‘碭山酥梨’及其褐皮芽變果皮中多胺類物質(zhì)含量和相關(guān)基因表達(dá)分析

孫虹麗，王子騰，蔣向紅，賈 兵，劉 莉，葉振風(fēng)，衡 偉，朱立武

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，合肥230036）

‘碭山酥梨’及其褐皮芽變果皮中多胺類物質(zhì)含量和相關(guān)基因表達(dá)分析

孫虹麗，王子騰，蔣向紅，賈 兵，劉 莉，葉振風(fēng)，衡 偉，朱立武＊

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，合肥230036）

為研究多胺類物質(zhì)在‘碭山酥梨’芽變品系‘銹酥’果皮褐色形成中的作用，以‘碭山酥梨’和‘銹酥’花后不同時(shí)期果皮為試材，采用HPLC方法測(cè)定果皮中多胺類物質(zhì)的含量，利用RACE技術(shù)克隆多胺合成過(guò)程中的關(guān)鍵基因，通過(guò)Protparam網(wǎng)站與MEGA5.0軟件分析相關(guān)基因蛋白的理化性質(zhì)及其系統(tǒng)進(jìn)化，用熒光定量qRT－PCR方法分析不同時(shí)期果皮中相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果表明：（1）除花后50和150d外，其它時(shí)期‘碭山酥梨’果皮中腐胺含量均顯著高于‘銹酥’，花后50d、75d、150d時(shí)，‘銹酥’果皮中的亞精胺、精胺含量顯著高于‘碭山酥梨’果皮。（2）克隆出多胺合成的基因ADC、SPDS和SPMS（GenBank登錄號(hào)分別為KM923903、KM923905和KM923906），預(yù)測(cè)ADC和SPMS均為水溶性蛋白、SPDS為疏水性蛋白，它們與蘋(píng)果的親緣關(guān)系最近。（3）熒光定量PCR結(jié)果顯示，花后50d，多胺合成中ADC、SPDS和SPMS在‘銹酥’果皮中表達(dá)量均顯著高于‘碭山酥梨’。研究推測(cè)，‘銹酥’果皮中多胺代謝及相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)可能與‘銹酥’的果皮褐色形成有關(guān)。

梨；褐皮芽變；多胺；基因克?。粚?shí)時(shí)熒光定量

梨屬植物（Pyrus spp.）種質(zhì)資源按果皮顏色分為綠皮梨（包括綠色、黃色、綠黃色、黃綠色）、褐皮梨（包括綠褐色、黃褐色、紅褐色、褐色等）和紅皮梨（包括部分著色、全面著色）3種類型［1］?！P酥’為‘碭山酥梨’的芽變品系，二者果皮顏色存在明顯差異，成熟的‘碭山酥梨’的果皮呈現(xiàn)黃色，而‘銹酥’果皮呈現(xiàn)褐色。有研究表明，梨果皮褐色是由于梨果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，果皮角質(zhì)層和表皮細(xì)胞破損后形成的木栓積累而造成的［2］，因此推測(cè)梨果皮褐色性狀變異與果皮木栓成分的合成調(diào)控有關(guān)。李洪缽等［3］的研究發(fā)現(xiàn)，金冠蘋(píng)果最初的角質(zhì)層發(fā)生龜裂，會(huì)深達(dá)表皮下的第一層果肉細(xì)胞，而形成褐色的木栓組織，逐漸連片成為銹斑。林真二［4］認(rèn)為，果銹形成的直接原因是由于角質(zhì)膜的缺失從而導(dǎo)致木栓形成層的發(fā)生。吳厚玖［5］認(rèn)為落花后25d之內(nèi)是果銹發(fā)生的關(guān)鍵期。落花后是細(xì)胞分裂和幼果快速增長(zhǎng)時(shí)期，表皮和下表皮細(xì)胞最易受到外界的不良刺激而產(chǎn)生果銹。褐色果皮有助于果實(shí)抵抗病蟲(chóng)害和惡劣天氣，更耐貯運(yùn)［6－7］。

多胺（Polyamines，PAs）是存在于原核生物及真核生物中的具有強(qiáng)生物活性的低分子脂肪族含氮堿，是近年來(lái)研究較多的一類植物生長(zhǎng)發(fā)育調(diào)節(jié)物質(zhì)。現(xiàn)已在植物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的多胺類物質(zhì)就有數(shù)十種之多，其中以腐胺（putrescine，Put）、亞精胺（spermidine，Spd）、精胺（spermine，Spm）、尸胺（cadaverine，Cad）及鯡精胺（agmatine，Agm）較為普遍［8］。在多胺的合成代謝中，精氨酸先脫去一分子脲生成鳥(niǎo)氨酸，再由鳥(niǎo)氨酸脫羧酶（ornithine decarboxylase，ODC）催化脫羧，生成Put。在植物和某些微生物體內(nèi)，精氨酸被精氨酸脫羧酶（arginine decarboxylase，ADC）催化脫羧，生成鯡精胺，再經(jīng)兩步酶促反應(yīng)，脫去一分子氨，由N－氨甲酰腐胺而生成Put。Put在亞精胺合成酶（spermidine synthase，SPDS）的催化下生成Spd，Spd一方面經(jīng)精胺合成酶（spermine synthase，SPMS）催化生成Spm，另一方面經(jīng)熱精胺合成酶（thermospermine synthase，ACL5）催化生成熱精胺［9］。反應(yīng)過(guò)程中的氨丙基由S－腺苷蛋氨酸脫羧酶（S－adenosylmethionine decarboxylase，SAMDC）催化S－腺苷蛋氨酸（S－adenosyl－L－methionine，SAM）脫羧產(chǎn)生的脫羧S－腺苷蛋氨酸（decarboxylated S－adenosyl－L－methionine，dcSAM）提供。而S－腺苷蛋氨酸的合成酶（S－adenosyl－L－methionine synthase）是S－腺苷甲硫氨酸合成酶催化甲硫氨酸與ATP生物合成的。它是影響Spd和Spm的一個(gè)限速酶［10］，在多胺的分解代謝中主要是通過(guò)二胺氧化酶（Diamine oxidases，DAO）和胺氧化酶（Polyamine oxidases，PAO）的氧化作用實(shí)現(xiàn)的，亞精胺和精胺可在PAO和DAO的催化下產(chǎn)生H2O2［11］。果實(shí)發(fā)育是高等植物最重要的生命活動(dòng)之一，多胺在植物細(xì)胞內(nèi)參與細(xì)胞分裂、胚胎發(fā)生、生根、開(kāi)花、種子萌發(fā)、花粉管伸長(zhǎng)、果實(shí)形成及成熟、休眠等生理過(guò)程［12］；能穩(wěn)定DNA、RNA結(jié)構(gòu)，加快轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成，與膜上陰離子基團(tuán)結(jié)合，起穩(wěn)定膜的作用［13］。目前，有關(guān)梨樹(shù)多胺物質(zhì)代謝研究較少，涉及梨樹(shù)多胺物質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)以‘碭山酥梨’和‘銹酥’不同時(shí)期果皮為材料，測(cè)定了不同時(shí)期果皮中Put、Spd、Spm的含量，克隆了多胺合成過(guò)程中相關(guān)基因ADC、SPDS和SPMS，并分析其在不同時(shí)期果皮中表達(dá)差異，為研究多胺在芽變‘銹酥’果皮褐色形成中的作用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材 料

樣品采集于安徽省碭山縣園藝場(chǎng)第二分場(chǎng)，植株50年生。2013年花后25、50、75、100、125和150 d，在‘碭山酥梨’和‘銹酥’樹(shù)冠的東、南、西、北、中部各隨機(jī)摘取2個(gè)果實(shí)，每個(gè)樣品共10個(gè)果實(shí)，重復(fù)3次，0～4℃冷藏保存帶回實(shí)驗(yàn)室。分別切取厚度約為0.5mm外果皮，液氮速凍處理，混合均勻后保存于－80℃冰箱中備用。

1.2 方法

1.2.1 多胺含量的測(cè)定 取梨果皮鮮重0.5g，液氮研磨加入2.5mL預(yù)冷的5%高氯酸在冰浴中研磨成勻漿，冰浴浸提1h，于4℃下10 000r／min離心30 min，取500μL上清液加入7μL苯甲酰氯和1mL 2 mol／L NaOH溶液，低速渦旋20s，37℃恒溫水浴鍋中避光保溫25min，然后加入2mL飽和NaCl和2 mL冷乙醚，渦旋20s，4℃下10 000r／min離心5 min，取1.5mL醚相于2mL塑料離心管中，放入烘箱中37℃下避光干燥，若仍有苯甲酰氯味道，再加入250μL冷乙醚吹干，殘余物置于－20℃下低溫保存?zhèn)溆谩ＩV柱為ZORBAX SB－C18柱（Agilent 5μm，4.6mm×150mm），柱溫為25℃，流動(dòng)相為甲醇∶水＝75∶25，流速為0.4mL／min。待測(cè)樣品用100μL 70%甲醇（V／V）溶解，用微孔濾膜過(guò)濾（有機(jī)系，孔徑為0.45μm），過(guò)濾后上機(jī)測(cè)定，進(jìn)樣量為20μL，用外標(biāo)法定量計(jì)算，將標(biāo)準(zhǔn)品Put、Spd和Spm經(jīng)過(guò)苯甲?；笥?00μL 60%甲醇配成一系列濃度，每次進(jìn)樣20μL，用峰面積對(duì)進(jìn)樣量做曲線，計(jì)算曲線方程和相關(guān)系數(shù)。

1.2.2 多胺合成中相關(guān)基因的克隆 取花后150d果實(shí)的果皮進(jìn)行總RNA提取，采用（StarSpin Plant RNA Mini Kit）RNA提取試劑盒提取，合成引物3′－CDS，采用Promega公司的反轉(zhuǎn)錄酶（M－MLV Reverse Transcriptase）合成cDNA，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

根據(jù)‘碭山酥梨’和‘銹酥’抑制消減文庫(kù)中得到的ADC、SPDS、SPMS3個(gè)差異表達(dá)基因部分核苷酸序列設(shè)計(jì)引物，利用基因特異性引物ADC－5F／ADC－5R、SPDS－5F／SPDS－5R和SPMS－F／SPMSR，以果皮cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析、回收，連接到pGEM－T載體，將含有目標(biāo)片段的陽(yáng)性單克隆送至深圳華大有限公司分別測(cè)序，得到ADC、SPDS這2個(gè)基因的5′端序列及SPMS的全長(zhǎng)序列。設(shè)計(jì)3′－RACE引物ADC－3F1和ADC－3F2，SPDS－3F1和SPDS－3F2，分別和UPM long、NUP進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，克隆出ADC、SPDS這2個(gè)基因的3′端序列。根據(jù)5′端和3′端的重疊序列利用DNAMAN軟件進(jìn)行拼接，最后獲得3個(gè)基因的全長(zhǎng)序列。本試驗(yàn)所用引物見(jiàn)表1。

1.2.3 基因蛋白理化性質(zhì)與系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用Protparam網(wǎng)站（http：／／web.expasy.org／prot－param／），預(yù)測(cè)ADC、SPDS和SPMS這3個(gè)基因編碼蛋白的理化性質(zhì)。采用MEGA5.0軟件，對(duì)預(yù)測(cè)的ADC、SPDS、SPMS這3個(gè)基因氨基酸和NCBI已經(jīng)登錄相關(guān)基因的氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。

1.2.4 多胺合成中相關(guān)基因的表達(dá)分析 分別以‘碭山酥梨’和‘銹酥’花后25、50、75、100、125和150d果皮總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，根據(jù)獲得的ADC、SPDS、SPMS基因的3′端序列，使用Primer premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物YgADC－F和YgADC－R，YgSPDS－F和YgSPDS－R，YgSPMS－F和YgSPMS－R，以梨Actin基因?yàn)閮?nèi)參，引物為Actin－F和Actin－R，3次重復(fù)。使用STEPONE熒光定量PCR儀進(jìn)行定量分析，試劑采用TaKaRa公司的SYBR?Premix Ex TaqTMII，操作按照試劑說(shuō)明進(jìn)行，采用2－△△CT公式計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。本試驗(yàn)中所用引物見(jiàn)表2。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘碭山酥梨’與‘銹酥’果皮中3種多胺類物質(zhì)含量

在花后50d‘碭山酥梨’和‘銹酥’果皮外觀無(wú)明顯差異，花后100d兩者果皮色澤開(kāi)始呈現(xiàn)差別；花后150d兩者果皮外觀差異顯著（圖1），此時(shí)‘銹酥’不僅果皮褐變加深，果實(shí)可溶性糖、可滴定酸含量也顯著增高。不同時(shí)期果皮中Put含量測(cè)定結(jié)果顯示，在花后各個(gè)時(shí)期，‘碭山酥梨’和‘銹酥’中Put含量差異均達(dá)到顯著水平。除花后50和150d外，其它時(shí)期‘碭山酥梨’果皮中Put含量均顯著高于‘銹酥’（圖2，A）。說(shuō)明果皮中Put提前出現(xiàn)較高的含量，加速了細(xì)胞的生理代謝，促進(jìn)了果皮褐色的形成，增加了果實(shí)中可溶性糖、可滴定酸的積累。

Spd含量在花后不同時(shí)期，‘碭山酥梨’和‘銹酥’中含量差異均達(dá)到顯著水平。在‘碭山酥梨’中呈現(xiàn)先降低、再升高、再降低的趨勢(shì)，在‘銹酥’中呈現(xiàn)先升高、后降低、再升高的趨勢(shì)。這些可能與前期Put含量的積累有關(guān)，在花后50、75和150d，‘銹酥’中的Spd含量要明顯高于其在‘碭山酥梨’中的含量，其他時(shí)期均是‘碭山酥梨’中的含量高于‘銹酥’中的含量。在‘碭山酥梨’花后100dSpd含量達(dá)到最大值，‘銹酥’中在花后75d達(dá)到最大值，過(guò)高的Spd將有助于后續(xù)Spm的形成（圖2，B）。

不同時(shí)期中的‘碭山酥梨’中的Spm含量呈現(xiàn)先降低、后升高、再降低的趨勢(shì)，而在‘銹酥’中呈現(xiàn)先升高、后降低、再升高的趨勢(shì)。在花后50、75和150d，‘銹酥’中的Spd含量要明顯高于其在‘碭山酥梨’中的含量，其他時(shí)期均是‘碭山酥梨’中的含量高于‘銹酥’中的含量?！P酥’在花后75dSpm含量達(dá)到最大值，‘碭山酥梨’在花后100dSpm含量達(dá)到最大值。除了花后25d，其他時(shí)期Spm在‘碭山酥梨’和‘銹酥’中的含量差異均達(dá)顯著水平，Spd和Spm的變化趨勢(shì)較相似。在花后50d時(shí)，‘銹酥’果皮中Put、Spd、Spm含量都要高于‘銹酥’果皮中的含量，這種趨勢(shì)在Spd和Spm中一直持續(xù)到花后75d，可見(jiàn)花后50～100d是‘碭山酥梨’和‘銹酥’產(chǎn)生差異的關(guān)鍵時(shí)期（圖2，C）。

根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)‘碭山酥梨’和‘銹酥’不同時(shí)期果皮木質(zhì)素含量的測(cè)定數(shù)據(jù)資料［14］分析，不同時(shí)期果皮中多胺的含量與木質(zhì)素增量呈正相關(guān)，但相關(guān)關(guān)系均未達(dá)到顯著水平。說(shuō)明果皮中木質(zhì)素積累與多胺的含量變化并不同步。

2.2 多胺合成中相關(guān)基因的克隆

ADC基因5’端（圖3，A）和3’端（圖3，B）經(jīng)過(guò)拼接，得到全長(zhǎng)cDNA序列2 193bp，編碼527個(gè)氨基酸，登錄號(hào)為KM923903；SPDS基因5’端（圖3，C）和3’端（圖3，D）經(jīng)過(guò)拼接后得全長(zhǎng)cDNA序列909bp，編碼221個(gè)氨基酸，登錄號(hào)為KM923905；SPMS基因全長(zhǎng)cDNA序列1 110bp（圖3，E），編碼242個(gè)氨基酸，登錄號(hào)為KM923906。

2.3 多胺合成中ADC、SPDS和SPMS基因蛋白理化性質(zhì)分析

用Protparam預(yù)測(cè)ADC、SPDS和SPMS基因編碼蛋白的理化性質(zhì)，推測(cè)該3個(gè)蛋白的分子式分別為S14和C1600H2831N483O533S21，相對(duì)分子質(zhì)量分別為78 436.9、33 113.9和40 439.4，等電點(diǎn)分別為5.23、4.87和5.98。總帶負(fù)電荷的殘基（Asp＋Glu）分別為87、41和46，總帶正電荷的殘基（Arg＋Lys）分別為58、27和39。親水性平均數(shù)分別為－0.047、0.016和－0.141，預(yù)測(cè)ADC和SPMS這2個(gè)蛋白均為水溶性蛋白，SPDS為疏水性蛋白。

利用MEGA5.0軟件Neighbor－Joining方法，將ADC、SPDS和SPMS這3個(gè)基因的預(yù)測(cè)蛋白，與GenBank中已經(jīng)登錄的不同物種相關(guān)基因蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析（圖4）。ADC基因預(yù)測(cè)蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析中，選擇了蘋(píng)果、梅、川桑、葡萄、毛白楊、野茶樹(shù)、枳、可可、棉花、蕃茄等，發(fā)現(xiàn)ADC基因的預(yù)測(cè)蛋白與蘋(píng)果的親緣關(guān)系最近（圖4，A）；SPDS基因預(yù)測(cè)蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析中，選擇了蘋(píng)果、梅香瓜、川桑、葡萄、黃瓜、毛白楊、野茶樹(shù)、可可、蓖麻等，發(fā)現(xiàn)SPDS基因的預(yù)測(cè)蛋白與蘋(píng)果的親緣關(guān)系最近（圖4，B）；SPMS基因預(yù)測(cè)蛋白的進(jìn)化樹(shù)分析中，選擇了蘋(píng)果、梅、葡萄、川桑、黃瓜、香瓜、格蘭桉、大豆、擬南芥、甘薯等，發(fā)現(xiàn)SPMS基因的預(yù)測(cè)蛋白與蘋(píng)果的親緣關(guān)系最近（圖4，C）。

2.4 多胺合成中ADC、SPDS和SPMS基因的表達(dá)分析

花后25和50d時(shí)，‘銹酥’果皮中ADC基因的表達(dá)量均顯著高于‘碭山酥梨’；花后50d‘銹酥’果皮中ADC基因的表達(dá)量達(dá)到高峰，而‘碭山酥梨’在花后75d達(dá)到最大值（圖5，A）。幼果發(fā)育前期‘銹酥’果皮中ADC基因的上調(diào)表達(dá)、‘銹酥’果皮中ADC基因表達(dá)量高峰期的提早出現(xiàn)，與其果皮中Put提前出現(xiàn)較高的含量相吻合。

在花75d時(shí)，SPDS基因在‘碭山酥梨’中的表達(dá)量最高，而在‘銹酥’花后50d時(shí)表達(dá)量最高。在花后25、50、75和100d時(shí)，SPDS在‘銹酥’中的表達(dá)量均高于在‘碭山酥梨’中的表達(dá)量，這與Spd含量在花后75d達(dá)到最大值相吻合，SPDS基因在‘碭山酥梨’和‘銹酥’中的表達(dá)趨勢(shì)，與Spd含量在‘碭山酥梨’和‘銹酥’中的變化趨勢(shì)一致。在花后50和75d時(shí)，SPDS在‘碭山酥梨’與在‘銹酥’中的表達(dá)量存在顯著差異（圖5，B）。

SPMS基因在‘碭山酥梨’果皮中的表達(dá)量呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢(shì)，總體變化差異性不大，在‘銹酥’中呈現(xiàn)先升高、后降低的趨勢(shì)，在花后50d時(shí)，SPMS在‘銹酥’中的表達(dá)量最高，這與Spm含量的變化趨勢(shì)一致，說(shuō)明SPMS基因在控制Spm合成的過(guò)程中起著正調(diào)控作用。在花后25、50、75和125d時(shí)，SPMS在‘銹酥’中的表達(dá)量均高于在‘碭山酥梨’中的表達(dá)量。在花后25和50d時(shí)，SPMS在‘碭山酥梨’與在‘銹酥’中的表達(dá)量存在顯著性差異（圖5，C）。

對(duì)ADC、SPDS、SPMS基因的表達(dá)量與Put、Spd、Spm含量作相關(guān)性分析，結(jié)果顯示，各基因表達(dá)量與相關(guān)的多胺含量存在正相關(guān)關(guān)系，但相關(guān)性未達(dá)到顯著水平。由此可見(jiàn)，基因表達(dá)量的上調(diào)下調(diào)，與其調(diào)控的代謝產(chǎn)物的增加或減少，尚存在較復(fù)雜的關(guān)系。

3 討 論

從多胺代謝途徑可知，多胺在分解代謝中產(chǎn)生H2O2，H2O2參與木質(zhì)素的合成過(guò)程，細(xì)胞壁中H2O2會(huì)參與多種與胞壁相關(guān)的生理過(guò)程，如細(xì)胞程序性死亡、胞壁木質(zhì)素的合成和硬化、細(xì)胞防御性反應(yīng)等［15－17］。衡偉等［18］研究發(fā)現(xiàn)，花后50和75d，‘銹酥’果皮中的H2O2含量要高于‘碭山酥梨’中的含量。李曉峰等關(guān)于‘碭山酥梨’和‘銹酥’研究結(jié)果顯示，花后75～125d，是‘銹酥’果皮褐色產(chǎn)生的關(guān)鍵時(shí)期，其木質(zhì)素增量要明顯高于‘碭山酥梨’，這可能是導(dǎo)致‘銹酥’果皮褐色產(chǎn)生的原因之一［14］。在衡偉等的研究中，‘碭山酥梨’芽變品系‘銹酥’果皮木質(zhì)素含量的增加、細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化、表皮細(xì)胞層木栓程度高，是導(dǎo)致銹酥果皮發(fā)生褐變的主要原因［19］。

本研究發(fā)現(xiàn)，在果實(shí)發(fā)育初期，Put在‘碭山酥梨’及‘銹酥’中的含量都較高，但隨后的時(shí)期中又達(dá)到一個(gè)小高峰，但在花后50d時(shí)‘銹酥’果皮中Put含量要明顯高于‘碭山酥梨’，而根據(jù)多胺在植物中的合成途徑可知，在大部分的生物體內(nèi)，多胺的合成始于Put合成，它是Spd合成過(guò)程中的直接底物，它含量的高低會(huì)直接影響后續(xù)Spd和Spm含量［20］。在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中，坐果期細(xì)胞分裂旺盛，Put含量會(huì)比較高，‘銹酥’中較高Put含量的積累可能更有利于后期果皮中多胺合成。而在花后75d時(shí)，Spd和Spm在‘銹酥’果皮中的含量比在‘碭山酥梨’中的高。過(guò)高的Spd和Spm可能對(duì)多胺降解產(chǎn)生影響，從而影響H2O2含量。在花后25、50和75d，ADC、SPDS、SPMS在‘銹酥’果皮中的表達(dá)量要高于‘碭山酥梨’，在花后50d表達(dá)量達(dá)到最高，這與前面測(cè)定的多胺含量在花后50d時(shí)，‘銹酥’果皮中的多胺含量要高于‘碭山酥梨’的結(jié)果相一致，由此可見(jiàn)，在花后50～100d多胺的變化，可能在果皮褐色形成過(guò)程中起了關(guān)鍵作用。

在‘碭山酥梨’與‘銹酥’外觀表現(xiàn)差異的各個(gè)時(shí)期，兩者果皮中的多胺含量、相關(guān)基因的表達(dá)也存在差異。因此推測(cè)，這些差異可能會(huì)對(duì)后續(xù)多胺分解中H2O2的含量產(chǎn)生影響，繼而影響木質(zhì)素含量，最后影響到‘銹酥’的果皮顏色形成產(chǎn)生。關(guān)于不同時(shí)期‘碭山酥梨’和‘銹酥’果皮中H2O2含量，與木質(zhì)素含量的關(guān)系，正在進(jìn)一步的試驗(yàn)研究之中。

［1］ CAO Y F（曹玉芬）.Red pear germplasm resources in China［J］.China Seed Industry（中國(guó)種業(yè)），2001，（1）：26－27（in Chinese）.

［2］ TENG Y W（滕元文），SHEN Y Y（沈玉英），ZHOU X ZH（周先章）.Induced factor of russet on exocarp in sand pear and its strategy of solution［J］.China Southern Fruit Trees（中國(guó)南方果樹(shù)），2005，34（3）：52－56（in Chinese）.

［3］ LI H B（李洪缽），QU B X（曲寶香），WEN R CH（溫汝臣）.The investigation of prevention of the Goldcn Delicious’s rust［J］.Deciduous Fruits（落葉果樹(shù)），1981，（1）：42－46（in Chinese）.

［4］ 林真二.梨［M］.吳耕民譯.北京：農(nóng)業(yè)出版社，1981.

［5］ WU H J（吳厚玖），CHEN R ZH（陳榮柱），LI Y N（李育農(nóng)）.Studies on the data of occurrence and histological development of russetingin Golden Delicousapples［J］.Acta Horticulturae Sinica（園藝學(xué)報(bào)），1984，11（1）：51－54（in Chinese）.

［6］ INOUE E，KASUMI M，SAKUMA F.Identification of RAPD marker linked to fruit skin color in Japanese pear（Pyrus pyrifolia Nakai）［J］.Scientia Horticulturae，2006，107（3）：254－258.

［7］ LIU J F（劉劍鋒），LI G H（李國(guó)懷），PENG SH A（彭抒昂）.Pericarp structure and storage quality of Pyrus ussuriensis fruits［J］.Acta Horticulturae Sinica（園藝學(xué)報(bào)），2007，34（4）：1 007－1 010（in Chinese）.

［8］ LIU Y CH（劉彥超），ZUO ZH W（左仲武），HU J J（胡景江）.Effects of exogenous polyamines on growth and drought resistance of apple seedlings［J］.Journal of Northwest Forestry University（西北林學(xué)院學(xué)報(bào)），2010，25（1）：39－42（in Chinese）.

［9］ LIU Y（劉 穎），WANG Y（王 瑩），LONG C（龍 萃），et al.Metabolic pathway of polyamines in plants：a review［J］.Chinese Journal of Biotechnology（生物工程學(xué)報(bào)），2011，27（2）：147－155（in Chinese）.

［10］ GOMEZ－JIMENEZ M C，PAREDES M A，GALLARDO M，et al.Tissue－specific expression of olive S－adenosyl methionine decarboxylase and spermidine synthase genes and polyamine metabolism during flower opening and early fruit development［J］.Planta，2010，232（3）：629－647.

［11］ GILL S S，TUTEJA N.Polyamines and abiotic stress tolerance in plants［J］.Plant Signal.Behav，2010，5（1）：26－33.

［12］ GALSTON A W，SAWHNEY R K.Polyamines in plant physiology［J］.Plant Physiology，1990，94（2）：406－410.

［13］ HUANG W Y（黃維玉），WANG Y L（王亞來(lái)），YUAN L J（袁林江）.The relationship between polyamines and senescence of detached wheat leaves［J］.Acta Botanica Sinica（植物學(xué)報(bào)），1990，32（2）：125－132（in Chinese）.

［14］ LI X F（李曉峰），LI X（李 雪），JIA B（賈 兵），et al.Analysis of enzyme activity and lignin content and expression of CCoAOMTgene in the pericarp of‘Dangshan Suli’and its russet mutant［J］.Acta Horticulturae Sinica（園藝學(xué)報(bào)），2012，39（5）：828－836（in Chinese）.

［15］ LAMB C，DIXON R A.The oxidative burst in plant disease resistance［J］.Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.，1997，48（1）：251－275.

［16］ PENNELL R I，LAMB C.Programmed cell death in plants［J］.Plant Cell，1997，9（7）：1 157－1 168.

［17］ YODA H，YAMAGUCHI Y，SANO H.Induction of hypersensitive cell death by hydrogen peroxide produced through polyamine degradation in tobacco plants［J］.Plant Physiol.，2003，132（4）：1 973－1 981.

［18］ HENG W，LIU L，WANG M D，et al.Differentially expressed genes related to the formation of russet fruit skin in a mutant of‘Dangshansuli’pear（Pyrus bretchnederi Rehd.）determined by suppression subtractive hybridization［J］.Euphytica，2014，196（2）：285－297.

［19］ HENG W（衡 偉），JIA B（賈 兵），YE ZH F（葉振風(fēng)），et al.The analysis of pericarp structure in‘Dangshansuli’and its russet mutant‘Xiusu’［J］.China Fruits（中國(guó)果樹(shù)），2011，（3）：20－22（in Chinese）.

［20］ GIL－AMADO J A，GOMEZ－JIMENEZ M C.Regulation of polyamine metabolism and biosynthetic gene expression during olive maturefruit abscission［J］.Planta，2012，235（6）：1 221－1 237.

（編輯：宋亞珍）

Polyamines Content，Cloning and Expression of the Relevant Genes in Exocarp of‘Dangshansuli’Pear and Its Russet Fruit Mutant

SUN Hongli，WANG Ziteng，JIANG Xianghong，JIA Bing，LIU Li，YE Zhenfeng，HENG Wei，ZHU Liwu＊
（School of Horticulture，Anhui Agricultural University，Hefei 230036，China）

To investigate the mechanism of russet skin formation in pear（Pyrus bretschneideri Rehd.），we used the exocarp of the wild type‘Dangshansuli’and its mutant type‘Xiusu’pear with russet fruits at different days after full bloom（DAFB）as material in this experiment.The content of polyamine was determined by High Performance Liquid Chromatography（HPLC）.The key genes in polyamine biosynthesis were cloned by rapid amplification of cDNA ends（RACE），and their physicochemical properties were conducted by the protocol of Protparam website（http：／／web.expasy.org／protparam／）and the phylogenetic tree of putative proteins was constructed by MEGA5.0software.The relative expressions of ADC，SPDS and SPMSgenes at different stages were analyzed by using real－time quantitative reverse transcription－PCR（qRT－PCR）.The results showed that：（1）The putrescine contents in the exocarp of‘Dangshansuli’was significantly higher than that in‘Xiusu’except for 50and 150DAFB.At 75DAFB，the contents of spermidine and spermine in the exocarp of‘Xiusu’were higher than that in‘Dangshansuli’.（2）The genes of arginine decarboxylase（ADC），spermidine synthase（SPDS）and spermine synthase（SPMS）werecloned，and were submitted to the database of the National Center for Biotechnology Information（NCBI）with the accession number KM923903，KM923905and KM923906，respectively.The structure of putative proteins of ADC，SPDSand SPMSgene in pear was closer to that in apple.ADC and SPMS were all watersoluble by the prediction of their physicochemical properties.The SPDS was water－repellent by the prediction of their physicochemical properties.（3）The levels of relative expressions of ADC，SPDSand SPMSin the exocarp of‘Xiusu’were higher than that in‘Dangshansuli’at 50DAFB.It was postulated that the metabolism of polyamine and up－regulation of relevant genes may be associated with the formation of russet fruit of‘Xiusu’pear.

pear；russet fruit mutant；polyamine；gene clone；relative expression real－time PCR

Q945.6＋4；Q789

A

1000－4025（2015）08－1534－07

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1534

2015－04－27；修改稿收到日期：2015－06－08

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS－29－14）；國(guó)家自然科學(xué)基金（31101519）

孫虹麗（1989－），女，在讀碩士研究生，主要從事果樹(shù)分子生物學(xué)研究。E－mail：sunhongli1212＠163.com

＊通信作者：朱立武，教授，研究生導(dǎo)師，主要從事果樹(shù)種質(zhì)資源與遺傳育種研究。E－mail：zhuliwu＠ahau.edu.cn