蘆根乙醇提取物對糖尿病小鼠肝糖原含量及糖原合成酶的影響

宋佰慧 程云龍 辛禧瑞 姜京植 張默函△

蘆根乙醇提取物對糖尿病小鼠肝糖原含量及糖原合成酶的影響

宋佰慧1程云龍2辛禧瑞3姜京植3張默函3△

目的 探討蘆根乙醇提取物對鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的糖尿病小鼠肝糖原含量及糖原合成酶（GS）的影響。方法正常對照組小鼠10只，糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型對照組、高劑量組和低劑量組，每組10只。應(yīng)用組織化學(xué)糖原（PAS）染色法檢測各組小鼠肝糖原含量，應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western-blot）法檢測各組實(shí)驗(yàn)小鼠肝臟GS mRNA和蛋白的表達(dá)。結(jié)果PAS染色后模型對照組肝糖原含量明顯減少，低劑量組、高劑量組較模型對照組明顯增多（P＜0.01），其中高劑量組最為明顯；模型對照組GS mRNA和GS蛋白均低于其他3組，低劑量組低于高劑量組（P＜0.05）。結(jié)論蘆根乙醇提取物對糖尿病小鼠肝糖原含量具有正向促進(jìn)作用，其機(jī)制可能是通過提高肝糖原合成酶的表達(dá)而起作用。

蘆根；乙醇；植物提取物；糖尿??；糖原；糖原合成酶；小鼠,近交系；肝糖原

糖尿病是一種由于胰島功能減退、胰島素抵抗等引發(fā)的以糖代謝紊亂為主的疾病。肝糖原作為體內(nèi)糖的儲(chǔ)存形式之一，參與機(jī)體血糖水平的調(diào)節(jié)。蘆根是一種常用中藥，具有免疫促進(jìn)、調(diào)節(jié)代謝、清除體內(nèi)毒物等作用，常作為組成成分出現(xiàn)在糖尿病治療的復(fù)方制劑中。本研究旨在觀察蘆根乙醇提取物對糖尿病小鼠肝糖原含量及糖原合成酶（GS）表達(dá)的影響，為蘆根治療糖尿病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 采用清潔級成年雄性昆明小鼠40只，體質(zhì)量23～25 g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。蘆根（北京同仁堂）；鏈尿佐菌素（STZ,Sigma）；小量柱離心式組織總RNA提取純化試劑盒（Promega）；一步法RT-PCR試劑盒（Promega）；總糖原合成酶與β-actin抗體（Cell Signaling）；辣根過氧化物標(biāo)記IgG抗體（SantaCruz）。GeneAmp 2004型PCR儀（美國）；Gel Doc XR凝膠成像分析系統(tǒng)（美國）；Western-blot轉(zhuǎn)膜儀（美國）；T-型200病理顯微分析系統(tǒng)（OLYMPUS）Amberlite XAD-7大孔吸附樹脂（上海）。

1.2 方法

1.2.1 蘆根乙醇提取物的制備 干燥蘆根切碎（長1 cm左右），8倍藥物體積的95%乙醇浸泡（≥12 h），然后分別用6倍、5倍95%乙醇回流提取，各次時(shí)間為2 h、1.5 h、1 h。合并過濾提取液，濃縮至浸膏，保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 糖尿病小鼠模型制備 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，禁食24 h，自由飲水。腹腔注射檸檬酸緩沖液配制的新鮮STZ溶液0.12 mg/g。飼養(yǎng)條件不變，喂養(yǎng)60 h后，禁食不禁水12 h，尾靜脈取血，檢測空腹血糖值（FBG），F(xiàn)BG≥11.1 mmol/L表明糖尿病小鼠模型制備成功[1-2]。

1.2.3 動(dòng)物分組及處理 正常對照組小鼠10只，糖尿病小鼠隨機(jī)分為模型對照組、高劑量組和低劑量組，每組10只。高劑量組和低劑量組分別按5.0 g/kg、1.25 g/kg灌胃蘆根乙醇提取物，正常對照組、模型對照組分別灌胃相同體積無菌蒸餾水，實(shí)驗(yàn)期間各組小鼠均給予普通飼料喂養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水，實(shí)驗(yàn)周期為5周。將小鼠脫頸處死后，迅速剖腹取肝臟，部分洗凈、拭干，備用，部分投入4℃Carnoy氏液中固定。

1.2.4 免疫組織化學(xué)觀察 將在4℃Carnoy氏液中的肝組織固定6～8 h后，上行乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切片（5 μm）。然后脫蠟，進(jìn)行碘酸雪夫氏（PAS）染色，顯示肝糖原[3]。以唾液消化肝糖原后的PAS染色作為對照實(shí)驗(yàn)。染色后用病理顯微分析系統(tǒng)進(jìn)行定量分析（每組隨機(jī)抽取3張×3個(gè)視野，在×200鏡下測定每個(gè)視野糖原顆粒面積所占百分比）。

1.2.5 RT-PCR檢測GS mRNA的表達(dá) Trizol提取肝臟組織總RNA10 μg，按照RT-PCR試劑盒要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。引物序列：GS上游5′-AAGAGTAACGTCACTGTGC-3′，下游5′-TGATGGAAATACCCCAAGG-3′，453 bp，60℃；β-actin上游5′-CACCCGCGAGTACAACCATC-3′，下游5′-TCTAGAA AGTGTGGTGCCAA-3′，338 bp，62℃。反應(yīng)條件：48℃反轉(zhuǎn)錄45 min，94℃滅活禽成髓細(xì)胞白血病病毒反轉(zhuǎn)錄酶活性及引物變性2 min，然后94℃30 s，各退火溫度1 min，68℃2 min，循環(huán)40次，68℃7 min，4℃冷卻。圖像分析系統(tǒng)成像，以β-actin為參考，計(jì)算GS mRNA的相對含量。

1.2.6 Westen-blot法檢測GS蛋白的表達(dá) 按照小量組織蛋白提取試劑盒要求提取總蛋白，全波長分光光度計(jì)測定蛋白樣品濃度。取待測蛋白煮沸2 min，加樣40 μg/孔。10%SDSPAGE電泳分離后，利用半干轉(zhuǎn)移法將分離膠內(nèi)的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜。用5%脫脂奶粉TBS-T緩沖液（25 mmol/L Tris, 150 mmol/L NaCl,1%Tween 20,pH7.5），封閉PVDF膜上的非特異性位點(diǎn)后洗膜。兔抗小鼠GS多克隆第一抗體（1∶500），4℃過夜，洗滌后加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG（1∶1 000），與膜室溫下孵育1 h，洗膜。圖像分析系統(tǒng)曝光成像并分析圖像，以β-actin為參考，計(jì)算GS蛋白的相對含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用±s表示，各組間進(jìn)行單因素方差分析，組間多重比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 蘆根乙醇提取物對糖尿病小鼠肝糖原含量的影響 PAS染色后肝糖原在光鏡下呈紫紅色顆粒。正常對照組肝糖原含量豐富，染色深。模型對照組肝糖原含量明顯減少，染色淺。蘆根乙醇提取物低劑量組、高劑量組肝糖原含量明顯增多，染色較深，其中高劑量組最為明顯，接近正常對照組，見圖1、表1。

Figure 1 The PAS results of the different groups of liver glycogen（×200）圖1 不同實(shí)驗(yàn)組肝糖原PAS結(jié)果（×200）

Table 1 Comparison of hepatic glycogen content,GS mRNA and GS protein between four groups of mice表14組間小鼠肝糖原含量、GS mRNA和GS蛋白的比較結(jié)果 （n=10±s）

Table 1 Comparison of hepatic glycogen content,GS mRNA and GS protein between four groups of mice表14組間小鼠肝糖原含量、GS mRNA和GS蛋白的比較結(jié)果 （n=10±s）

＊＊P＜0.01；a與（2）組比較，b與（4）組比較，P＜0.05

組別 肝糖原面積百分比（%）GS mRNA/ β-actin GS蛋白/β-actin正常對照組（1）模型對照組（2）高劑量組（3）低劑量組（4）F 44.76±0.97a18.54±0.84 41.38±0.78a36.13±0.65a10.205＊＊0.44±0.15ab0.17±0.16 0.40±0.10ab0.22±0.12a10.121＊＊0.22±0.13ab0.09±0.08 0.19±0.10ab0.12±0.10a3.647＊＊

2.2 蘆根乙醇提取物對糖尿病小鼠肝臟GS mRNA表達(dá)的影響 模型對照組GS mRNA低于其他3組，低劑量組低于高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖2。

2.3 蘆根乙醇提取物對糖尿病小鼠肝臟GS蛋白表達(dá)的影響 模型對照組GS蛋白表達(dá)低于其他3組，低劑量組低于高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表1、圖3。

Figure 2 Effects of ethanol extract of rhizoma phragmitis on GS mRNA expression圖2 蘆根乙醇提取物對GS mRNA表達(dá)的影響

Figure 3 Effects of ethanol extract of rhizoma phragmitis on GS protein expression圖3 蘆根乙醇提取物對GS蛋白表達(dá)的影響

3 討論

肝糖原可以調(diào)節(jié)和影響機(jī)體血糖的變化，其合成和分解受胰島素控制，當(dāng)此控制失調(diào)，可導(dǎo)致肝糖原分解增多，使血糖增高。胰島素可以抑制糖原分解，促進(jìn)糖原合成，這可能與糖原合成酶有關(guān)[4-5]。糖原合成酶是糖原合成過程中催化不可逆反應(yīng)的關(guān)鍵酶和限速酶，同時(shí)也是胰島素作用的主要靶酶。胰島素通過和受體結(jié)合后，啟動(dòng)一系列信號傳導(dǎo)途徑使糖原合成酶去磷酸化，從而提高糖原合成酶的活性[6]。本研究發(fā)現(xiàn)，蘆根乙醇提取物對糖尿病小鼠肝糖原的合成具有正向的促進(jìn)作用，且具有一定的量效關(guān)系。為探討高糖狀態(tài)下蘆根乙醇提取物的促糖原合成作用的具體機(jī)制，本研究對肝糖原合成過程中的關(guān)鍵酶-糖原合成酶進(jìn)行了相關(guān)研究，結(jié)果顯示，蘆根乙醇提取物可使糖尿病小鼠肝糖原合成酶mRNA表達(dá)增高，且高劑量組的作用效果明顯強(qiáng)于低劑量組，接近于正常對照組，說明蘆根乙醇提取物在基因?qū)用婵梢源龠M(jìn)高糖狀態(tài)下的肝糖原合成酶的表達(dá)。本研究的肝糖原合成酶蛋白表達(dá)結(jié)果與其基因表達(dá)情況吻合，說明蘆根乙醇提取物在蛋白層面也可以促進(jìn)高糖狀態(tài)下的肝糖原合成酶的表達(dá)。綜上，筆者認(rèn)為蘆根乙醇提取物對糖尿病小鼠肝糖原合成酶具有明顯的促表達(dá)作用，且量效關(guān)系明顯。

可能機(jī)制為，蘆根乙醇提取物增加了糖原合成酶表達(dá)，同時(shí)也可能減少了糖原合成酶被磷酸化失活的可能性，其結(jié)果是增加了有活性的糖原合成酶相對含量，使得肝糖原合成增多，血糖相對下降。另一種可能機(jī)制為：糖尿病狀態(tài)下，機(jī)體細(xì)胞內(nèi)原有的抗氧化系統(tǒng)功能下降，活性氧（ROS）含量增多[7-8]，從而改變多種基因及蛋白的表達(dá)。STZ誘導(dǎo)糖尿病小鼠肝糖原合成酶表達(dá)趨勢必受到ROS的影響，結(jié)果使糖尿病小鼠肝糖原含量下降，血糖升高。現(xiàn)代藥理分析，蘆根含大量的具有抗氧化效用的成分[9]，筆者利用乙醇提取了其中的部分該成分。其作用于機(jī)體后，減少了糖尿病小鼠肝細(xì)胞內(nèi)ROS，從而使得糖原合成酶去除束縛，進(jìn)而表達(dá)相對增加，間接地增加了活性糖原合成酶的量，使得肝糖原合成增加。

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（2012-12-18收稿 2013-04-15修回）

（本文編輯 魏杰）

Effects of Ehanol Extract of Rhizoma Phragmitis on Liver Glycogen Content and Glycogen Synthetase in Diabetic Mice

SONG Baihui1,CHENG Yunlong2,XIN Xirui3,JIANG Jingzhi3,ZHANG Mohan3
1 Department of Basic Medicine，Changchun Medical College，Changchun 131000,China;2 The Fourth People’s Hospital; 3 Department of Histology&Embryology,College of Medicine,Yanbian University

ObjectiveTo study the effects of ethanol extract of rhizoma phragmitis on liver glycogen content and glycogen synthetase(GS)in streptozotocin(STZ)induced diabetic mice.MethodsThe diabetic model mice were divided into model control group,high-dose group and low-dose group,10 mice for each group.Another 10 normal mice were used as control group.The liver glycogen content was detected by histochemical staining of glycogen(PAS)method.The expression of GS mRNA was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and Western blot assays.ResultsAfter PAS staining the hepatic glycogen content decreased significantly in model control group,and which was significantly increased in low-dose group and high-dose group compared with that of model control group(P＜0.01).The hepatic glycogen content was the highest in high-dose group compared with that of other three groups.The levels of GS mRNA and GS protein were significantly lower in model control group than those of other three groups,which were significantly lower in low-dose group than those of high-dose group(P＜0.05).ConclusionThere is a dose-dependent effect of ethanol extract of rhizoma phragmitis on liver glycogen in STZ induced diabetic mice,which may be related with the increased expression of liver glycogen synthetase.

RHIZOMA PHRAGMITIS;ethanol;plant extracts;diabetes mellitus;glycogen;glycogen synthase;mice, inbred strains;liver glycogen

R587.1,R-332

A【DOI】10.3969/j.issn.0253-9896.2014.01.020

1長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部（郵編131001）；2吉林省四平市第四人民醫(yī)院；3延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室

△通訊作者 E-mail:mhzhang@ybu.edu.cn