遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移［5］。

MMP-9是明膠酶B，能夠降解明膠、彈性纖維、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ和X型膠原，在多種惡性腫瘤中高表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)結(jié)直腸癌基底膜Ⅳ型膠原蛋白的缺失與組織MMP-9表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)［6］。有報(bào)道稱MMP-9拮抗劑抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞黏附，表明MMP-9促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移［7］。

表2 MMP-2、MMP-9表達(dá)與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系(例，%)

在本實(shí)驗(yàn)中，選取經(jīng)病理證實(shí)為結(jié)直腸癌的組織作為實(shí)驗(yàn)組，癌旁正常組織作為對(duì)照組，采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)兩組組織內(nèi)MMP-2、MMP-9的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組 MMP-2強(qiáng)陽(yáng)性28例，陽(yáng)性率73.26%，MMP-9強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)32例，陽(yáng)性率69.77%;對(duì)照組MMP-2、MMP-9均無(wú)強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率分別為11.63%、9.30%，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。對(duì)兩組組織中MMP-2、MMP-9的表達(dá)與性別、腫瘤部位、病灶大小、TNM分期、組織學(xué)類型、病理學(xué)類型、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等方面的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MMP2和MMP-9的表達(dá)水平均與患者性別、腫瘤部位、腫瘤大小和病理學(xué)分型、組織學(xué)類型無(wú)關(guān)，與腫瘤浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，統(tǒng)計(jì)學(xué)顯示有差異。這提示，MMP-2、MMP-9在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)升高，并且隨著腫瘤浸潤(rùn)深度深、有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期越晚，結(jié)直腸癌組織中MMP2和MMP-9表達(dá)越高。既往研究表明，在人體多種惡性腫瘤中，MMP-2高表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解，腫瘤新生血管生成，腫瘤發(fā)生浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移［8］。MMP-9在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，在非癌組織中也有少量的表達(dá)，能夠起到腫瘤抑制因子的作用［9］。截止目前，絕大部分研究均發(fā)現(xiàn)MMP-9能夠加速腫瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展［10］。這均與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)MMP-2、MMP-9在結(jié)直腸癌組織中高表達(dá)，兩者的表達(dá)與結(jié)直腸癌浸潤(rùn)深度、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，可能在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用。MMP-2和MMP-9與結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的具體機(jī)制仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究，為臨床上尋找結(jié)直腸癌新的治療方式提供理論依據(jù)。

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