檉柳組培苗抗氧化酶及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)

郭楠楠，陳學(xué)林，張 繼，陳金元，朱愿軍，丁映童

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州730070）

檉柳組培苗抗氧化酶及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)NaCl脅迫的響應(yīng)

郭楠楠，陳學(xué)林＊，張 繼，陳金元，朱愿軍，丁映童

（西北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蘭州730070）

以檉柳種子為材料，利用組培方法建立其無菌離體培養(yǎng)體系而獲得組培苗。向培養(yǎng)基（MS＋1.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L NAA）中添加不同濃度NaCl（0、50、80、100、120、150和200mmol／L）建立脅迫條件，測定各濃度NaCl脅迫下檉柳組培苗抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、質(zhì)膜透性及超氧陰離子（O－·2）生成速率等的變化，探討檉柳組培苗應(yīng)對(duì)NaCl脅迫的生理機(jī)制。結(jié)果顯示：（1）隨著NaCl脅迫濃度的增加，檉柳組培苗超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化物酶（POD）活性表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢，并均在100mmol／L NaCl的脅迫下達(dá)到最大值，而抗壞血酸過氧化物酶（APX）活性則表現(xiàn)出逐漸下降的趨勢；（2）隨著NaCl脅迫濃度的增加，組培苗體內(nèi)有機(jī)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)游離脯氨酸（Pro）、可溶性蛋白（Pr）和可溶性糖的含量逐漸升高且顯著高于同期對(duì)照，在200mmol／L濃度下分別比對(duì)照顯著增加53.77%、47.38%和67.65%；（3）組培苗過氧化氫（H2O2）、超氧陰離子（O－·2）生成速率、丙二醛（MDA）含量以及細(xì)胞質(zhì)膜透性也隨著NaCl脅迫濃度的增加均表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢且顯著高于同期對(duì)照，在200mmol／L濃度下分別比對(duì)照顯著增加36.42%、58.71%、82.60%和42.54%。研究表明，檉柳組培苗抗氧化酶系統(tǒng)在低濃度NaCl（≤100mmol／L）脅迫下表現(xiàn)出良好的活性氧清除活性，而其體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在各濃度脅迫下均發(fā)揮著積極的調(diào)節(jié)作用，從而使檉柳表現(xiàn)出較強(qiáng)的耐鹽性。

檉柳；組培苗；鹽脅迫；抗氧化酶系統(tǒng)；滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)

檉柳（Tamarix chinensis Lour.）是檉柳科（Tamaricaceae）檉柳屬（Tamarix）的灌木或小喬木，廣泛分布于中國生態(tài)環(huán)境條件十分脆弱，土壤沙漠化、鹽漬化日趨嚴(yán)重的西北干旱、半干旱地區(qū)，是典型的鹽生植物［1－2］。檉柳屬植物具有抗干旱、耐貧瘠、耐鹽堿、耐風(fēng)蝕沙埋、根系發(fā)達(dá)、壽命長等特性，在維持荒漠生態(tài)系統(tǒng)的生物多樣性、生態(tài)服務(wù)功能及穩(wěn)定性等方面具有重要的作用，是水土保持、荒漠化防治和土壤改良的優(yōu)良造林樹種［3］，同時(shí)，它還是重要的工業(yè)用材和薪材、優(yōu)良的飼料源、中藥［4］和鞣料原料，也是觀賞價(jià)值極高的景觀樹種，研究植物耐鹽性和耐鹽基因克隆的理想材料［5］。目前關(guān)于檉柳的研究主要包括組織培養(yǎng)及快繁的研究，韋小敏等［6］、韓琳娜等［7］、李先芳等［8］均對(duì)MS培養(yǎng)基附加激素6－BA和NAA檉柳不定芽的誘導(dǎo)、生根及叢生芽繁殖最佳激素水平進(jìn)行了探究，研究結(jié)果有所不同，可能與其檉柳產(chǎn)地及品種特性有關(guān)。還有對(duì)檉柳耐鹽機(jī)理方面的研究，許多學(xué)者研究了檉柳屬植物中與耐鹽有關(guān)的形態(tài)學(xué)適應(yīng)特征、泌鹽適應(yīng)機(jī)理，包括鹽腺的結(jié)構(gòu)、發(fā)育、分泌離子種類以及保護(hù)性物質(zhì)等，例如不同濃度NaCl對(duì)檉柳插穗芽萌發(fā)和新梢生長的影響，檉柳插穗單鹽脅迫水培試驗(yàn)，以及對(duì)檉柳泌鹽機(jī)理和耐鹽機(jī)制進(jìn)行的專項(xiàng)研究［9－10］，各項(xiàng)研究均顯示，檉柳屬植物的泌鹽腺在調(diào)節(jié)體內(nèi)離子平衡、維持滲透壓穩(wěn)定、完成正常生理活動(dòng)及提高植物耐鹽性能等方面發(fā)揮重要作用。但關(guān)于NaCl脅迫下檉柳組培苗抗鹽性及抗氧化系統(tǒng)的研究未見報(bào)道。本研究以檉柳組培苗為試材，通過測定不同濃度NaCl脅迫下檉柳組培苗抗氧化酶活性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量、質(zhì)膜透性及超氧陰離子（O－·2）生成速率等的變化，探討檉柳組培苗應(yīng)對(duì)NaCl脅迫的生理機(jī)制，為其它的植物耐鹽生理研究及耐鹽分子生物學(xué)研究提供理論依據(jù)和參考。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本實(shí)驗(yàn)以采自甘肅省金昌市的檉柳種子為材料，通過常規(guī)組培方法（溫度25℃，光照時(shí)間16h／d，光照強(qiáng)度2 000lx）待嫩芽長至1cm左右，取其芽尖，進(jìn)行無菌消毒，轉(zhuǎn)移接種在不含任何植物激素的MS培養(yǎng)基上獲得無菌苗，然后在MS＋6－BA 1.0mg／L＋NAA 0.1mg／L培養(yǎng)基上增殖培養(yǎng)，獲得大量組培苗。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 材料處理 將生長良好的檉柳組培苗在無菌的條件下轉(zhuǎn)接在含不同濃度NaCl的MS＋6－BA 1.0mg／L＋NAA 0.1mg／L培養(yǎng)基上，NaCl濃度梯度為0、50、80、100、120、150、200mmol／L。培養(yǎng)基pH值均調(diào)至5.8，培養(yǎng)3d后取其幼苗用去離子水沖洗干凈并吸干水分，稱得鮮質(zhì)量測定相關(guān)指標(biāo)，每個(gè)處理做3次重復(fù)。

1.2.2 生理指標(biāo)測定 SOD活性采用NBT光化學(xué)還原反應(yīng)法測定；POD活性采用愈創(chuàng)木酚比色法測定；APX活性檢測參照文獻(xiàn)［11－12］，采用考馬斯亮藍(lán)G－250染色法測定可溶性蛋白含量；采用茚三酮比色法測定游離脯氨酸含量［13］；可溶性糖按照李合生蒽酮比色法測定［14］，采用硫代巴比妥酸比色法測定丙二醛含量；電導(dǎo)率法測定質(zhì)膜透性；超氧陰離子（O－·2）的生成參照王愛國等［15］的方法。H2O2的含量檢測參照Sergiev方法［16］。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有實(shí)驗(yàn)均做3次重復(fù)，所涉及的統(tǒng)計(jì)分析均使用Excel、SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，多重比較采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度NaCl脅迫對(duì)檉柳組培苗抗氧化酶活性的影響

圖1結(jié)果顯示，各濃度NaCl脅迫下檉柳組培苗3種抗氧化酶（SOD、POD、APX）活性均有不同程度變化。其中，隨著NaCl濃度的增加，SOD和POD活性均呈先升后降的趨勢，均在100mmol／L時(shí)出現(xiàn)峰值，此時(shí)比CK分別顯著增加了35.17%、27.30%；而APX活性則一直呈下降趨勢，且隨著處理濃度的升高其下降幅度增大，并顯著低于對(duì)照，在NaCl濃度達(dá)到200mmol／L時(shí)，其活性與對(duì)照相比顯著下降了22.11%。結(jié)果表明：檉柳抗氧化酶活性在低濃度（＜100mmol／L）鹽脅迫下有相應(yīng)的適應(yīng)能力，從而使活性氧的產(chǎn)生和清除保持一種動(dòng)態(tài)平衡，減少膜脂發(fā)生過氧化；而在高濃度（＞100 mmol／L）的鹽脅迫下抗氧化酶活性下降，而APX活性持續(xù)下降，說明自由基的積累增加，活性氧代謝的動(dòng)態(tài)平衡被打破，植物體受到一定的程度的傷害?？梢?，抗氧化酶活性的調(diào)節(jié)是檉柳組培苗應(yīng)對(duì)鹽分脅迫的主要對(duì)策之一。

2.2 不同濃度NaCl脅迫對(duì)檉柳組培苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

圖2結(jié)果顯示，隨NaCl濃度增加，檉柳組培苗可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量均呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，并顯著高于對(duì)照，如在200mmol／L NaCl脅迫下，檉柳組培苗的可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量分別比對(duì)照顯著增加了47.38%、53.77%和67.65%。說明不同濃度鹽脅迫下檉柳組培苗均能通過增加可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量來加強(qiáng)其滲透調(diào)節(jié)能力，并以可溶性糖為主?？梢?，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累是檉柳組培苗應(yīng)對(duì)鹽分脅迫的另一主要對(duì)策，主要通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透壓來維持細(xì)胞滲透平衡，在整個(gè)脅迫過程中對(duì)檉柳組培苗起著積極的滲透調(diào)節(jié)作用；當(dāng)其受到鹽分脅迫時(shí)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量增加，在一定程度上反映了檉柳組培苗受脅迫程度和組培苗對(duì)鹽分脅迫的忍受和抵抗能力。

2.3 不同濃度NaCl脅迫對(duì)檉柳組培苗氧自由基產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

從圖3可以看出，隨著NaCl脅迫濃度的增加，檉柳組培苗的超氧陰離子產(chǎn)生速率和過氧化氫含量呈現(xiàn)明顯增加的趨勢，且顯著高于對(duì)照；當(dāng)NaCl濃度達(dá)到200mmol／L時(shí)，組培苗的超氧陰離子產(chǎn)生速率和過氧化氫含量比對(duì)照分別顯著增加了58.71%、36.42%。說明隨著NaCl脅迫濃度的升高，抗氧化酶對(duì)活性氧的清除與O－·2和H2O2等活性氧的產(chǎn)生積累之間的平衡被打破，最終表現(xiàn)為抗氧化酶的活性逐漸下降，從而超氧陰離子、過氧化氫等代謝產(chǎn)物的含量逐漸增加，對(duì)組培苗個(gè)體產(chǎn)生不利的影響，甚至有傷害作用。

2.4 不同濃度NaCl脅迫對(duì)檉柳組培苗丙二醛含量的影響

圖4結(jié)果顯示，在不同濃度NaCl脅迫下，檉柳組培苗的MDA含量和質(zhì)膜透性與對(duì)照相比均顯著增加，并隨鹽脅迫濃度呈現(xiàn)逐漸增加趨勢；如在NaCl濃度達(dá)到200mmol／L時(shí)，組培苗的MDA含量和質(zhì)膜透性與對(duì)照相比分別顯著增加了82.60%和42.54%。說明隨著鹽脅迫程度的加深，組培苗體內(nèi)不斷有大量的自由基積累，并且與膜質(zhì)發(fā)生了過氧化反應(yīng)，對(duì)生物膜造成了嚴(yán)重的破壞，膜的通透性隨之增加，植物細(xì)胞受到不同程度的傷害，導(dǎo)致代謝紊亂，生長明顯衰退。從而反映出不同濃度鹽脅迫下檉柳組培苗膜脂過氧化程度和系統(tǒng)受傷害程度。

3 討論與結(jié)論

植物在鹽脅迫條件下，體內(nèi)保護(hù)性酶（SOD、POD、APX）能相互協(xié)調(diào)以降低植物體內(nèi)氧自由基水平，維持植物體正常生長、代謝。鹽脅迫條件下，紅砂植株的活性氧傷害主要依靠SOD、POD、APX等抗氧化酶的協(xié)調(diào)來防御［17］；洋甘菊體內(nèi)抗氧化酶活性的增加可清除由于NaCl脅迫產(chǎn)生的過量活性氧［18］；低濃度鹽處理下，多枝檉柳可通過提高抗氧化酶活性來清除多余的活性氧自由基，減少M(fèi)DA對(duì)生物膜的氧化損傷［19］。所以抗氧化酶活性的高低既是對(duì)環(huán)境中是否存在活性氧誘因的體現(xiàn)，又是植物體在活性氧誘導(dǎo)下如何啟動(dòng)自身防御機(jī)制的反映［20－21］。SOD是活性氧清除反應(yīng)中一種重要酶，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷方面發(fā)揮重要作用。SOD使植物體清除自由基的功能得以維持，從而使植物細(xì)胞免受毒害［22－24］。本研究發(fā)現(xiàn)，檉柳組培苗中POD和SOD的活性均隨NaCl脅迫濃度的增加呈先升高后降低的變化趨勢，而其葉片APX活性隨NaCl處理濃度的增加而降低，這與脅迫下氧自由基的積累有關(guān)。

植物細(xì)胞的滲透調(diào)節(jié)作用是植物適應(yīng)環(huán)境，增強(qiáng)抗逆性的基礎(chǔ)，也是植物對(duì)鹽分和水分脅迫的重要適應(yīng)手段之一。大多數(shù)作物遭受環(huán)境脅迫時(shí)在體內(nèi)積累可溶性物質(zhì)如可溶性蛋白和可溶性糖等，它們對(duì)調(diào)節(jié)滲透均具有重要的作用［25－27］。本研究表明，隨著NaCl脅迫濃度的增加，可溶性蛋白、游離脯氨酸以及可溶性糖這些滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量隨著脅迫程度增大而顯著增加，其中可溶性糖與對(duì)照相比極顯著增加，這與王聰?shù)龋?8］實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，從而表明滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)在鹽脅迫適應(yīng)過程中起著重要作用。檉柳組培苗可通過合成和積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以適應(yīng)鹽脅迫，從而更好地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的滲透勢，維持水分平衡，緩解鹽脅迫對(duì)植株造成的傷害。

細(xì)胞電導(dǎo)率與受傷害程度呈正相關(guān)，膜透性的大小反映細(xì)胞膜受損的程度，電導(dǎo)率越高說明細(xì)胞膜受到的傷害越大。而MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物，常作為判斷膜脂過氧化作用的一種主要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)：隨著NaCl濃度增加，檉柳細(xì)胞電導(dǎo)率也逐漸增大，這與劉錦川的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致［29］；同時(shí)其MDA的含量也呈緩慢上升的趨勢。MDA和電導(dǎo)率的顯著增加，表明隨著脅迫程度增強(qiáng)，植物組織中活性氧增加，膜質(zhì)過氧化作用增強(qiáng)，膜的穩(wěn)定性降低，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)大量滲漏，膜的穩(wěn)定性降低，植物體受到一定的傷害。這與李瓊等［30］對(duì)6種禾本科牧草幼苗葉片膜脂過氧化作用的研究中MDA隨鹽濃度增加呈先上升后下降的趨勢有所不同，其原因可能與不同植物對(duì)鹽脅迫的耐受機(jī)制不同有關(guān)。H2O2的積累可導(dǎo)致膜的傷害，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)的氧分子只接受一個(gè)電子時(shí)就會(huì)轉(zhuǎn)變成，本研究中H2O2含量與產(chǎn)生速率都表現(xiàn)出增加的趨勢，這與卞彥等［31］的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。鹽脅迫3d后，H2O2和大量積累，這與檉柳組培苗內(nèi)SOD和POD活性的變化密切相關(guān)。即氧化酶活性的降低，使得體內(nèi)的自由基大量積累，引起膜脂過氧化作用，從而增加了膜系統(tǒng)的破壞程度［32－33］。

綜上所述，通過對(duì)檉柳組培苗抗氧化酶、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以及MDA等生理指標(biāo)的綜合分析可知，在NaCl脅迫下，滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)可溶性蛋白、游離脯氨酸、可溶性糖含量均隨NaCl脅迫濃度的增加而在植物體內(nèi)呈明顯上升趨勢。而檉柳組培苗內(nèi)SOD和POD活性均呈先升后降的趨勢，且在100mmol／L時(shí)活性達(dá)到最大值，使NaCl脅迫下過量產(chǎn)生的H2O2和O2－·被及時(shí)清除，使細(xì)胞膜脂過氧化程度維持在較低水平，植物生長未受顯著影響?？梢?，維持活性較高且相對(duì)平衡的抗氧化酶系統(tǒng)以及較強(qiáng)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)提高檉柳抗NaCl脅迫具有重要作用。

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（編輯：裴阿衛(wèi)）

Changes in Antioxidase Activity and Osmotic Adjusting Substance of TamarixchinensisSeedlings under NaCl Stress

GUO Nannan，CHEN Xuelin＊，ZHANG Ji，CHEN Jinyuan，ZHU Yuanjun，DING Yingtong
（College of Life Science，Northwest Normal University，Lanzhou 730070，China）

To obtain tissue－cultured plant，We used Tamarix chinensis seeds as materials and established their sterile solated culture system by tissue culture method.A stress condition was formed through adding different concentrations of NaCl（0，50，80，100，120，150and 200mmol／L）to the medium（MS＋1.0mg／L 6－BA＋0.1mg／L NAA）.To explore the physiological mechanism of T.chinensis tissue－cultured plant response to NaCl－stress，We investigated the changes of activities of T.chinensis tissue－cultured plant antioxidases，contents of osmotica，plasma membrane permeability and production rate of super oxygen anion（O2－·）under different concentrations of NaCl－stress.The results indicated that：（1）The activities of superoxide dismutase（SOD）and peroxidase（POD）of T.chinensis tissue－cultured plant were rising and thengoing down as concentrations of NaCl－stress were increasing，and both at 100mmol／L NaCl－stress reached a maximum，whereas，the activity of ascorbic acid peroxidase（APX）was gradually declining.（2）The contents of osmotica such as free proline（Pro），soluble protein（Pr）and soluble sugar of tissue－cultured plant were gradually rising and significantly higher than that of the concurrent control as concentrations of NaClstress were increasing，and at 200mmol／L concentration notably increased 53.77%，47.38%and 67.65%，respectively.（3）The production rates of hydrogen peroxide（H2O2）and super oxygen anion（O－·2），content of malonic dialdehyde（MDA）and plasma membrane permeability of tissue－cultured plant were all gradually rising and significantly higher than that of the concurrent control as concentrations of NaCl－stress were increasing，and at 200mmol／L concentration notably increased 36.42%，58.71%，82.60%and 42.54%，respectively.The study confirmed that antioxidases system of T.chinensis tissue－cultured plant showed favorable active oxygen scavenging activity under a low concentration of NaCl－stress（≤100mmol／L）and the osmotica played positively regulated functions under different concentrations of NaCl－stress.Accordingly，T.chinensis showed a strong salt tolerance.

Tamarix chinensis；tissue－cultured plant；NaCl－stress；antioxidase system；osmotica

Q945.78

A

1000－4025（2015）08－1620－06

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1620

2015－03－12；修改稿收到日期：2015－06－12

國家自然科學(xué)基金（31200255）；西南突發(fā)性災(zāi)害應(yīng)急與防控技術(shù)集成與示范（2012BAD20B06）

郭楠楠（1987－），女，在讀碩士研究生，主要從事系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)研究。E－mail：guonannan2014＠163.com

＊通信作者：陳學(xué)林，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)和種子生態(tài)學(xué)研究。E－mail：chenxuelin63＠gmail.com