瀕危物種珊瑚菜遺傳多樣性的ISSR分析

王愛蘭，王貴琳，李維衛(wèi)

（1魯東大學生命科學學院，山東煙臺264025；2魯東大學學報編輯部，山東煙臺264025）

瀕危物種珊瑚菜遺傳多樣性的ISSR分析

王愛蘭1，王貴琳1，李維衛(wèi)2＊

（1魯東大學生命科學學院，山東煙臺264025；2魯東大學學報編輯部，山東煙臺264025）

該研究采用ISSR分子標記對中國10個居群的241個珊瑚菜樣本進行了遺傳多樣性分析。結果顯示：8條引物共檢測到76條清晰譜帶，其中多樣性條帶64條；POPGENE分析顯示，其物種水平多樣性條帶百分率（PPB）為84.21%，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.562 8，Shannon多樣性指數(shù)（I＊）為0.866 3，Nei’s遺傳多樣性指數(shù)（h＊）為0.342 5，居群間的遺傳分化系數(shù)（GST）為0.205，基因流（Nm）為1.939 1，表明野生珊瑚菜具有較高的遺傳多樣性，且大部分遺傳多樣性存在于居群內(nèi)；AMOVA分析顯示，珊瑚菜居群間遺傳分化水平（FST）為0.259 1，也表明珊瑚菜居群內(nèi)變異大于居群間變異。研究認為，珊瑚菜的瀕危原因主要來源于野生生態(tài)環(huán)境的破壞，應當加強種質(zhì)資源的保護。

珊瑚菜；ISSR；遺傳多樣性；基因流

珊瑚菜（Glehnia littoralis）屬于傘形科（Apiaceae）珊瑚菜屬（Glehnia）多年生二倍體（2n＝22），草本藥用植物，其繁殖方式為有性生殖，傳粉媒介以蟲媒和風媒（非自花授粉）為主［1］。珊瑚菜屬僅有珊瑚菜一個種，主要分布在2個區(qū)域：其一是東亞珊瑚菜分布區(qū)，主要分布在東亞地區(qū)的中國、韓國、朝鮮、日本等4個國家海岸線的沙灘；其二是北美珊瑚菜分布區(qū)，主要分布在美國近海沙灘。中國境內(nèi)主要分布在遼寧、山東、江蘇、浙江、臺灣、福建、廣東和海南省沿海海岸［2］。珊瑚菜主要生長在原始海灘的沙地里，特殊的沙土生境導致其根系非常發(fā)達，且根部膨大形成根狀莖，從而使其成為海岸固沙的良好經(jīng)濟品種。此外，珊瑚菜的膨大根莖被稱作北沙參，是一種傳統(tǒng)的中藥材，對免疫類疾病具有良好的療效，在中國已經(jīng)有600多年的使用歷史［3］。

由于珊瑚菜具有重要的藥用價值、種質(zhì)資源價值、經(jīng)濟及生態(tài)價值，在過去的幾十年里，野生珊瑚菜居群不僅受到來自生境退化甚至喪失的巨大壓力，也受到濫采濫挖的嚴重威脅，居群面積不斷縮小，居群數(shù)量迅速降低，對居群的繁衍和遺傳多樣性的維持造成困難，已被列為國家Ⅱ級瀕危保護物種［4］，又被稱做植物界的大熊貓。

植物遺傳多樣性評估是研究瀕危物種保護機制的重要手段。雖然珊瑚菜屬物種已瀕臨滅絕，但是其種群遺傳多樣性的相關研究卻不多見，僅見利用等位酶標記和SRAP分子標記的相關研究報道［5－7］，對其遺傳結構及其保護方面的研究還不夠深入。

簡單重復序列間多態(tài)性標記（inter－simple sequence repeat，ISSR）為顯性遺傳標記，由于其結合了RAPD和SSR的優(yōu)點，可以揭示出更多的多態(tài)性，且被證明具有較好穩(wěn)定性、可重復性、通用性和價格低廉的特點，現(xiàn)已廣泛應用于遺傳多樣性和遺傳結構、系統(tǒng)進化和遺傳資源評價等方面［8－11］。為了進一步深入研究珊瑚菜的遺傳多樣性，本研究采用ISSR分子標記對中國10個野生珊瑚菜居群的遺傳變異進行分析，揭示其遺傳多樣性水平和遺傳結構。

1 材料和方法

1.1 材 料

本研究選取中國境內(nèi)分布的10個居群，共241個珊瑚菜樣本，均為野外隨機采集的珊瑚菜幼嫩葉片，利用硅膠干燥保存，具體樣本編號與取樣地基本信息見表1。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物篩選與PCR擴增 本實驗采用改進的CTAB法［12］提取珊瑚菜基因組DNA，用1.0%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，根據(jù)條帶亮度和有無拖尾情況，粗略估計該樣品DNA提取的質(zhì)量和濃度。將檢測合格的DNA（濃度比較大的DNA用超純水稀釋至約20ng／μL），置于－20℃冰箱中備用。

根據(jù)加拿大British Columbia大學公布的引物序列［13］，從中選取了30對進行合成（北京華大基因）。在所有DNA樣本掃描之前，首先從珊瑚菜10個居群中隨機抽取少部分DNA樣品，進行引物多態(tài)性和穩(wěn)定性的前期檢測，從中篩選出穩(wěn)定性好且條帶清晰的8個引物，用于群體的擴增。PCR反應體系為15μL，其中含1.5μL 10×Taq Buffer，0.5 mmol／L dNTPs，0～1.5mmol／L Mg2＋，5μmol／L ISSR引物，1UTaq酶，約30ng模板DNA。反應程序為94℃預變性4min，94℃變性50s，50～55℃復性50s，72℃延伸75s，進行38個循環(huán)；然后72℃延伸8min。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析 按照清晰易辨、重復、穩(wěn)定的原則對擴增條帶進行統(tǒng)計，同一位置有條帶的記為“1”、沒有條帶的記為“0”，以此形成0，1二元數(shù)據(jù)矩陣。利用POPGENE1.32軟件分析計算多樣性條帶百分率（PPB）、Shannon多樣性指數(shù)（I＊）、Nei’s多樣性指數(shù)（h＊）、遺傳分化系數(shù)（GST）等［14］；利用ARLEQUIN軟件中的AMOVA功能分析居群的遺傳分化水平（FST）［15］；采用NTSYS軟件對居群進行UPGMA聚類分析；采用TFPGA進行Mantel檢測，測定地理分布范圍與遺傳距離的相關關系［16］。

2 結果與分析

2.1 珊瑚菜遺傳多樣性分析

利用8個ISSR引物對來自10個居群的241個樣品進行擴增，共得到76條清晰的譜帶（部分結果見圖1），其中多樣性條帶64條，占總擴增條帶的84.21%（表2）。通過POPGENE軟件分析，得到不同分布區(qū)珊瑚菜居群的平均遺傳多樣性水平，PPB為84.21%，Ne為1.562 8，I＊為0.866 3，h＊為0.342 5。根據(jù)I＊、h＊以及有效等位基因數(shù)，可知珊瑚菜10個自然居群的遺傳多樣性大小依次為：山東海陽＞山東日照＞遼寧長海Ⅱ＞遼寧瓦房店＞河北秦皇島＞遼寧長海I＞浙江舟山＞遼寧興城＞遼寧莊河＞遼寧鲅魚圈。其中，山東海陽（SDHY）居群的遺傳多樣性水平最高（Ne＝1.444 1，I＊＝0.882 5，h＊＝0.279 5）；遼寧鲅魚圈（LNBYQ）居群的遺傳多樣性水平最低（Ne＝1.260 7，I＊＝0.373 4，h＊＝0.154 2）。

2.2 珊瑚菜居群間遺傳變異分析

AMOVA分析顯示，珊瑚菜各居群間遺傳分化不明顯，居群間遺傳分化水平（FST）為0.259 1，即居群內(nèi)的遺傳分化水平為0.740 9，表明居群內(nèi)遺傳變異高于居群間的遺傳變異，且變異達到極顯著水平（P＜0.001）。POPGENE分析結果表明，居群間平均遺傳分化系數(shù)（GST）為0.205 0，表明79.5%的基因變異存在于居群內(nèi)。由此可見，AMOVA和POPGENE的分析結果是一致的。居群間基因流水平（Nm）為1.939 1，大于1，表明居群間有一定的基因交流。

2.3 珊瑚菜居群間的遺傳距離及遺傳一致度分析

根據(jù)POPGENE計算的Nei＇s［17］無偏離遺傳一致度和遺傳距離結果（表3）可知，珊瑚菜10個居群間的遺傳距離介于0.032 5～0.242之間，山東海陽（SDHY）居群與遼寧鲅魚圈（LNBYQ）居群的遺傳距離最大，為0.242；遼寧長海I（LNCHI）居群與遼寧瓦房店（LNWFD）居群遺傳距離最小，為0.032 5。10個居群的遺傳一致度介于0.785 1～0.968 0之間，遼寧瓦房店（LNWFD）居群與遼寧長海I（LNCHI）居群之間的遺傳一致度最大，為0.968 0，說明這2個居群的遺傳分化最小。遼寧鲅魚圈（LNBYQ）居群與山東海陽（SDHY）居群的遺傳一致度最小，為0.7851，說明這2個居群的遺傳分化相對來說最高?？傮w來說，10個居群的遺傳一致度都在0.78以上，說明所有居群之間的遺傳分化整體比較低，這也印證了本研究2.2所分析的遺傳變異主要存在于居群內(nèi)而非居群間。利用Mantel檢測分析了珊瑚菜10個居群遺傳距離與地理距離的相關性，結果表明居群間遺傳距離與地理距離不存在顯著的相關性（r＝－0.133 6，P＞0.05）。

2.4 聚類分析

UPGMA聚類分析結果（圖2）表明，珊瑚菜居群主要分為兩大分支，其中山東海陽、河北秦皇島、遼寧長海Ⅱ，遼寧長海I、遼寧瓦房店、遼寧莊河、遼寧興城聚為一支，該支又細分為2個小分支：山東海陽、河北秦皇島、遼寧長海Ⅱ為一個小分支，遼寧長海I、遼寧瓦房店、遼寧莊河、遼寧興城為一個小分支；遼寧鲅魚圈、浙江舟山、山東日照聚為一支。總體來看，居群間的親緣關系與地理分布并不完全一致，地理距離相對更遠的居群間（如浙江舟山和遼寧莊河）有著較遠的親緣關系，同時也發(fā)現(xiàn)，分布在遼寧的5個珊瑚菜居群，聚在不同的分支，沒有表現(xiàn)出更近的親緣關系。

3 討 論

本研究首次采用ISSR分子標記法，針對國內(nèi)采集的10個珊瑚菜野生居群進行了遺傳多樣性分析，結果表明，所選取的8對引物所產(chǎn)生的條帶數(shù)量多、相對穩(wěn)定、圖像清晰、多態(tài)性高（都在70%以上），說明ISSR分子標記對研究珊瑚菜的遺傳多樣性是可行的。

3.1 珊瑚菜遺傳多樣性水平

居群是進化的基本單元，而遺傳多樣性是居群生存和進化的基礎，它受多種因素影響，包括繁殖體系、生物學特性、生態(tài)環(huán)境因素、人類活動、演化史、種子散播機制等等［18－19］，物種的遺傳多樣性越高，其環(huán)境適應能力就越強，這一點對于瀕危物種尤為重要［20］。本研究采用的8對引物共得到76條清晰的譜帶，其中多樣性條帶64條，多樣性條帶百分率為84.21%，居群水平Shannon多樣性指數(shù)為0.866 3，Nei’s多樣性指數(shù)為0.342 5，這些數(shù)據(jù)都說明了珊瑚菜野生居群具有較高的遺傳多樣性。造成遺傳多樣性高的原因可能與珊瑚菜的繁育系統(tǒng)、生境分布有一定關系，珊瑚菜屬于異交授粉的植株，其生境被海洋和陸地間隔成塊狀分布，使其個體在較小的分布區(qū)域進行雜交授粉，從而導致居群內(nèi)個體間基因交流頻繁，形成了較高的物種多樣性。

3.2 影響珊瑚菜遺傳結構的主要因素

遺傳結構是指遺傳多樣性在居群內(nèi)和居群間的分布，是一個物種最基本的特征之一，受生境片斷化、居群分離、繁育系統(tǒng)、基因流等多因素的影響，本研究結果驗證了這一說法。POPGENE分析結果表明，珊瑚菜居群平均遺傳分化系數(shù)為0.205 0，表明79.5%基因變異存在于居群內(nèi)；AMOVA分析顯示，珊瑚菜居群間遺傳分化水平為0.259 1，居群內(nèi)的遺傳分化水平為0.740 9；兩組數(shù)據(jù)結果一致，均表明居群內(nèi)遺傳變異高于居群間的遺傳變異。這可能與其復雜的繁育系統(tǒng)和片段化生境有關。珊瑚菜屬于多年生草本植物，其生殖方式是有性生殖，主要傳粉方式是蟲媒和風媒，傳粉昆蟲為熊蜂［6］；其種子傳播途徑主要是風和水，繁殖體系較復雜；其地理分布主要是不連續(xù)的島嶼，及被海洋隔離的陸地沙灘，花粉和種子的傳播范圍受到一定限制，由此，其居群內(nèi)的基因交流較高，遺傳變異水平較高；居群間的基因交流較低，也就具有較低的遺傳分化水平。

影響居群遺傳結構的因素除繁育系統(tǒng)外，基因流也是一個重要因素。在群體遺傳學理論中，以基因流的臨界點為判別標準，不管居群大小，只要基因流大于或等于1時，就可以防止由遺傳漂變引起的居群間遺傳分化［21］。本研究中，珊瑚菜的基因流為1.939 1，說明珊瑚菜居群間有一定的基因交流，足以抵消遺傳漂變帶來的影響，也說明珊瑚菜居群具有較強的適應能力。

3.3 遺傳結構與地理分布的關系

UPGMA聚類分析顯示所有10個居群分為兩個大支，其中一支由浙江舟山、山東日照和遼寧鲅魚圈分布的居群組成，浙江舟山和山東日照的居群顯示有較近的遺傳關系，這與宋春鳳等［7］的研究結果基本一致；遼寧鲅魚圈居群沒有歸入遼寧其它居群的可能原因是，該處已開發(fā)為旅游海灘，原始生境遭到嚴重破壞，分布材料瀕臨絕跡，僅在此分布區(qū)發(fā)現(xiàn)5株樣品，全部采集參與分析，由于樣品較少，可能導致檢測結果有所偏離；另外一個大支，由山東海陽、河北秦皇島分布的居群和遼寧地區(qū)分布的5個居群組成，這7個居群又聚成2個小支，其中山東海陽、河北秦皇島居群和遼寧長海分布的一個居群聚在一起，顯示較近的遺傳關系，而剩余4個遼寧地區(qū)分布的居群單獨聚為一個小支。從聚類分析結果來看，居群間的親緣關系與地理分布并不完全一致，既表現(xiàn)在地理距離相距較遠的居群有更遠的親緣關系（如浙江舟山和遼寧莊河等居群），又被發(fā)現(xiàn)同一分布區(qū)的珊瑚菜居群聚在不同的分支（如遼寧分布的5個居群），如果排除采樣問題的偏差，可以推測長距離范圍內(nèi)珊瑚菜可能會受生境片斷化的效應影響，受到生境選擇的壓力，距離越遠遺傳差異越大，而小范圍內(nèi)珊瑚菜的遺傳變異與地理分布則沒有呈現(xiàn)明顯的相關性，即在一定空間尺度內(nèi)珊瑚菜居群間的遺傳距離與地理距離關系不大，表明差異不大的地理距離在珊瑚菜的遺傳分化中可能并非是主導因素，其遺傳分化的因素可能主要與珊瑚菜的繁育系統(tǒng)有關。本研究利用Mantel檢測的結果也說明地域分布與遺傳距離不存在顯著的相關性，如需深入探討該問題，增加取材范圍和更多的分子標記分析是必要的。

3.4 保護珊瑚菜居群的措施

瀕危物種保護主要目標就是維持物種的遺傳多樣性水平。本研究表明，珊瑚菜自身具有較強的適應能力和遺傳多樣性水平，其瀕臨滅絕的原因除了其特殊的狹域生境［22］外，還應主要歸咎于外界其他因素，例如人類的過度采挖和海岸帶過度開發(fā)等對生境造成的毀滅性的破壞。珊瑚菜種質(zhì)資源的保護是非常必要也是非常有意義的，應從以下幾方面著手：1）加強原始生境的保護；2）嚴禁野生珊瑚菜品種的采挖；3）考慮到珊瑚菜的居群內(nèi)具有較高的遺傳多樣性水平，選擇較大的居群進行就地或異地建立種質(zhì)資源庫也是保護該物種的一個重要舉措。

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（編輯：宋亞珍）

Genetic Diversity of Glehnia littoralis Populations Revealed by ISSR Molecular Markers

WANG Ailan1，WANG Guilin1，LI Weiwei2＊
（1School of Life and Sciences，Ludong University，Yantai，Shandong 264025，China；2Ludong University Journal，Ludong University，Yantai，Shandong 264025，China）

In order to formulate conservation strategies of this species，We assessed the genetic diversity of G.littoralis with total 241samples of 10populations using molecular marker ISSR analysis.The result revealed that high levels of genetic variations occurred within and among populations（PPB＝84.21%，Ne＝1.562 8，I＊＝0.866 3，h＊＝0.342 5）.The genetic differentiation coefficient（GST）among populations was 0.205.Analysis of molecular variance（AMOVA）demonstrated that 25.91%of genetic diversity was found among populations，74.09%of genetic diversity was found within populations.The value of gene flow（Nm）was 1.939 1.It is indicated that the endangered status of this species is probably due to destruction of habitats of the wild populations，rather than a loss of the genetic diversity.

Glehnia littoralis；ISSR；genetic diversity；gene flow

Q789；Q949.763.3

A

1000－4025（2015）08－1541－06

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1541

2015－03－04；修改稿收到日期：2015－06－04

山東省自然科學基金（ZR2010CM056）

王愛蘭（1978－），女，博士，講師，主要從事分子生態(tài)學方面的研究。E－mail：alww05＠126.com

＊通信作者：李維衛(wèi)，碩士，講師，主要從事植物學方面的研究。E－mail：lwwal＠163.com