印度南瓜果皮和果肉顏色遺傳分析及基因定位

葛 宇，李 雪，楊曉霞，徐文龍，崔崇士，屈淑平＊

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱150030；2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站，海口570102）

印度南瓜果皮和果肉顏色遺傳分析及基因定位

葛 宇1，2，李 雪1，楊曉霞1，徐文龍1，崔崇士1，屈淑平1＊

（1東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，哈爾濱150030；2中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院?？趯?shí)驗(yàn)站，?？?70102）

以印度南瓜‘98－2－351’與‘06820－1’雜交構(gòu)建F2群體，對(duì)親本及各世代群體成熟果實(shí)果皮和果肉顏色進(jìn)行調(diào)查、統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果表明：F2群體中果皮桔紅色和灰色的分離比呈3∶1，說明果皮灰色是由單隱性基因控制；F2群體中果肉黃色和白色的分離比呈3∶1，說明果肉白色也是由單隱性基因控制。利用群體分離分析法結(jié)合隱性群體分析法，采用SSR分子標(biāo)記，找到了2個(gè)與控制灰色果皮基因位點(diǎn)CmRc緊密連鎖的SSR標(biāo)記（PU078072和PU013839），其連鎖遺傳距離分別為5.9cM和14.5cM；同時(shí)找到了1個(gè)與控制白色果肉基因位點(diǎn)CmFc緊密連鎖的SSR標(biāo)記PU132712，其連鎖遺傳距離為6.7cM。本研究為進(jìn)一步篩選與控制印度南瓜果皮和果肉顏色基因更加緊密連鎖的分子標(biāo)記及相關(guān)基因的精確定位奠定了基礎(chǔ)。

印度南瓜；果皮顏色；果肉顏色；群體分離分析法；隱性群體分析法

南瓜屬包含一些重要的栽培種，其中中國(guó)南瓜、美洲南瓜和印度南瓜這3個(gè)栽培種在世界范圍內(nèi)均被認(rèn)為是經(jīng)濟(jì)價(jià)值較高的作物，有“世界性蔬菜”的美稱［1］。南瓜屬作物果皮與果肉顏色各異，果皮有墨綠、黃紅、橙紅、綠色等不同顏色，果肉一般為橘黃色、黃色或白色，均是較為復(fù)雜的性狀。

對(duì)于南瓜果皮顏色遺傳規(guī)律，在印度南瓜和美洲南瓜上的研究結(jié)果表明：幼果黃皮對(duì)綠皮表現(xiàn)為不完全顯性，且在不同美洲南瓜品種上其顯性程度不同，同時(shí)發(fā)現(xiàn)幼果皮色與耐冷性具有一定的相關(guān)性［2－4］。此外，在美洲南瓜中已發(fā)現(xiàn)有13個(gè)基因位點(diǎn)控制果實(shí)發(fā)育期間果皮的著色，其中起主效作用的有3個(gè)基因位點(diǎn)（D、l－1、l－2）［5］。D基因?qū)麑?shí)發(fā)育早期果皮的著色并不起作用或作用不明顯，從授粉10d后作用才逐漸顯現(xiàn)。含有顯性D基因位點(diǎn)（D／－）的果實(shí)顏色將逐漸發(fā)深，而含有隱性d基因位點(diǎn)（d／d）的果實(shí)顏色不變。隱性l－1和l－2兩基因位點(diǎn)促使幼嫩果實(shí)的果皮著色較淺，而含有顯性L－1和L－2基因位點(diǎn)（L－1／－，L－2／－）的果實(shí)顏色在果實(shí)發(fā)育期將逐漸發(fā)深［6］。向成鋼［7］以紅皮吊瓜和‘綠Agol’2個(gè)印度南瓜品種為親本構(gòu)建了一個(gè)六世代臨時(shí)遺傳群體，得到皮色是受核基因控制的一個(gè)性狀，在成熟的果實(shí)中，瓜皮色非全綠對(duì)全綠表現(xiàn)為顯性單基因控制的質(zhì)量性狀。李曉林等［8］以砍瓜和中國(guó)南瓜品種‘廣西蜜本’以及雜種F1為研究對(duì)象，利用POD和Est同工酶進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果表明F1代花皮瓜為黃色，青皮瓜為橙紅色，都接近于‘廣西蜜本’的橙紅色，屬于偏父遺傳。

南瓜在果肉顏色性狀的遺傳規(guī)律上研究較少，只對(duì)美洲南瓜進(jìn)行了一些研究。研究人員發(fā)現(xiàn)在美洲南瓜果實(shí)發(fā)育中期，黃色對(duì)綠色為顯性并把控制黃色果肉的基因命名為Y基因；在美洲南瓜成熟后，白色果肉或淺白色果肉對(duì)有顏色果肉為顯性，并且分別控制白色果肉和淺白色果肉的W和WF基因之間還存在遺傳互補(bǔ)關(guān)系［9］。

在基因定位方面，Brown等［10］率先開展了南瓜屬作物瓜皮顏色基因的定位分析，他們以美洲南瓜和中國(guó)南瓜為親本，構(gòu)建了一個(gè)分子遺傳圖譜，定位了一個(gè)控制早熟黃色果皮的基因位點(diǎn)B。隨后，Gong等［11］構(gòu)建了一個(gè)中國(guó)南瓜分子遺傳圖譜，并在同一條連鎖群上（LGm5）發(fā)現(xiàn)了2個(gè)與綠色果皮相關(guān)的基因位點(diǎn)，分別命名為GrNL和GrZHOU。近期，研究人員又構(gòu)建了2個(gè)美洲南瓜分子遺傳圖譜，按照檢測(cè)南瓜果皮與果肉顏色方法的精細(xì)程度，把這2個(gè)性狀分別定為數(shù)量或質(zhì)量性狀2種類型，對(duì)多個(gè)果皮與果肉顏色進(jìn)行初步定位，找到多個(gè)QTL基因位點(diǎn)［12］。

本實(shí)驗(yàn)研究印度南瓜果肉和果皮顏色性狀的遺傳規(guī)律，然后利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合F2分離群體對(duì)控制這2個(gè)性狀的基因進(jìn)行初步定位。為研究印度南瓜果肉和果皮顏色基因的圖位克隆以及果肉和果皮顏色形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

材料‘06820－1’果肉黃色、果皮桔紅色，‘98－2－351’果肉白色、果皮灰色，都是經(jīng)多代選育的自交系，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院南瓜育種研究室提供。

1.2 果皮和果肉顏色鑒定及遺傳分析

以‘06820－1’（P1）和‘98－2－351’（P2）為親本，兩親本正反交配制雜交組合，F(xiàn)1自交獲得F2群體。2012年春，在哈爾濱香坊繁育基地種植親本、正反交F1代及F2代。親本和正反交的F1各20株，F(xiàn)2群體201株，每株保留1個(gè)果實(shí)，常規(guī)田間管理。

2012年秋季南瓜果實(shí)成熟時(shí)，觀測(cè)親本及F1、F2群體的果皮顏色，并參照中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所南瓜種質(zhì)資源調(diào)查記載標(biāo)準(zhǔn)，將南瓜果皮顏色分為2個(gè)等級(jí)：桔紅色和灰色（圖1，A），用卡平方檢驗(yàn)計(jì)算分離比。南瓜果實(shí)成熟時(shí)，用標(biāo)準(zhǔn)比色卡測(cè)親本及F1、F2群體的果肉顏色，將其果肉顏色分為5個(gè)等級(jí)（圖1，B）。將0、1級(jí)定為白色，2、3、4級(jí)定為黃色，用卡平方檢驗(yàn)計(jì)算分離比。

1.3 果皮和果肉顏色基因初步定位

1.3.1 基因池的構(gòu)建 親本、F1與F2群體植株葉片采回后保存于－20℃冰箱中，采用SDS法提取各植株DNA［13］。在F2代群體中分別選出極顯著的果皮桔紅色和灰色、果肉黃色和白色各10個(gè)單株，將其DNA樣品分別等量混合，組成果皮桔紅色與灰色和果肉黃色與白色兩組基因池。

1.3.2 標(biāo)記與果皮和果肉顏色基因的連鎖分析共用1 389對(duì)SSR引物，其中300對(duì)引物序列來自于Gong等［14］公開發(fā)表的引物序列；1 089對(duì)來自www.icugi.org數(shù)據(jù)庫(kù)，根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列經(jīng)比對(duì)，挑選、合成引物用于該實(shí)驗(yàn)。所有引物均由上海生物工程技術(shù)公司合成。PCR反應(yīng)體系及程序參照文獻(xiàn)［15］。采用群體分離分析法，通過SSR分子標(biāo)記篩選親本之間的多態(tài)性，利用親本間具有多態(tài)性的標(biāo)記分別對(duì)果皮桔紅色與灰色和果肉黃色與白色兩組基因池進(jìn)行檢測(cè)，尋找連鎖標(biāo)記。利用F2代群體中果皮和果肉顏色表型為隱性的單株，使用隱性群體分析法，分析SSR標(biāo)記與基因位點(diǎn)的連鎖情況。

1.3.3 構(gòu)建局部基因連鎖圖 利用JoinMap 3.0［16－17］軟件，分析SSR標(biāo)記與控制果皮和果肉顏色基因位點(diǎn)的連鎖關(guān)系和遺傳距離，用MapChart 2.1［18］軟件繪制局部連鎖圖。

2 結(jié)果與分析

結(jié)果表明：P1親本‘06820－1’及正反交F1所有單株的果皮均為桔紅色，P2親本‘98－2－351’所有單株果皮均為灰色，說明果皮桔紅色對(duì)灰色為顯性，且由核基因控制。在201個(gè)F2群體單株中有個(gè)別單株在果皮顏色上出現(xiàn)桔紅色果皮伴有灰色斑塊現(xiàn)象。由于南瓜果皮顏色較為復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)排除南瓜果皮條紋、斑塊等性狀，只針對(duì)果皮顏色進(jìn)行簡(jiǎn)單的探討，將出現(xiàn)上述現(xiàn)象的單株剔除后對(duì)剩下的185株進(jìn)行果皮顏色遺傳規(guī)律分析及基因定位研究。剩余F2群體中129株果皮為桔紅色，56株果皮為灰色。經(jīng)卡平方驗(yàn)證，果皮桔紅色和灰色分離比例符合3∶1比例（χ2＝1.29，P＜0.05），表明印度南瓜果皮灰色性狀是由單隱性基因控制，并將此基因暫時(shí)命名為CmRc（Cucurbita maxima rind color）。

通過對(duì)親本、F1及F2群體進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果表明：親本‘06820－1’及正反交F1所有單株的果肉均為黃色，親本‘98－2－351’所有單株果肉均為白色，說明果皮黃色對(duì)白色為顯性，且由核基因控制。在201個(gè)F2群體單株中148株果肉為黃色，53株果肉為白色。經(jīng)卡平方驗(yàn)證，果肉黃色和白色分離比例符合3∶1比例（χ2＝0.15，P＜0.05），表明印度南瓜果肉白色性狀是由單隱性基因控制，并將此基因暫時(shí)命名為CmFc（Cucurbita maximaflesh color）。

2.2 多態(tài)性標(biāo)記的篩選

利用1 389對(duì)SSR引物在親本間進(jìn)行篩選，其中只有94對(duì)SSR引物在親本之間的擴(kuò)增條帶存在多態(tài)性，多態(tài)率為6.77%。利用這94對(duì)SSR引物

2.1 果皮與果肉顏色遺傳分析

通過對(duì)親本、F1及F2群體進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)果皮桔紅色基因池和果皮灰色基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，只有2個(gè)SSR引物PU013839和PU078072在兩池間具有明顯的多態(tài)性。同樣，利用這94對(duì)SSR引物在果肉黃色和白色基因池進(jìn)行PCR擴(kuò)增，僅有1個(gè)SSR引物PU132712在兩池間具有明顯的多態(tài)性。引物PU013839、PU078072和PU132712在親本、F1、基因池及所構(gòu)建基因池的各單株上的擴(kuò)增結(jié)果如圖2～3所示。

2.3 CmRc和CmFc基因的初步定位

根據(jù)果皮顏色基因池篩選的結(jié)果，用SSR標(biāo)記PU013839和PU078072在185個(gè)F2群體單株之間進(jìn)行PCR擴(kuò)增，檢測(cè)F2群體單株果皮顏色的基因型。SSR標(biāo)記PU013839和PU078072擴(kuò)增結(jié)果經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)數(shù)值分別為2.5和符合3∶1分離比例（表1）。SSR標(biāo)記PU013839在部分F2群體單株上的基因型如圖4所示。

利用Joinmap 3.0軟件分析PU078072和PU013839這2個(gè)標(biāo)記及CmRc基因位點(diǎn)的分離情況，結(jié)果表明這2個(gè)標(biāo)記分別位于CmRc基因位點(diǎn)兩側(cè)，其遺傳距離分別為5.9cM和14.5cM（圖6）。

利用SSR標(biāo)記PU132712檢測(cè)201個(gè)F2群體單株，有53個(gè)單株擴(kuò)增出與親本‘06820－1’相同的條帶，40個(gè)單株擴(kuò)增出與親本‘98－2－351’相同的條帶，還有108個(gè)單株擴(kuò)增出雜合條帶（圖5）。經(jīng)卡方測(cè)驗(yàn)數(shù)值，符合3∶1分離比例。

利用Joinmap 3.0軟件分析PU132712標(biāo)記和CmFc基因位點(diǎn)的分離情況，結(jié)果表明這個(gè)標(biāo)記與CmFc基因位點(diǎn)遺傳距離為6.7cM（圖7）。

3 討 論

南瓜果皮和果肉顏色是南瓜的重要標(biāo)志性狀之一。據(jù)目前已有的相關(guān)報(bào)道，南瓜桔紅色和灰色果皮顏色與黃色和白色果肉顏色性狀均是由果皮與果肉中的類胡蘿卜素含量所決定的，顏色深淺度與類胡蘿卜素含量呈正相關(guān)關(guān)系［19－20］。

Brown等［10］按照果皮顏色為質(zhì)量性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過對(duì)中國(guó)南瓜和美洲南瓜雜交群體進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)早熟黃色果皮對(duì)早熟綠色果皮為不完全顯性。同時(shí)利用RAPD分子標(biāo)記對(duì)早熟黃色果皮基因位點(diǎn)B進(jìn)行定位，其緊密連鎖標(biāo)記與該基因位點(diǎn)的遺傳距離為27.1cM。Gong等［11］同樣按照果皮顏色為質(zhì)量性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過對(duì)美洲南瓜雜交群體進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)綠色果皮對(duì)淺黃色果皮為顯性，其緊密連鎖的SSR標(biāo)記與綠色果皮基因位點(diǎn)GrNL和GrZHOU的遺傳距離分別為12.7和9.4cM。本研究F2群體中，同樣按照印度南瓜果皮和果肉為質(zhì)量性狀進(jìn)行評(píng)價(jià)，結(jié)果表明印度南瓜灰色果皮和白色果肉基因表現(xiàn)為單基因隱性遺傳，其最緊密連鎖的SSR標(biāo)記與灰色果皮和白色果肉基因位點(diǎn)CmRc和CmFc的遺傳距離分別為5.9和6.7cM。本實(shí)驗(yàn)與前人實(shí)驗(yàn)一樣，所得到的連鎖標(biāo)記與目的基因位點(diǎn)的遺傳距離仍較大，在實(shí)際分子標(biāo)記輔助選擇上應(yīng)用受限。今后還需要進(jìn)一步開發(fā)引物，篩選與相關(guān)基因位點(diǎn)更加緊密連鎖的分子標(biāo)記，為印度南瓜灰色果皮和白色果肉基因位點(diǎn)的精確定位奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

［1］ ROBINSON R W，DECKER－WALTERS D S.Cucurbits［M］.CAB International，New York.1997.

［2］ MCCOLLUM K.Gene Binfluences susceptibility to chilling injury in Cucurbita pepo［J］.Journal of the American Society for Horticultural Science，1990，115（4）：618－622.

［3］ SHIFRISS O.Origin，expression，and significance of gene Bin Cucurbita pepo L.［J］.Journal of the American Society for Horticultural Science，1981，106：220－232.

［4］ SHIFRISS O.Relationship between the Bgene of two Cucurbitaspecies［J］.Cucurbit Genetics Cooperative Report，1986，9：97－99.

［5］ PARIS H S.Quiescent intense（qi），agene that affects young but not mature fruit color intensity in Cucurbita pepo［J］.Journal of Heredity，2000，91（4）：333－339.

［6］ PARIS H S.Genetic control of irregular striping，a new phenotype in Cucurbita pepo［J］.Euphytica，2002，129（1）：119－126.

［7］ 向成鋼.印度南瓜皮色、節(jié)間長(zhǎng)、籽粒大小的遺傳分析及遺傳圖譜構(gòu)建［D］.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，2013.

［8］ LI X L（李曉林），WEI J Y（韋靜宜），YE SH H（葉紹華），et al.Identification of hybrid F1of Cucurbita kangua Li.×Cucurbita moschata Duch.［J］.Journal of Southwest University（Natural Science Edition）（西南大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版）），2007，29（11）：1 673－1 868（in Chinese）.

［9］ PARIS H S，BROWN R N.The genes of pumpkin and squash［J］.Hortscience，2005，40（6）：1620－1630.

［10］ BROWN R N，MYERS J R.A genetic map of squash（Cucurbitasp.）with randomly amplified polymorphic DNA markers and morphological markers［J］.Journal of the American Society for Horticultural Science，2002，127（4）：568－575.

［11］ GONG L，PACHNER M，KALAI K，et al.SSR－based genetic linkage map of Cucurbita moschata and its synteny with Cucurbita pepo.Genome，2008，51（11）：878－887.

［12］ ESTERAS C，GOMEZ P，MONFORTE A J，et al.High－throughput SNP genotyping in Cucurbita pepo for map construction and quantitative trait loci mapping［J］.BMC Genomics，2012，13：80.

［13］ 葛 宇.大白菜UGMS遺傳圖譜的構(gòu)建及重要農(nóng)藝性狀的QTL分析［D］.沈陽：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，2011.

［14］ GONG L，STIFT G，KOFLER R，et al.Microsatellites for the genus Cucurbitaand an SSR－based genetic linkage map of Cucurbita pepo L.［J］.Theoretical and Applied Genetics，2008，117（1）：37－48.

［15］ LIU C，GE Y，WANG D J，et al.Morphological and molecular diversity in a germplasm collection of seed pumpkin［J］.Scientia Horticulturae，2013，154（2）：8－16.

［16］ STAM P.Construction of integrated genetic linkage maps by means of a new computer package：JoinMap［J］.Plant Journal，1993，3（5）：739－744.

［17］ VANOOIJEN J W，VOORRIPS R E.JoinMap Version 3.0：software for the Calculation of Genetic Linkage Maps［M］.Plant Res Intl：Wageningen，The Netherlands.2001.

［18］ VOORRIPS R E.MapChart：Software for the graphical presentation of linkage maps and QTLs［J］.Journal of Heredity，2002，93（1）：77－78.

［19］ LOPEZ A F，CRAVERO V，ASPRELLI P.Inheritance of immature fruit color in Cucurbita maxima var.zapallito［J］.Cucurbit Genetics Cooperative Report，2003，26：48－50.

［20］ SCHAFFER A A，BOYER C D，GIANFAGNA T.Genetic control of plastid carotenoids and transformation in the skin of Cucurbita pepo L.fruit［J］.Theoretical and Applied Genetics，1984，68（6）：493－501.

（編輯：宋亞珍）

Genetic Analysis and Gene Mapping of Rind and Flesh Color of Cucurbita maxima

GE Yu1，2，LI Xue1，YANG Xiaoxia1，XU Wenlong1，CUI Chongshi1，QU Shuping1＊
（1Department of Horticulture，Northeast Agricultural University，Harbin，150030，China；2Haikou Experimental Station，Chi
nese Academy of Tropical Agricultural Sciences，Haikou，570102，China）

The F2population was derived by crossing two diverse Cucurbita maxima lines‘98－2－351’and‘06820－1’.Investigation and statistical analyses were conducted on rind and flesh color of mature fruits for parental plants and each generation.The results demonstrated that the orange and grey rind plants in F2population were fitted for the ratio of 3∶1，indicating that the grey rind was controlled by a single recessive gene；similarly，the yellow and white flesh plants in F2population were also fitted for the ratio of 3∶1，showing that the white flesh was controlled by a single recessive gene.With bulked segregation analysis and recessive－class approaches，two SSR markers PU078072and PU013839were detected to be tightly linked to the locus CmRc at a distance 5.9and 14.5cM，respectively.Meanwhile，one SSR marker PU132712was founded to be closely linked to the locus CmFc at a distance 6.7cM.This study laid the foundation for further screening the molecular markers closer linked to rind and flesh color genes of C.maximaand locating them accurately.

Cucurbita maxima；rind color；flesh color；bulked segregation analysis；recessive－class approaches

Q343.1＋7；S642.1

A

1000－4025（2015）08－1524－06

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1524

2015－03－11；修改稿收到日期：2015－05－22

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201303112）

葛 宇（1982－），男，博士，助理研究員，主要從事園藝植物生物技術(shù)研究。E－mail：geyu198224＠gmail.com

＊通信作者：屈淑平，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事南瓜育種。E－mail：qushuping＠sohu.com