反膠束水合萃取技術在生物工程領域的研究進展

蘭 宇，孫向東，趙冬梅*

(1.黑龍江東方學院食品與環(huán)境工程學部，黑龍江哈爾濱 150066；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量安全研究所，黑龍江哈爾濱 150086)

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反膠束水合萃取技術在生物工程領域的研究進展

蘭 宇1，孫向東2，趙冬梅1*

(1.黑龍江東方學院食品與環(huán)境工程學部，黑龍江哈爾濱 150066；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品質量安全研究所，黑龍江哈爾濱 150086)

介紹了反膠束的基本概念和反膠束萃取技術在國內外的最新研究動態(tài)，綜述了反膠束水合萃取技術的反應機理及其在生物工程中的應用研究進展，并對其在生物領域的應用前景進行了展望。

反膠束；水合；生物工程

近年來，科學技術的快速發(fā)展和人們生活水平的提高，使得人們對環(huán)保的意識逐漸增強，而對新能源的開發(fā)利用及其在生物技術領域的應用擴展，促使水合物分離技術的應用研究受到國內外學者的高度重視，許多發(fā)達國家也將水合物的形成及分離技術視為具有很大發(fā)展前景的新興技術，并將其作為主要進軍領域。水合物技術對低溫溶液特別有效，且水合形成消耗反膠束內部分自由水的同時可以減小反膠束大小，使得其中的酶活性產(chǎn)生變化。水合物技術對反萃取的進程還具有催化作用，一般會把它運用在反膠束體系中生物酶活性的控制以及萃取。反膠束萃取技術與堿提酸沉方法相比應用潛力更為廣泛，具有萃取率高，溶劑可循環(huán)使用，反應條件溫和，對人體無毒，經(jīng)濟，易于操作等優(yōu)點。反膠團的庇護功能下形成一道屏障，避免蛋白質與有機溶液之間的接觸反應，維持生物活性物質的固有活性，從而實現(xiàn)蛋白質的溶解和分離[1]。反膠束水合萃取技術即反膠束萃取技術與水合物生成技術相結合的一種分離技術，具有良好的發(fā)展空間，能夠高效地控制和提取生物活性物質且易與反膠束溶液分離。

筆者介紹了反膠束萃取技術的基本概念及其在生物工程領域的應用進展，并對水合物技術在反膠束體系中的作用機理和應用進展進行了綜述，展望其在未來的發(fā)展前景。

1 反膠束萃取技術的理論基礎

1.1 反膠束的基本概念反膠束萃取技術作為一種新興的物質分離技術，既適用于分離非極性體系中的極性化合物，也適用于酶的固定化，可廣泛應用于生物活性物質的提取。

當表面活性劑與有機溶劑混合在一起，且其濃度相對于臨界膠團的濃度較大時，有機相中便會自然地聚集在一起匯成納米級聚集體即反膠束體系，且這種納米聚集體具有透明、熱力學穩(wěn)定等特性，其中的極性頭向內，非極性尾則向外，形成的親水內核，謂之“水池”(圖1)，它可以增強溶解蛋白質以及氨基酸等極性物質的作用[2]，同時酶也可以被固定在反膠束的“水池”中進行催化反應。而表面活性劑的分子層能夠阻止極性物質接觸有機溶劑，保持被提取物質的活性。

圖1 正常膠束與反膠束示意

反膠束體系的性質常用參數(shù)W0表示，W0表示含水量(mol/L)與表面活性劑的量(mol/L)的比值，如式(1)所示，一般W0越大，有機相形成反膠束微粒的直徑越大。W0是反映反膠束中含水量多少的一個重要參數(shù)，在可形成反膠束的濃度范圍內，隨著W0增加，更多的水與表面活性劑形成結合水從而提升萃取率。陽離子型以及非離子型，這兩者表面活性劑所形成的反膠束溶液的增溶水量都比陰離子型的小，而非離子型的則比兩性離子型的增溶水量小[3]。

W0=

(1)

1.2 反膠束的萃取原理及特點極性物質滲入反膠束溶液的過程是由多種作用相互協(xié)助產(chǎn)生的，即在宏觀兩相界面之間的表面活性劑層，和相鄰的極性物質分子產(chǎn)生靜電引力，導致形變，從而界面之間產(chǎn)生擁有這個極性物質的反膠束，繼而分散到有機相中，以此達到極性物質的萃取(圖2a)。這一過程稱為前萃??；通過改變條件使極性物質從反膠束轉移到水相中，從而分離出此物質，即為后萃取(圖2b)。

圖2 反膠束法萃取蛋白質過程示意

反膠束“水池”增溶蛋白質等極性物質的驅動力，主要包括疏水力、二硫鍵作用力、離子作用力、靜電作用力以及羥基間的相互作用力等，這些作用力都可能使極性物質的結構產(chǎn)生變化，從而對萃取率產(chǎn)生重要影響。所以，任何能夠影響這些應用的因素，都會改變蛋白質的萃取效果。而這些影響因素主要有反膠束的尺寸、表面活性劑的種類、pH、離子濃度、蛋白質電荷量及有增容水量等[4-7]。

2 反膠萃取技術在生物工程領域的應用

2.1 反膠束萃取蛋白質

2.1.1蛋白質混合物分離。蛋白質的分子質量較為接近，可根據(jù)等電點不同或另外等原因所導致溶解度之間存在差異，采用反膠束溶液對其進行選擇性的提取。

Aires-Barros等[8]采用AOT/異辛烷反膠束體系從黏稠色桿菌中分離純化出2種不同等電點的脂酶——脂酶A和脂酶B，脂酶A的分子質量是1.2×105Da，等電點為3.7，脂酶B的分子質量是3×104Da，等電點為7.3。萃取率分別達到86%和75%。從研究的成效可以看出，反膠束法運用在分子質量接近的蛋白質分離中有較好的應用前景。

2.1.2蛋白質和油脂同時分離。油脂工業(yè)通常采用先浸油再分離蛋白的工藝分別提取植物油和蛋白，而利用反膠束法可同時分離油脂和蛋白質。李飛等[9]采用AOT/異辛烷反膠束體系同時提取玉米胚芽油脂和蛋白質，通過單因素試驗，研究了前萃取和后萃取過程中的主要因素對油脂和蛋白質提取率的影響，得到了最佳萃取工藝條件。通過反膠束法、浸出法、水酶法3種方法得到玉米胚芽蛋白，并對其同時所得油脂的性質進行分析對比，結果表明，以反膠束法萃取的油脂最優(yōu)。堿提酸沉法(16.63%)和水酶法(22.01%)的蛋白質提取率略低于反膠束法(28.23%)，而純度方面反膠束法提取的蛋白質純度(96.21%)較堿提酸沉法(72.97%)和水酶法(12.94%)優(yōu)勢更加明顯。

2.1.3發(fā)酵液中酶分離和提純。從發(fā)酵液中分離和提純酶一直是生物工程領域研究重點之一，國外學者已利用反膠束技術成功地從發(fā)酵液中分離出某些高純度酶。Cocotle-Ronzon等[10]利用CTAB/異辛烷反膠束溶液從木糖醇菌株——熱帶假絲酵母菌IEC5-ITV中分離純化出木糖還原酶，得到8.1倍的純化因子，回收率達到100%。研究結果為深入研究其穩(wěn)定性及動態(tài)變化奠定了良好的基礎。

2.2 氨基酸及維生素等功能性添加劑萃取將反膠束技術運用在氨基酸等添加劑的萃取方面具有很大的應用潛力，其中氨基酸等添加劑通過帶電離子的方式被提取。相同種類的氨基酸在電離形式不同的情況下，所被萃取的實際值之間同樣存在差距，而結構上具有差異的氨基酸在反膠束中分布的位置也截然不同。因此，根據(jù)氨基酸和反膠束作用之間的差異，來篩選出所需氨基酸。

王運東等[11]使用Pluronic型和R型2種Pluronic嵌段聚合物(由德國巴斯夫公司生產(chǎn)的)，利用聚合物反膠團萃取氨基酸(L-苯丙氨酸和L- 異亮氨酸)，結果顯示，通過對比它與有機溶劑的物理萃取氨基酸的平衡時間，發(fā)現(xiàn)兩者之間相差甚小，而溶質處于反膠團表層的平衡分配系數(shù)K值一般較高，在它的水池內也是如此，在氨基酸水溶液的pH處于等電點附近時會使萃取率最大化。依此判斷，聚合物反膠團在萃取兩親性質的氨基酸的過程中，增溶作用的關鍵在其表層位置，涵蓋在聚氧丙烯的外殼或者環(huán)繞聚氧丙烯鏈間的可能性較大。而親油性以及氫鍵則為其萃取注入關鍵促進力。

2.3 抗生素萃取工業(yè)上采用液-液萃取法生產(chǎn)抗生素已經(jīng)非常普遍。最近研究指出，反膠束溶液不僅可用于萃取以及分離抗生素，且在糖肽類抗生素的應用上發(fā)展?jié)摿^大。Mohd-Setapar等[12]研究發(fā)現(xiàn)青霉素G與AOT相互作用時可作為一種界面活性復合物質，能有效提高提取效率。同時指出青霉素G的濃度、pH、表面活性劑濃度、水相中鹽的種類和濃度等因素對反應起著重要作用。Hu等[13]利用AOT/異辛烷反膠束體系從丙烯酰胺中同時提取出新霉素和慶大霉素，并對影響因素進行了系統(tǒng)研究，得出最佳萃取條件，萃取后產(chǎn)品純度高達90%以上。

2.4 核酸萃取反膠束溶液的運用不僅能夠解決核酸較難溶于有機相中的問題，還使得核酸能夠維持其原有的結構特征，這些特點為反膠束法能夠成功從部分噬菌體或者染色質中萃取出核酸發(fā)揮了重要作用。Goto等[14]成功采用CTAB/異辛烷反膠束溶液從鮭魚睪丸中提取DNA，結果表明，萃取的驅動力是陽離子表面活性劑和帶負電荷的DNA之間產(chǎn)生的靜電作用及表面活性劑的疏水性，指出表面活性劑濃度、萃取時間、pH、鹽濃度在DNA萃取過程中發(fā)揮重要作用，結果證明反膠束不僅可以萃取大量的蛋白質，且可以有效分離出DNA。

2.5 多糖類物質萃取對于一些分子量很大的物質(>10kDa)，由于其分子半徑大，不易被萃取進反膠束內核，采用反膠束體系萃取多糖類等高分子量物質的研究較少，有關學者尚在進行探索性研究。曹學軍等運用AOT/正庚烷，研究了茶多糖大分子物質的萃取以及反萃取過程中的主要影響因素，使萃取條件得到了明顯改善。研究表明，將多糖萃取到反膠束的同時使反萃取率提升至2倍以上，使反膠束技術能夠萃取大分子物質成為了可能[15]。

3 反膠束水合萃取

3.1 反膠束水合萃取機理水合物即為氣-液的非均相中反應階段結晶的產(chǎn)物，之后在液相中析出[16]，反應如式(2)所示：

M(g)+nwH2O(l)→M·nwH2O(s)

(2)

反膠束水合萃取機理是水合物的生成調節(jié)了反膠束中含水量，然后在水池里形成核，這個過程也使束內的一些自由水發(fā)生變化，即在反膠束內的水合物晶體的濃度比有機溶劑高的條件下，由于反膠束在體系中反應的過程，會一直出現(xiàn)分離和重新結合的現(xiàn)象，此時水合物的晶核和晶體便會流出，而部分自由水也就是以晶體的狀態(tài)轉移出的，伴隨晶體沉降這一進程的持續(xù)進行，束內水量持續(xù)減少，從而使得含水量以產(chǎn)生水合物的形式實現(xiàn)了調節(jié)[17]。利用靜電或疏水作用，部分極性物質在水池里也可實現(xiàn)增溶，同時與水合物的形成過程同步，析出于反膠束中，使萃取更為顯著，這種現(xiàn)象即是界面控制，且其主要影響因素有水相鹽度、酸度以及壓力等。

3.2 反膠束水合萃取技術的應用Nguyen等[18]研究了在熱力學條件下籠形水合物在反膠束中生成過程，及在生成過程中的主要影響因素為水與表面活性劑摩爾比W0，研究表明W0在10～15時萃取出的酶活性最高，探討了反膠束水合萃取的調節(jié)機理和氨基酸的提取機理即水合物形成使反膠束的尺寸發(fā)生改變，從而調節(jié)了反膠束中水池含水量，增溶氨基酸的能力也隨之受到影響；Noritomi等[19]采用AOT/異辛烷—丙烷，CFM，TFE體系從牛胰腺中水合萃取細胞色素C和核糖核酸酶A，萃取率高達80%。該研究不需要考慮pH和離子強度的變化，且因TFE的添加，使萃取出細胞色素C可以恢復其固有活性；丁皓等[20]采用CTAB/正辛烷-正戊醇反膠束體系萃取螺旋藻中的藻藍蛋白，對萃取效果及純化效果進行了研究，并分析了水合萃取的溫度、壓力、CTAB濃度、含水量W0等因素對反膠束水合萃取藻藍蛋白的作用，確定了最佳工藝參數(shù)，即初始條件為3 ℃、4 MPa、CTAB濃度0.10 mol/L、W040%時，藻藍蛋白的萃取效果最佳，萃取率提至81.3%。這為進一步開展反膠束水合萃取技術的研究及水合物法保護生物物質活性提供了有益的參考。

4 展望

新興的反膠束水合萃取工藝，拓寬了生物分離技術的發(fā)展領域，并取得了明顯的成就。水合物的形成是萃取過程中控制和提取束內生物活性物質的關鍵。通過將反膠束技術和水合物技術有機地結合，不僅可以避免蛋白質等極性物質變性問題，且反膠束溶液可反復利用，萃取過程可連續(xù)操作、處理量大，試劑無毒，對人體沒有傷害，耗費成本低，在工業(yè)化生產(chǎn)方面顯示了很大的應用潛力。盡管這一技術目前仍處于探索性研究開發(fā)階段，無論在機理還是應用方面均需要深入研究，如反膠束水合萃取的熱力學和動力學基礎研究尚不夠深入細致，萃取后的生物活性物質結構變化及其對功能性影響還不明確等，但從長遠來看，反膠束水和萃取技術在生物工程領域潛力巨大，雖然還有許多實際問題需要解決，但應用前景廣闊。

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Research Advances of Hydrated Reverse Micelles Extraction Technology in Bioengineering

LAN Yu1, SUN Xiang-dong2, ZHAO Dong-mei1*

(1.Food and Environmental Engineering Department of Oriental Institute, Harbin, Heilongjiang 150066; 2.Institute of Agricultural Products Quality and Safety, Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences, Harbin, Heilongjiang 150086)

The latest research developments at home and abroad on reverse micelles extraction technology was introduced in this paper, the reaction mechanism of hydrated reverse micelles extraction technology and application progress on bioengineering were reviewed.In addition, the application prospect of this technology in bioengineering was forecasted.

Reverse micelles; Hydration; Bioengineering

哈爾濱市優(yōu)秀學科帶頭人基金項目(2013RFXYJ049)；中國博士后基金項目(2013M531008)。

蘭宇(1990- )，女，黑龍江五常人，碩士研究生，研究方向：食品質量與安全。*通訊作者，副教授，碩士生導師，博士，從事食品質量與安全方面的研究。

2015-02-02

S 188

A

0517-6611(2015)08-004-03