超聲波協(xié)同酶法提取茶多酚工藝的研究

熊志勇，陳惠君，蔡陽(yáng)倫，肖 洋

(1.北京理工大學(xué)珠海學(xué)院化工與材料學(xué)院，廣東珠海519000;2.華南理工大學(xué)輕工與食品學(xué)院，廣東廣州510641)

茶多酚是一類(lèi)存在于茶樹(shù)中的多羥基酚類(lèi)化合物的混合物，占茶葉質(zhì)量的20% ～30%，安全性好且來(lái)源豐富，是一種天然無(wú)毒的食品添加劑，具有良好的抗氧化性能和藥理作用［1］。茶多酚具有抗氧化、抗突變、抗癌變［2］、抗衰老、清除自由基、降血壓與膽固醇等生物學(xué)功能。因此，茶多酚在食品、油脂、保健、醫(yī)藥、日化等行業(yè)都有廣泛的應(yīng)用［3］。

超聲波提取是基于超聲波的空化作用來(lái)加速物質(zhì)分子盈動(dòng)的頻率和速度，增加溶劑穿透能力，以提高藥物溶出速度和次數(shù)，從而有利于植物有效成分的提取，而它的次級(jí)效應(yīng)，如機(jī)械振動(dòng)、乳化、擴(kuò)散、擊碎、化學(xué)效應(yīng)等也能加速欲提取成分的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，有利于植物中有效成分的提取，超聲波提取還避免了高溫加熱對(duì)有效成分的破壞［4-5］。

纖維素酶是一組能夠降解纖維素生成葡萄糖的酶的總稱(chēng)。在分解纖維素時(shí)起生物催化作用，可以將纖維素分解成寡糖或單糖的蛋白質(zhì)或RNA［6-7］。在自然界的生物體中，細(xì)菌、真菌、動(dòng)物體內(nèi)等都能產(chǎn)生纖維素酶。一般用于生產(chǎn)的纖維素酶來(lái)自于真菌，真菌產(chǎn)量高、活性大，種類(lèi)繁多，來(lái)源很廣。并且，纖維素酶只是破壞茶葉的細(xì)胞壁，對(duì)非纖維素類(lèi)物質(zhì)無(wú)影響，所以對(duì)茶多酚無(wú)影響。

從茶葉中提取茶多酚的傳統(tǒng)工藝存在許多缺點(diǎn)［8］，如溶劑消耗量大、毒性強(qiáng)、成本高、提取物收率低等。為了克服上述方法的弊端，筆者對(duì)其提取工藝進(jìn)行改進(jìn)，利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)研究超聲波協(xié)同酶法［9］，去除茶多酚提取量的影響(由于乙醇對(duì)纖維素酶活力有抑制作用，所以試驗(yàn)時(shí)在酶液作用之后再加入乙醇溶液保溫一段時(shí)間后再進(jìn)行測(cè)量茶多酚含量，正文不再進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明)，優(yōu)化最佳提取條件與工藝方法［10］，從而最大限度地提取茶多酚，為其在各個(gè)領(lǐng)域上的應(yīng)用做出一定的貢獻(xiàn)。

1 材料與方法

1.1 材料 原料:茶葉，山東日照鑫輝百貨。主要試劑:乙酸銨、磷酸、乙酰丙酮、液體石蠟、冰乙酸，天津市大茂化學(xué)試劑廠(chǎng);福林酚試劑，上海荔達(dá)生物科技有限公司(江蘇銳陽(yáng));纖維素酶，江蘇銳陽(yáng)生物科技有限公司;試劑均為分析純。主要儀器:HWS28型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司;EL204電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SB-25-12DT超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司;722S722見(jiàn)分光光度計(jì)，上海欣茂儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 纖維素酶活力。

1.2.1.1 纖維素酶標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制。準(zhǔn)確稱(chēng)取5 g纖維素酶，置于燒杯中溶解，倒入1 000 ml容量瓶中，定容至刻度，搖勻，此纖維素酶標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為5 mg/ml。

1.2.1.2 濾紙酶活力。濾紙酶活力(U/g)依據(jù)公式:濾紙酶活力(U/g)=葡萄糖生成量(mg)×酶液定容體積×5.56/［反應(yīng)液中酶液加入量(ml)×樣品重(g)×?xí)r間(h)］，由濾紙酶活力計(jì)算公式得，濾紙酶活力=547.104 U/g。

1.2.2 茶多酚含量的測(cè)定。原理:茶葉磨碎樣中的茶多酚用70%的甲醇在70℃水浴上提取，福林酚試劑氧化茶多酚中-OH基團(tuán)并顯藍(lán)色，最大吸收波長(zhǎng)λ為765 mm，用沒(méi)食子酸作校正標(biāo)準(zhǔn)定量茶多酚。結(jié)果計(jì)算公式如下:

式中，A為樣品測(cè)試液吸光度;V為樣品提取液體積，10 ml;d為稀釋因子(為1 ml稀釋成100 ml，故其稀釋因子為100);SLOPEstd為沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的斜率;m為樣品干物質(zhì)含量(%);m1為樣品質(zhì)量(g)。沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)如圖1所示。

圖1 沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

擬合曲線(xiàn)方程:A=0.008 6c+0.478 6;擬合參數(shù)情況:SSE為2.56e-05;R2為0.999 7;R2adj為0.999 5;RMSE為0.002 921。

1.2.3 單因素試驗(yàn)考察。在保持其他因素不變的條件下，以茶多酚含量為指標(biāo)，進(jìn)行單因素試驗(yàn)，分別研究了水浴溫度、水浴超聲時(shí)間、加酶量、茶多酚與纖維素酶的料液比、乙醇濃度和pH對(duì)茶多酚提取的影響。

準(zhǔn)確稱(chēng)取干燥的茶葉粉末5 g用于試驗(yàn)。水浴溫度采用的水平為:30、40、50、60 ℃;水浴超聲時(shí)間采用的水平為:30、40、50、60、70 min;加酶量采用的水平為:5、10、15、20、25 ml;料液比采用的水平為:5∶40、5∶50、5∶60、5∶70、5∶80 g/ml;乙醇濃度采用的水平為:15%、35%、55%、75%、95%;pH采用水平為 3、4、5、6、7。

1.2.4 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，根據(jù)茶葉中茶多酚的提取條件，選定水浴溫度(A)、水浴超聲時(shí)間(B)、加酶量(C)、料液比(D)和pH(E)為考察因素，以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素及水平

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析。采用正交試驗(yàn)軟件對(duì)正交結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，確定最佳提取工藝條件。

1.2.6 超聲波與纖維素酶對(duì)茶多酚提取率的影響。選取相同原料，采用相同測(cè)定方法，分別采用超聲波不加酶、加酶不超聲法和超聲波協(xié)同酶法試驗(yàn)，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 水浴溫度的確定。稱(chēng)取干燥的茶葉粉末5 g，分別于30、40、50、60 ℃時(shí)加入 5 ml酶液和 50 ml 75%乙醇，作用 1h，結(jié)果如圖2所示，在50℃時(shí)茶多酚的提取量比較高。

圖2 水浴溫度與茶多酚含量的關(guān)系

2.1.2 水浴超聲時(shí)間的確定。稱(chēng)取干燥的茶葉粉末5 g，于50℃時(shí)加入20 ml酶液和50 ml 75%乙醇，分別作用30、40、50、60、70 min，結(jié)果由圖3可見(jiàn)，水浴時(shí)間為60 min時(shí)茶多酚提取量為最高。

圖3 水浴超聲時(shí)間與茶多酚含量的關(guān)系

2.1.3 加酶量的確定。稱(chēng)取干燥的茶葉粉末5 g，于50℃時(shí)以料液比為5∶50 g/ml加入酶液5、10、15、20、25 ml及75%乙醇分別作用50 min，結(jié)果由圖4可見(jiàn)，加酶量為15 ml時(shí)茶多酚的提取量比較高。

2.1.4 料液比的確定。稱(chēng)取干燥的茶葉粉末5 g，于50℃時(shí)加入 20 ml酶液和 40、50、60、70、80 ml 75%乙醇溶液作用 50min，結(jié)果由圖5可見(jiàn)，料液比為5∶60 g/ml時(shí)茶多酚的提取量為最高。

圖4 加酶量與茶多酚含量的關(guān)系

圖5 料液比與茶多酚含量的關(guān)系

2.1.5 乙醇濃度的確定。稱(chēng)取干燥的茶葉粉末5 g，于50℃時(shí)加入20 ml酶液和50 ml，15% 、35%、55% 、75%、95%乙醇，分別作用50 min，結(jié)果由圖6可見(jiàn)，乙醇濃度為55%時(shí)茶多酚的提取量比較高。

2.1.6 pH的確定。稱(chēng)取干燥的茶葉粉末5 g，于50℃時(shí)加入20 ml酶液和50 ml 75%乙醇，分別作用50 min，結(jié)果由圖7可見(jiàn)，pH為4的時(shí)候茶多酚的提取率最高。

從試驗(yàn)數(shù)據(jù)中可以看出，超聲波協(xié)同酶法提取茶多酚確實(shí)比普通的提取方法所提取的含量有所提高，但增幅不是很明顯。經(jīng)過(guò)分析研究，可能的原因是由于茶多酚的分子結(jié)構(gòu)導(dǎo)致其跟蛋白質(zhì)有很強(qiáng)的絡(luò)合作用，所以容易導(dǎo)致活性酶的失活。

2.2 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果得知各因素對(duì)提取結(jié)果的影響，確定正交試驗(yàn)水平，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可見(jiàn)，各因素對(duì)試驗(yàn)指標(biāo)(茶多酚含量)的影響按大小次序來(lái)說(shuō)依次是:提取時(shí)間、pH、溫度、料液比、加酶量。

圖6 乙醇濃度與茶多酚含量的關(guān)系

圖7 pH與茶多酚含量的關(guān)系

最好的試驗(yàn)提取條件為A4B2C2D2E3，即水浴時(shí)間40 min，加酶量 10 ml，水浴溫度 60 ℃，料液比為 5∶50 g/ml，pH為5。茶多酚提取方差分析顯示，F(xiàn)溫度=0.607，F(xiàn)時(shí)間=3.380，F(xiàn)加酶量=0.174，F(xiàn)料液比=0.233，F(xiàn)pH=0.606，F(xiàn)臨界=3.29。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由此可得，時(shí)間這個(gè)因素對(duì)茶多酚的提取有較顯著的影響，說(shuō)明時(shí)間對(duì)茶多酚的提取起主要作用，溫度、加酶量、料液比和pH則沒(méi)有顯著性差異，即這些因素對(duì)茶多酚的提取影響較小。

2.3 超聲波與纖維素酶對(duì)茶多酚提取率的影響 試驗(yàn)得出，超聲波協(xié)同纖維素酶法提取茶多酚的提取量最高，5 g茶葉粉中茶多酚提取量為23.216 4 mg，其提取效果明顯高于單一的超聲波(21.164 8 g)和加酶法(22.845 7 g)。

3 結(jié)論與討論

纖維素酶是一種能夠?qū)⒕S生素降解成葡萄糖的酶的總稱(chēng)，其作用主要是破壞茶葉細(xì)胞的細(xì)胞壁，使其內(nèi)部物質(zhì)從細(xì)胞中釋放出來(lái)，由于茶多酚并不是纖維素類(lèi)物質(zhì)，故對(duì)提取出來(lái)的茶多酚的成分不會(huì)有影響。超聲波提取法是基于超聲波的空化作用來(lái)加速物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)的頻率和速度，增加溶劑的穿透能力，以提高藥物溶出速度和溶出次數(shù)，從而有利于植物有效成分的浸出提取，而他的次級(jí)效應(yīng)也能加速提取成分的擴(kuò)散釋放并充分與溶劑混合，有利于絕大部分植物有效成分的提取，還可避免高溫加熱對(duì)有效成分的破壞。

通過(guò)超聲波與酶間不同組合試驗(yàn)方法的比較，可知纖維素酶的提取效率高于超聲波的提取效率，而且超聲波與纖維素酶具有協(xié)同作用，共同增進(jìn)茶多酚的提取效率;通過(guò)5因素4水平正交試驗(yàn)的優(yōu)化工藝研究，得出水浴時(shí)間40 min，加酶量10 ml，水浴溫度60℃，料液比為5∶50 g/ml，pH為5時(shí)茶多酚的提取效率最高，其中影響因素以時(shí)間、pH和溫度為主。

［1］蔣麗，王雪梅，全學(xué)軍，等.不同提取方法對(duì)茶多酚理化性質(zhì)的影響［J］.食品科學(xué)，2010，31(14):136-139.

［2］YANG C S，LI G X，YANG Z H，et al.Cancer prevention by tocopherols and tea polyphenols［J］.Cancer Letters，2013，334(1):79-85.

［3］THAKUR V S，GUPTA K，GUPTA S.The chemopreventive and chemotherapeutic potentials of Tea polyphenols［J］.Current Pharmaceutical Biotechnology，2012，13(1):191-199.

［4］吳昊，宗志敏，石金龍.超聲波協(xié)同酶法提取銀杏黃酮的工藝研究［J］.中國(guó)資源綜合利用，2012，30(11):26-29.

［5］陳紅，崔海月，李玉擴(kuò)，等.超聲波協(xié)同酶法提取大豆多糖工藝的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(5):581-586.

［6］LI C Z，YOSHIMOTO M，F(xiàn)UKUNAGA K，et al.Characterization and immobilization of liposome-bound cellulase for hydrolysis of insoluble cellulose［J］.Bioresource Technology，2006，98(7):1366-1372.

［7］TéBéKA I R M，SILVA A G L，PETRI D F S.Hydrolytic activity of free and immobilized cellulase［J］.Langmuir，2009，25(3):1582-1587.

［8］劉軍海，楊海濤，刁宇清.復(fù)合酶法提取茶多酚工藝條件研究［J］.食品與機(jī)械，2008，24(3):74-77.

［9］陶濤，李立祥，張芳，等.超聲波協(xié)同纖維素酶對(duì)黃精多糖和皂苷的提取研究［J］.食品工業(yè)科技，2012，33(9):271-275.

［10］陳紅，崔海月，李玉擴(kuò)，等.超聲波協(xié)同酶法提取大豆多糖工藝的研究［J］.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，33(5):581-586.