嗜熱偶氮染料降解復(fù)合菌群的構(gòu)建及其降解培養(yǎng)基的優(yōu)化

張慶華，胡景華，李芳良，陳　浪，涂慧敏

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045)

嗜熱偶氮染料降解復(fù)合菌群的構(gòu)建及其降解培養(yǎng)基的優(yōu)化

張慶華，胡景華，李芳良，陳浪，涂慧敏

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，江西南昌330045)

摘要：從富含偶氮染料的環(huán)境中取樣，通過在含有偶氮染料的富集培養(yǎng)基中不斷馴化培養(yǎng)，構(gòu)建了一組高效穩(wěn)定的偶氮染料降解復(fù)合菌群。該菌群在添加600 mg/L直接黑染料的降解培養(yǎng)基中55 ℃靜置培養(yǎng)9 h，其脫色率可達(dá)83.56%。為進(jìn)一步提高該菌群對(duì)偶氮染料的脫色效果，通過響應(yīng)面分析法對(duì)其降解培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。首先由Plackett-Burman試驗(yàn)確定影響染料直接黑降解的3個(gè)主要因素為葡萄糖、蛋白胨以及FeCl3，隨后通過中心組合試驗(yàn)和響應(yīng)面分析確定最優(yōu)的培養(yǎng)基配方為(g/L)：葡萄糖11.48、蛋白胨5.1、FeCl30.12、牛肉膏 4.5、K2HPO42.7、NaH2PO45.25、MgSO40.4和MnSO40.05。經(jīng)優(yōu)化以后，在含有0.6 g/L直接黑染料的培養(yǎng)基中55 ℃靜置培養(yǎng)9 h，該復(fù)合菌群對(duì)偶氮染料直接黑的脫色率高達(dá)99.24%，展現(xiàn)出了較大的應(yīng)用潛力。

關(guān)鍵詞：復(fù)合菌群；偶氮染料；降解；響應(yīng)面分析法

隨著世界經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，大量種類不同的合成染料被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)之中，且其中很大一部分染料以廢水的形式存在，造成了極大的環(huán)境污染問題[1-2]。在這些染料中，擁有一個(gè)或多個(gè)偶氮基團(tuán)(-N=N-)的芳香化合物——偶氮染料是最為常見和最大種類的合成染料，廣泛應(yīng)用于紡織、造紙、塑料、化妝品、皮革制品等行業(yè)中[3]。由于偶氮染料具有良好的穩(wěn)定性和持久性，且具有誘變和致癌能力[4]，一旦排入到環(huán)境中將造成嚴(yán)重的危害。

目前，染料廢水的脫色方法主要有化學(xué)法[5]、物理法[6]和生物法[7-12]等，其中物理和化學(xué)方法大多存在成本高、二次污染等問題，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；瘧?yīng)用[13]。而采用生物法來處理偶氮染料由于具有生態(tài)友好、投資少、能耗低、產(chǎn)生的污泥少等優(yōu)勢(shì)受到了廣泛的關(guān)注[14]。在生物處理法中，復(fù)合菌群脫色技術(shù)相對(duì)于微生物純培養(yǎng)來說更符合自然界中合成染料的微生物降解規(guī)律[15]，能夠通過多種微生物高效降解染料的不同部位并借助微生物之間的協(xié)同作用實(shí)現(xiàn)偶氮染料的徹底降解，成為了當(dāng)前的研究熱點(diǎn)[16]。由于大部分的染料廢水主要產(chǎn)生于染浴和漂洗工序，在排放時(shí)溫度高達(dá)50～70 ℃[17]，為此采用高溫復(fù)合菌系來降解染料廢水擁有良好的工藝匹配性。此外，高溫復(fù)合菌系在降解染料時(shí)具有降解速度快、可殺滅廢水中的病源菌、污染少、降溫費(fèi)用低等顯著優(yōu)點(diǎn)，且菌系中的高溫菌酶還能極大程度地耐受不良化學(xué)環(huán)境、抵抗有毒污染物或代謝產(chǎn)物的抑制作用、擁有較強(qiáng)的穩(wěn)定性和適應(yīng)性，因而具有廣泛的開發(fā)應(yīng)用潛力。

本實(shí)驗(yàn)通過在富含偶氮染料的土壤中取樣、不斷富集，定向構(gòu)建了一組具有廣譜降解功能的嗜熱偶氮染料降解復(fù)合菌系。由于培養(yǎng)基的成分對(duì)菌體的生長和酶的分泌都有著重要的影響，為此有必要對(duì)染料降解培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化從而進(jìn)一步提高復(fù)合菌群對(duì)偶氮染料的脫色能力。

近年來，許多研究表明采用響應(yīng)面優(yōu)化等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法來優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，可以明顯提高產(chǎn)物的產(chǎn)量[18-19]。通過Plackett-Burman設(shè)計(jì)、最陡爬坡實(shí)驗(yàn)以及響應(yīng)面分析完成發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。其中，Plackett-Burman(PB)法是一種近飽和的二水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，能用最少試驗(yàn)次數(shù)估計(jì)出因素的主效應(yīng)，以從眾多的考察因素中快速有效地篩選出最為重要的幾個(gè)因素供進(jìn)一步研究[20]。響應(yīng)面擬合方程只在考察的緊接鄰域里才充分近似真實(shí)情形，在其他區(qū)域擬合方程與被近似的函數(shù)方程毫無相似之處，幾乎無意義。所以，要先逼近最佳值區(qū)域后才能建立有效的響應(yīng)面擬合方程[20]。快速登高法實(shí)驗(yàn)是以實(shí)驗(yàn)值變化的梯度方向?yàn)榈歉叻较?，根?jù)各因素效應(yīng)值的大小確定變化步長，能快速、經(jīng)濟(jì)地逼近最佳值區(qū)域[21]。為此，本研究亦采用響應(yīng)面優(yōu)化法來確定復(fù)合菌系對(duì)偶氮染料直接黑降解的最優(yōu)培養(yǎng)基配方。

本實(shí)驗(yàn)選用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，對(duì)葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4、FeCl3和MnSO4共8個(gè)因素進(jìn)行考察，以脫色率為響應(yīng)值，進(jìn)行各因素主效應(yīng)分析。利用CCD設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)3因素5水平共20個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)，最終確定染料降解培養(yǎng)基的最佳配方。該研究的順利開展有利于充分發(fā)掘該復(fù)合菌群對(duì)偶氮染料的降解潛力，為該菌群的大規(guī)模開發(fā)利用奠定一定的研究基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

(1) 偶氮染料：實(shí)驗(yàn)所用偶氮染料為直接黑(分子式為C34H25N9Na2O7S2)，購于武漢華美華科技(集團(tuán))有限公司。

(2) 富集培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨2.0、牛肉膏3.0、葡萄糖5.0、KH2PO41.8、NaH2PO4·12H2O 3.5、MgSO4·7H2O 0.2、FeCl3·7H2O 0.01、MnSO4·7H2O 0.02、直接黑 0.01，pH7.2。

(3) 降解培養(yǎng)基(g/L):蛋白胨2.0、牛肉膏3.0、葡萄糖5.0、KH2PO41.8、NaH2PO4·12H2O 3.5、MgSO4·7H2O 0.2、FeCl3·7H2O 0.01、MnSO4·7H2O 0.02、直接黑0.6，pH7.2。

1.2實(shí)驗(yàn)藥品及儀器

實(shí)驗(yàn)藥品均為國產(chǎn)分析純。實(shí)驗(yàn)主要儀器：Sartorius電子天平，塞多利斯公司；PHS-3E型精密pH計(jì)，上海雷磁儀器廠；723型可見光分光光度計(jì)，北京瑞利分析儀器公司；BPH-9082恒溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1偶氮染料降解復(fù)合菌群的富集篩選分別從江西某紡織公司印染車間排污口不同位置采樣，保存于無菌的玻璃三角瓶中備用。加入少量的無菌水混勻后，吸取水樣5 mL，加入到含有富集培養(yǎng)液的三角瓶中，于55 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。當(dāng)三角瓶內(nèi)的染料基本降解時(shí)(培養(yǎng)液不再是明顯的黑色)，取10 mL的培養(yǎng)液接種到新鮮的富集培養(yǎng)基中，同時(shí)淘汰沒有明顯降解能力的樣品(培養(yǎng)液仍舊呈現(xiàn)黑色)，如此傳代培養(yǎng)幾個(gè)周期，結(jié)合脫色時(shí)間和脫色率，從中挑選出幾組效果良好的培養(yǎng)液。最后將降解液按照兩兩或者全部混合的組配方式接種篩選并連續(xù)傳代培養(yǎng)，待菌群穩(wěn)定后得到一組偶氮染料降解復(fù)合菌群。

1.3.2偶氮染料降解復(fù)合菌群的馴化為提高復(fù)合菌群降解偶氮染料的性能，將上述篩選得到的復(fù)合菌群按照5%的接種量接種于富集培養(yǎng)基中于55 ℃靜置培養(yǎng)直到黑色消失為止。隨后將富集培養(yǎng)基中直接黑染料的濃度不斷提高進(jìn)行馴化培養(yǎng)，經(jīng)過14個(gè)批次的馴化(各個(gè)批次的染料濃度分別為：0.01、0.02、0.04、0.06、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.45、0.5、0.55、0.6 g/L)，待菌群穩(wěn)定后最終得到1組高效的偶氮染料降解復(fù)合菌群。通過分子生物學(xué)方法分析，發(fā)現(xiàn)該復(fù)合菌群主要由Anoxybacillussp.，Brevibacillussp.和芽孢桿菌等近8種染料降解和非降解微生物所組成。

1.3.3偶氮染料降解復(fù)合菌群脫色能力的測(cè)定將上述菌群接入染料降解培養(yǎng)基55 ℃靜置培養(yǎng)9 h后，取適量培養(yǎng)液8 000 r/min離心10 min，將上清液在直接黑染料的最大吸收波長650 nm處用分光光度計(jì)測(cè)其OD值，并以不接種的染料培養(yǎng)基為對(duì)照，計(jì)算脫色率，以表示其對(duì)染料的脫色能力。

脫色率=(A-B)/A×100%

(1)

其中A：不接種菌液的OD值；B:接種菌液的OD值。

1.3.4染料降解培養(yǎng)基優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)(1)Plackett-Burman設(shè)計(jì)。每個(gè)變量設(shè)計(jì)高低2個(gè)水平。本實(shí)驗(yàn)初步確定所要考察的8種組分:葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4、FeCl3和MnSO4，每個(gè)因素取兩個(gè)水平，響應(yīng)值為脫色率。

(2)最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。根據(jù)PB試驗(yàn)得出的一次擬合方程安排最陡爬坡試驗(yàn)。一次擬合方程中，各變量的系數(shù)決定爬坡方向和變化步長，如果系數(shù)為負(fù)，則該因素水平應(yīng)為遞減，反之為遞增，系數(shù)越大變化步長越小。

(3)響應(yīng)面分析。根據(jù)CCD中心組合設(shè)計(jì)原理，由Plackett-Burman設(shè)計(jì)篩選出3個(gè)重要影響因素各取5水平，設(shè)計(jì)了3因素5水平共20個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析。本實(shí)驗(yàn)用統(tǒng)計(jì)分析軟件Design-Expert對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1偶氮染料降解復(fù)合菌群的構(gòu)建結(jié)果

將接種復(fù)合菌群的培養(yǎng)液于55 ℃靜置培養(yǎng)不同時(shí)間觀察染料的降解效果(圖1)。由圖1可見，將復(fù)合菌群接種于降解培養(yǎng)基中經(jīng)9 h的靜置培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)染料的黑色完全褪去并變成淡黃色。此外，通過20個(gè)批次的連續(xù)傳代培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)該復(fù)合菌群普遍表現(xiàn)出良好的脫色效果，這表明構(gòu)建的偶氮染料分解復(fù)合菌群具有良好的穩(wěn)定性，并且可以高效分解偶氮染料直接黑。

圖1　復(fù)合菌群對(duì)偶氮染料直接黑的降解效果對(duì)比(A:0 h;B:9 h)Fig.1　Comparison of degradation effect of azo dyes of direct black by the microbial consortium (A:0 h;B:9 h)

2.2影響復(fù)合菌群脫色率關(guān)鍵因素的確定

選取8個(gè)因素，試驗(yàn)次數(shù)為12的Plackett-Burman設(shè)計(jì)，其中每組設(shè)置3個(gè)平行，考察各因素的主效應(yīng)和交互作用的一級(jí)作用，確定重要影響因素。Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與響應(yīng)值(脫色率)見表1。

表1　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

由于當(dāng)Pr>F值小于0.05就表明模型顯著，根據(jù)表1結(jié)果利用Design-Expert軟件進(jìn)行顯著影響因子分析得出模型的Pr>F為0.025 6，所以該模型顯著，其結(jié)果見表2。

表2　Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果

由表2可見，影響染料脫色率因素顯著性由大到小依次為葡萄糖、蛋白胨、FeCl3、MnSO4、牛肉膏、NaH2PO4、MgSO4和KH2PO4。對(duì)直接黑脫色率具有顯著影響的3個(gè)因素中，葡萄糖、蛋白胨以及FeCl3均對(duì)脫色率表現(xiàn)為正效應(yīng)，因此按照一定的梯度不斷增大葡萄糖、蛋白胨以及FeCl3含量，設(shè)計(jì)12組實(shí)驗(yàn)，每組設(shè)置3個(gè)平行，以最快的速度逼近響應(yīng)面區(qū)域。

2.3最陡爬坡路徑的確定

由Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)可知，葡萄糖和蛋白胨以及FeCl3這3個(gè)因素對(duì)脫色率有重要的影響，而且都存在顯著正效應(yīng)。為此，根據(jù)這3個(gè)因素效應(yīng)值大小的比例設(shè)定它們的變化方向及步長進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，設(shè)計(jì)及結(jié)果如表3所示。

表3　最陡爬坡實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果

由表3可知，最優(yōu)條件在處理7和處理8之間，故選取葡萄糖=11 g/L，蛋白胨=5 g/L，F(xiàn)eCl3=0.12 g/L為后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)。

表4　中心組合設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)確定的3個(gè)重要因素葡萄糖、蛋白胨和FeCl3以及中心組合設(shè)計(jì)(CCD)原理，以脫色率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素5水平共20個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表4所示。

用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，其響應(yīng)面二次模型的方差分析結(jié)果如表5所示。

表5　響應(yīng)面二次模型的方差分析

**為差異極顯著(P<0.01);*為差異顯著(P<0.05)。**means very significant differences;* means significant difference．

由模型推導(dǎo)出的等式(1)描述了這些顯著參數(shù)和響應(yīng)值脫色率在編碼水平的相互關(guān)系。該方程如下所示：

脫色率(%)=97.98+0.85A+0.31B-0.005 093C-0.11AB+0.065AC-0.15BC-0.86A2-0.62B2-0.58C2

(1)

該回歸方程各個(gè)回歸系數(shù)的顯著性分析均通過F和P值進(jìn)行檢驗(yàn)。由于Pr>F的值小于0.050 0就表明該模型是顯著的，由表5可見該模型顯著。失擬項(xiàng)的Pr>F值為0.323 7，表明該模型失擬項(xiàng)不顯著，說明建立的上述模型可以代替試驗(yàn)值來解釋響應(yīng)結(jié)果。

通過Design-Expert軟件分析得到染料降解培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為：葡萄糖11.48 g/L、蛋白胨5.1 g/L、FeCl30.12 g/L、牛肉膏4.5 g/L、K2HPO42.7 g/L、NaH2PO45.25 g/L、MgSO40.4 g/L、和MnSO40.05 g/L。

2.5響應(yīng)面分析

在前面建立的回歸模型基礎(chǔ)上，本研究通過繪制的響應(yīng)面和等高線圖分別分析了3個(gè)參數(shù)之間的交互關(guān)系并確定了最大響應(yīng)值下各參數(shù)的最優(yōu)水平?；诘仁?繪制的響應(yīng)面和等高線圖見圖2。

當(dāng)FeCl3設(shè)定為中心點(diǎn)處的恒定值時(shí)，葡萄糖濃度和蛋白胨濃度對(duì)脫色率的影響如圖2-(a)所示。在預(yù)處理過程中隨著葡萄糖濃度和蛋白胨濃度的提高，經(jīng)預(yù)處理后脫色率上升到了一定的程度，但是進(jìn)一步提高葡萄糖濃度或者蛋白胨的濃度，則會(huì)導(dǎo)致隨后的脫色率下降。同樣的現(xiàn)象在圖2-(b)和2-(c)中也可以看到，其中圖2-(b)表示蛋白胨濃度設(shè)定在中心點(diǎn)時(shí)，葡萄糖濃度和FeCl3濃度對(duì)脫色率的影響，而圖2-(c)則表示葡萄糖濃度設(shè)定在恒定值時(shí)，F(xiàn)eCl3濃度和蛋白胨濃度對(duì)脫色率的影響。

圖2　脫色率的響應(yīng)面和等高線圖(a:葡萄糖和蛋白胨的交互作用；b:葡萄糖和FeCl3的交互作用；c:蛋白胨和FeCl3的交互作用)Fig.2　The response surface and contour line of decolourization ratio (a:Interaction between Glucose and Peptone;b:Interaction between Glucose and FeCl3;c:Interaction between Peptone and FeCl3)

2.6最佳條件下復(fù)合菌群對(duì)染料的降解效果分析

圖3　不同培養(yǎng)時(shí)間下的脫色率變化情況Fig.3　Change of the decolourization ratio under different incubation time

為了研究復(fù)合菌群在最優(yōu)條件下的降解效果，按照優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方進(jìn)行配制，同時(shí)加入直接黑染料，控制其終濃度為0.6 g/L，隨后接入5%的復(fù)合菌群于55 ℃下靜置培養(yǎng)不同時(shí)間(圖3)。由圖3可見，從0～9 h復(fù)合菌群對(duì)染料脫色率顯著提高，到9 h時(shí)其脫色率達(dá)到了99.24%，隨后進(jìn)一步延長培養(yǎng)時(shí)間其脫色率基本保持穩(wěn)定，這與我們優(yōu)化的結(jié)論一致。

3結(jié)論與討論

本研究通過定向富集馴化得到了一組高效的嗜熱偶氮染料降解復(fù)合菌群，該復(fù)合菌群展現(xiàn)出了良好的偶氮染料降解能力。通過響應(yīng)面法優(yōu)化確定了該復(fù)合菌群降解偶氮染料直接黑的最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖11.48 g/L、蛋白胨5.1 g/L、FeCl30.12 g/L、牛肉膏4.5 g/L、K2HPO42.7 g/L、NaH2PO45.25 g/L、MgSO40.4 g/L和MnSO40.05 g/L。經(jīng)過優(yōu)化以后，該復(fù)合菌群在55 ℃下靜置培養(yǎng)9 h能將0.6 g/L的直接黑染料有效降解，其脫色率高達(dá)99.24%。

采用生物法對(duì)偶氮染料進(jìn)行有效降解是當(dāng)前的一個(gè)研究熱點(diǎn)。在生物處理過程中由于大多數(shù)單菌對(duì)偶氮染料降解的廣譜性差、環(huán)境適應(yīng)能力弱、脫色速度慢從而無法滿足實(shí)際廢水處理的要求[22]。采用微生物混合培養(yǎng)的模式可借助微生物之間的代謝互補(bǔ)或共代謝作用實(shí)現(xiàn)偶氮染料分子的高度降解和礦化，從而提高染料的降解能力和速度[23]。本研究構(gòu)建的復(fù)合菌群能在55 ℃ 9 h的靜置培養(yǎng)過程中將600 mg/L的偶氮染料高效降解，比文獻(xiàn)報(bào)道的偶氮染料降解復(fù)合菌系處理染料的濃度(200 mg/L)和時(shí)間(16～24 h)上具有一定的優(yōu)勢(shì)[24-25]，此外由于常規(guī)偶氮染料廢水中的染料濃度僅為10～200 mg/L[26]，本研究得到的染料降解復(fù)合菌群展現(xiàn)出了較大的工業(yè)化應(yīng)用潛質(zhì)。后續(xù)將進(jìn)一步研究該復(fù)合菌群中各類染料降解酶的作用以及染料的降解途徑，此舉將有利于此復(fù)合菌系在資源利用、水循環(huán)和生態(tài)修復(fù)方面產(chǎn)生較大的環(huán)境和社會(huì)效益。

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Construction of A Thermophilic Microbial Consortium for Azo Dyes

Degradation and Optimization of Its Degradation Medium

ZHANG Qing-hua,HU Jing-hua,LI Fang-liang,CHEN Lang,TU Hui-min

(College of Bioscience and Bioengineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Abstract:A microbial consortium with high effective and stable azo dye degradation ability was constructed by successive domestication in the enrichment medium containing azo dyes,where the inoculums were sampled from the environment filled with azo dyes.The decolorization ratio in this microbial consortium could reach 83.56% when incubated in the degradation medium containing 600 mg/L of direct black at 55 ℃ for 9 h.In order to further increase its decolourization ratio to azo dyes,response surface methodology was utilized to optimize the degradation medium.Firstly,Plackett-Burman test was utilized to identify the most significant factors influencing the decolourization ratio.It was found that the three main factors affecting the dye decolorization rate were Glucose,Peptone and FeCl3.Subsequently,central composite design and response surface analysis were utilized to optimize the degradation medium.It was found that the optimum combination (g/L) was:Glucose 11.48,Peptone 5.1,FeCl30.12,Beef Extract 4.5,K2HPO42.7,NaH2PO45.25,MgSO40.4 and MnSO40.05.After optimization,the decolorization ratio of microbial consortium increased to 99.24% showing obvious application potential.

Key words:microbial consortium；azo dyes；degradation;response surface methodology

作者簡介：張慶華(1979—)，男，講師,博士，主要從事發(fā)酵與環(huán)境微生物學(xué)研究，E-mail:zqhnet@163.com。

基金項(xiàng)目：江西省教育廳科技項(xiàng)目(GJJ14297)和江西農(nóng)業(yè)大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(201410410088)

收稿日期：2014-09-12修回日期：2014-10-21

中圖分類號(hào)：TQ613.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000-2286(2015)01-0126-09