2型糖尿病小鼠對(duì)旋毛蟲易感性的研究

劉璋楠，魏志潘，劉宇軒，夏新澤，周欣宇，王國英，王耀輝，2*

(1．河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004；2．河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004)

2型糖尿病小鼠對(duì)旋毛蟲易感性的研究

劉璋楠1，魏志潘1，劉宇軒1，夏新澤1，周欣宇1，王國英1，王耀輝1，2*

(1．河南大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，河南 開封 475004；2．河南大學(xué)醫(yī)學(xué)院 細(xì)胞與分子免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室，河南 開封 475004)

摘要：目的研究2型糖尿病小鼠對(duì)旋毛蟲的易感性。方法高糖高脂飲食喂養(yǎng)1 mon，加上小劑量鏈脲佐菌素(STZ)注射建立小鼠2型糖尿病模型；以常規(guī)飼料喂養(yǎng)小鼠作為對(duì)照。用旋毛蟲感染建模成功的小鼠，然后隨機(jī)分為PBS組，胰島素組。2周后處死小鼠，取膈肌進(jìn)行幼蟲檢測。結(jié)果用旋毛蟲幼蟲攻擊感染2型糖尿病建模成功小鼠，其肌肉幼蟲檢出率較正常對(duì)照組小鼠顯著增多(P<0.01)，胰島素治療后肌肉幼蟲檢出率下降。 結(jié)論2型糖尿病小鼠對(duì)旋毛蟲易感性增加，胰島素治療后其對(duì)旋毛蟲易感性下降。

關(guān)鍵詞：2型糖尿病；旋毛蟲；易感性

2型糖尿病(Type 2 diabetes mellitus, T2DM)占糖尿病患者的90%以上。因患病后會(huì)造成包括機(jī)體免疫力低下在內(nèi)的各種免疫系統(tǒng)失調(diào)體征，也被認(rèn)為是自身免疫性疾病。旋毛蟲病是旋毛形線蟲引起的人畜共患病。隨著人們生活水平的提高，飲食的多元化，越來越多的人因生食或吃未煮熟含有活的旋毛蟲幼蟲囊包的肉類而感染。

鑒于2型糖尿病和旋毛蟲病的流行病學(xué)特點(diǎn)，二者合并發(fā)病的人群在不斷升高，逐漸受到人們重視。目前，關(guān)于2型糖尿病與寄生蟲感染相互關(guān)系的研究比較少。本實(shí)驗(yàn)研究胰島素治療前后的2型糖尿病小鼠對(duì)旋毛蟲的易感性，為糖尿病患者旋毛蟲感染后的治療提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料

1.1　旋毛蟲蟲種

旋毛蟲蟲種引自河南省疾病預(yù)防控制中心，用小白鼠傳代保種。實(shí)驗(yàn)前以肌幼蟲轉(zhuǎn)種小白鼠備用，每鼠經(jīng)口感染100條肌幼蟲。

1.2　試劑與藥品

鏈脲佐菌素(STZ)購于Sigma公司，臨用時(shí)溶于pH 4.5的檸檬酸鈉-檸檬酸緩沖溶液，配成體積分?jǐn)?shù)為2%的溶液(20 g/L)；胰島素為人注射用正規(guī)胰島素。

2方法

2.1　糖尿病小鼠模型的建立及治療

40 只雄性昆明鼠，高脂高糖飼料飼養(yǎng)4 周后，禁食12 h，不禁水，從尾靜脈取血一小滴，應(yīng)用血糖儀檢測空腹血糖并記錄。稱體質(zhì)量后，小鼠腹腔注射STZ 50 mg/kg，繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)，1 周后再次注射相同劑量STZ。STZ 溶于0.1 mol/L pH 4.5的檸檬酸鹽緩沖液中；對(duì)照組給予同量不含 STZ的檸檬酸鹽緩沖液。第二次注射STZ 1 周后，空腹8 h 尾靜脈取血檢測血糖變化，血糖超過18 mmol/L的小鼠視為糖尿病小鼠模型成功。成功的糖尿病小鼠隨機(jī)分為糖尿病組和胰島素治療組，并繼續(xù)高脂高糖飼料喂養(yǎng)。胰島素治療組按照10 U/只，每周2 次皮下多點(diǎn)注射，對(duì)照組給予相同劑量的生理鹽水。

2.2　實(shí)驗(yàn)分組

昆明小鼠40只(雄雌各半)，體質(zhì)量(20±2)g，月齡4周，購自鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后被隨機(jī)分為正常喂養(yǎng)組10只和高脂高糖喂養(yǎng)組30只。2型糖尿病模型建模成功后小鼠再分為胰島素治療組和未治療組。

正常喂養(yǎng)組：用普通飼料喂養(yǎng)此組小鼠，與其他組小鼠同一天口飼含100±5條旋毛蟲幼蟲骨骼肌進(jìn)行感染。感染28 d后，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例提供的方法，斷頸處死。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天8點(diǎn)禁食。

高脂高糖喂養(yǎng)組(2型糖尿病模型組)：高脂高糖喂養(yǎng)28 d合并腹腔注射小劑量STZ建立2型糖尿病模型，通過血糖檢測鑒定建模成功?？陲暫?00±5條旋毛蟲幼蟲骨骼肌進(jìn)行感染。感染28 d后，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例提供的方法斷頸處死。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天8點(diǎn)禁食。

胰島素治療組：高脂高糖喂養(yǎng)1 mon合并腹腔注射小劑量STZ建立2型糖尿病模型，建模成功后，口飼含150±5條旋毛蟲幼蟲骨骼肌進(jìn)行感染。15 d后，用胰島素注射治療(餐前30 min注射，每次10 U)。治療2周后處死，處死前測小鼠血糖，按照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例提供的方法，斷頸處死。實(shí)驗(yàn)當(dāng)天8點(diǎn)禁食。

2.3　肌幼蟲檢查

小鼠感染后28 d處死，解剖小鼠，計(jì)數(shù)小鼠肌幼蟲的數(shù)量。取膈肌壓片鏡檢，收集肌幼蟲并計(jì)數(shù)。

2.4　統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)分析各組結(jié)果，采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析。

3結(jié)果

3.1　糖尿病模型小鼠的成模情況

造模后48 h , 模型鼠日攝水量增加, 隨著病程進(jìn)展, 明顯出現(xiàn)了多尿、多飲、多食以及身體消瘦的典型“三多一少”癥狀, 兼有疲乏、煩渴、毛失去光澤、活動(dòng)減少和生殖器感染等癥狀。高脂高糖喂養(yǎng)小鼠2周后的體質(zhì)量與正常喂養(yǎng)組小鼠相比體質(zhì)量明顯下降。見圖1。

圖1　糖尿病模型小鼠成模情況

3.2　血糖水平檢測情況

高脂高糖組血糖檢測，造模組40 d后血糖水平為(17.72±1.4) mmol /L，較造模初始血糖水平(5.95±0.6) mmol /L 明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01) ，說明造模成功。見圖2。

圖2　血糖水平檢測情況

3.3　胰島素治療前后血糖檢測

2型糖尿病小鼠建模成功后用胰島素治療2周，血糖明顯下降，與未治療糖尿病小鼠相比，血糖有顯著性差異(P<0.01)。見圖3。

圖3　胰島素治療前后血糖對(duì)比

3.4　旋毛蟲感染后肌幼蟲檢出情況

用旋毛蟲幼蟲攻擊各組小鼠后，正常對(duì)照組小鼠檢出囊包數(shù)量平均為49個(gè)，糖尿病模型組檢出囊包數(shù)量平均為99個(gè)，用胰島素治療后小鼠檢出囊包數(shù)量平均為20個(gè)，糖尿病模型組和對(duì)照組相比有顯著性差異(P<0.01)，胰島素治療組和糖尿病模型組相比有顯著性差異(P<0.01)。見圖4。

圖4　3組旋毛蟲感染后肌幼蟲檢出對(duì)比

4討論

糖尿病屬于免疫缺陷疾病，發(fā)病率日益增高，已成為世界性的常見病，多發(fā)病。糖尿病發(fā)病與慢性低度炎癥反應(yīng)有關(guān)，高血糖引起炎癥反應(yīng)的大量免疫活性細(xì)胞增加，在糖尿病病理改變中起到了重要作用[1-2]。糖尿病分為1型和2型，2型糖尿病又稱成人型糖尿病或者非胰島素依賴型糖尿病，多在35～40歲之后發(fā)病，占糖尿病患者90%以上。

旋毛蟲是分布最廣，宿主最多的線蟲[3]，多因生食或吃未煮熟含有活旋毛蟲幼蟲的肉類而感染。近年來，國內(nèi)許多省市發(fā)現(xiàn)本病，甚至有暴發(fā)流行的報(bào)告。鑒于2型糖尿病和旋毛蟲病的流行病學(xué)特點(diǎn)，二者合并發(fā)病的人群在不斷升高，二者相互作用的結(jié)果成為人們關(guān)注的重點(diǎn)。臨床上糖尿病患者常因免疫功能低下而易合并病毒、細(xì)菌等病原體的感染，但關(guān)于糖尿病與寄生蟲感染關(guān)系的研究比較少。

我們的實(shí)驗(yàn)用旋毛蟲幼蟲攻擊感染2型糖尿病小鼠，糖尿病小鼠的肌肉幼蟲檢出數(shù)較正常對(duì)照組小鼠顯著增多(P<0.01)，表明其對(duì)旋毛蟲易感性增加。胰島素治療后其對(duì)旋毛蟲易感性下降，提示糖尿病小鼠機(jī)體免疫力下降，抗旋毛蟲感染的能力下降， 經(jīng)胰島素治療后，較之模型組抗旋毛蟲感染的能力明顯增強(qiáng)。

旋毛蟲病是因旋毛蟲幼蟲和成蟲分泌排泄抗原引起無免疫力宿主產(chǎn)生的變態(tài)反應(yīng)。癥狀輕重與感染程度和宿主的反應(yīng)強(qiáng)弱有關(guān)，機(jī)體對(duì)旋毛蟲病的抵抗能力主要是免疫系統(tǒng)。 有報(bào)道[4]表明, 2型糖尿病小鼠CD4+、CD8+、CD4+ /CD8+比值、NK細(xì)胞顯著降低，尤以輔助性CD4+ 細(xì)胞下降突出。因此，2型糖尿病小鼠免疫能力下降可能是導(dǎo)致對(duì)旋毛蟲易感的重要因素之一。

已有報(bào)道顯示，旋毛蟲感染后STZ誘導(dǎo)T1DM(1型糖尿病)小鼠的胰島病理變化與單純STZ誘導(dǎo)T1DM小鼠的相似，在感染急性期T1DM小鼠的血糖水平顯著降低,在慢性期血糖無顯著變化，即旋毛蟲感染不能阻止STZ誘導(dǎo)小鼠發(fā)生T1DM[5]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，旋毛蟲感染可加劇糖尿病進(jìn)展[6]，但2型糖尿病對(duì)于旋毛蟲的易感性及對(duì)旋毛蟲病治療藥物的敏感性研究未見報(bào)道。我們的實(shí)驗(yàn)探索了2型糖尿病與旋毛蟲的聯(lián)系，為治療2型糖尿病合并旋毛蟲感染提供了很好的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Mandavia C H, Aroor A R, Demarco V G, et al. Molecular and metabolic mechanisms of cardiac dysfunction in diabetes[J]. Life Sci,2013, 92(11): 601-608.

[2] Raja L, Palanivelu S, Panchanatham S. Anti-inflammatory property of Kalpaamruthaa on myocardium in type 2 diabetes mellitus inducedcardiovascular complication[J]. Immunopharmacol Immunotoxicol,2013, 35(1): 119-125.

[3] Pozio E, Zarlenga D S. Recent advances on the taxonomy, syst ematics and epidemiology of Trichinella[J]. Int J Parasitol, 2005, 35(11) : 1 191-1 204.

[4] 朱雁飛，李懷慧，崔榮軍. 翻白草對(duì)2型糖尿病小鼠免疫功能的影響[J].牡丹江醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，31(1)：5-6.

[5] 張紫芳，姜鵬，高仕霖，等. 旋毛蟲感染對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)小鼠1型糖尿病的影響[J]. 中國病原生物學(xué)雜志，2013,8(7)：586-588.

[6] 朱耀國. 旋毛蟲病引起糖尿病加劇一例[J]. 中國寄生蟲學(xué)與寄生蟲病雜志，1996，14(1)：75.

[責(zé)任編輯時(shí)紅]

Susceptivity of trichinella spiralis in type 2 diabetic mouse

LIU Zhangnan1, WEI Zhipan1, LIU Yuxuan1, XIA Xinze1, ZHOU Xinyu1, WANG Guoying1, WANG Yaohui1,2*

(1.MedicalSchoolofHenanUniversity,Kaifeng,Henan475004,China;2KeyLabofCellandMolecularImmunology,MedicalSchoolofHenanUniversity,Kaifeng,Henan475004,China)

Abstract:Objective To investigate the susceptivity of Trichinella spiralis in type 2 diabetic mouse. MethodsMice were fed with high-sucrose/high-fat diet (HSFD) for one month，and then intraperitoneal inject low dose Streptozotocin to generate type 2 diabetes mellitus model. The mice model were infected by Trichinella spiralis and followed by dividing different groups randomly, including PBS group and insulin-treated group. 2 weeks after treatment, mice were sacrificed and count encysted larva in diaphragm. ResultsThe type 2 diabetic mice model constructed successfully, and encysted larva increased obviously compare to normal control. However, this phenotype could reverse by insulin treatment. Conclusion Susceptivity of Trichinella spiralis was increased in type 2 diabetic mouse, which could be reversed by insulin.

Key words:Type 2 diabetes mellitus ; trichinella spiralis; susceptivity

*通訊作者：王耀輝(1983-)，男，河南開封市人，博士，副教授，從事病原生物學(xué)的教學(xué)與研究工作。

作者簡介：劉璋楠(1995-)，男，河南開封市人，本科在讀生。

基金項(xiàng)目：河南省教育廳高等教育教學(xué)改革項(xiàng)目(2014SJGLX137 )；河南大學(xué)2014年度大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃(14NB054)。

收稿日期：2015-04-10

文章編號(hào)：1672-7606(2015)03-0181-03

中圖分類號(hào)：R383.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A