1個(gè)新巨胚等位基因的鑒定與表達(dá)分析及其性狀考察

平寶哲，時(shí)亞瓊，謝米雪，張 鑫，王 鑫，張 濤，李建粵

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，植物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)中心，上海200234）

1個(gè)新巨胚等位基因的鑒定與表達(dá)分析及其性狀考察

平寶哲，時(shí)亞瓊，謝米雪，張 鑫，王 鑫，張 濤，李建粵＊

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，植物種質(zhì)資源開(kāi)發(fā)中心，上海200234）

該研究以‘超2－10’水稻和‘上師大5號(hào)’巨胚水稻為材料，分析了2種水稻的胚重、胚與糙米質(zhì)量比、巨胚性狀的遺傳，克隆和分析了其巨胚基因（GE）序列，并對(duì)巨胚基因進(jìn)行了表達(dá)分析。結(jié)果顯示：（1）‘上師大5號(hào)’的胚重、胚與糙米質(zhì)量比均極顯著大于‘超2－10’，且‘超2－10’的胚重接近或大于一些已報(bào)道的巨胚水稻；（2）‘上師大5號(hào)’巨胚表型由1對(duì)隱性基因控制，并與韓國(guó)巨胚稻‘M－2－565－11－3－B（ge）’屬于相同的等位基因突變；（3）‘超2－10’、‘上師大5號(hào)’和‘M－2－565－11－3－B（ge）’3種水稻各自具有1個(gè)新的GE等位基因，它們的突變位點(diǎn)分別位于啟動(dòng)子、啟動(dòng)子及編碼鏈、編碼鏈；（4）‘上師大5號(hào)’啟動(dòng)子及編碼鏈都有突變的GE等位基因（gec），在開(kāi)花后4～7d的穎果中表達(dá)量持續(xù)增加，完全不同于只有編碼鏈突變的GE等位基因呈持續(xù)下降的表達(dá)模式。該研究首次報(bào)道了突變?cè)趩?dòng)子、突變同時(shí)發(fā)生在啟動(dòng)子及編碼鏈2種新型巨胚等位基因。

巨胚基因；‘上師大5號(hào)’；‘超2－10’；‘M－2－565－11－3－B（ge）’；新等位基因；表達(dá)分析

近幾年來(lái)隨著人們對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的追求，對(duì)功能性稻米的研究越來(lái)越為人所關(guān)注。巨胚稻是一種胚變大的水稻突變體，其胚表型比正常的水稻胚增大2倍以上。巨胚糙米中的γ－氨基丁酸（GABA）［1－2］、維生素E［1，3－7］、多種氨基酸［1，4，7］、谷維素［1，6］、酚類［1，6］和礦物質(zhì)［3，6－7］的含量都顯著高于正常水稻的糙米。

有文獻(xiàn)報(bào)道，巨胚性狀由隱性單基因控制［3，8－10］。錢前等［9］利用‘金南風(fēng)／南京11’F2群體對(duì)‘金南風(fēng)’的巨胚基因（GE）進(jìn)行了定位，將巨胚基因定位在第7染色體上RG678和RZ395之間，遺傳距離分別是6.2cM和13cM。Koh等［11］利用‘Hwacheongbyeo－ges／Milyang23’F2群體，將巨胚基因定位在第7染色體上的RZ395和CD0497之間，遺傳距離分別為2.4cM和3.4cM。近年來(lái)，人們對(duì)巨胚基因的進(jìn)一步研究認(rèn)為，巨胚基因，即Os07g0603700，編碼細(xì)胞色素P450家族中的一種蛋白［3，10，12－15］，目前該蛋白被定名為CYP78B5［15］。Chen等［15］研究表明，CYP78B5蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過(guò)氧化物酶體內(nèi)完成代謝過(guò)程，該蛋白功能缺失會(huì)導(dǎo)致IAA水平急劇下降，影響細(xì)胞分裂和膨大，從而導(dǎo)致胚與胚乳比列的改變。

目前已報(bào)道的GE等位基因有g(shù)e －1、ge －2、ge －3、ge －4、ge －5、ge －6、ge －7、ge －8、ge －9、ge －10［12］、get［3］，以及10217巨胚稻［10］、Kita－ake巨胚稻［15］中的GE等位基因，它們分別在不同地域水稻品種中被發(fā)現(xiàn)。雖然已有十多個(gè)巨胚等位基因的報(bào)道，但這些等位基因的突變都在編碼鏈上。目前還不清楚對(duì)于GE等位基因是否會(huì)在編碼鏈外發(fā)生突變。

觀察‘超2－10’的胚，雖然比不上現(xiàn)已報(bào)道的較多巨胚水稻品種［1，3，6，10，13，15］，但比‘日本晴’水稻大。目前還不清楚‘超2－10’的GE等位基因是否有突變。本實(shí)驗(yàn)室在將‘超2－10’成熟胚離體培養(yǎng)時(shí)，曾發(fā)生胚表型突變，由此形成了一個(gè)胚更大的‘上師大5號(hào)’水稻［16］。為了探索導(dǎo)致‘上師大5號(hào)’巨大胚表型的突變基因，本研究以‘超2－10’和‘上師大5號(hào)’為材料，對(duì)‘上師大5號(hào)’的巨胚性狀及巨胚基因開(kāi)展了研究。

1 材料和方法

1.1 水稻材料

‘上師大5號(hào)’由‘超2－10’在水稻組織培養(yǎng)環(huán)境中發(fā)生胚性狀突變而獲得的新巨胚水稻［16］?！?－10’和‘上師大5號(hào)’是本研究中2種最主要的水稻材料；為了分析‘上師大5號(hào)’是否與目前已報(bào)道的其他巨胚水稻屬于相同等位基因突變，本研究還選用由韓國(guó)‘花晴’水稻突變得到的巨胚稻‘M－2－565－11－3－B（ge）’作為研究材料；為了對(duì)‘上師大5號(hào)’巨胚基因的遺傳規(guī)律進(jìn)行分析，本研究又選取了2種正常胚水稻：兩系不育系‘261S’和常規(guī)旱稻‘IRAT109’作為試驗(yàn)材料。正常胚水稻‘日本晴’作為體式顯微鏡觀察的對(duì)照材料。

1.2 水稻糙米及胚性狀考察

取‘上師大5號(hào)’和‘超2－10’的稻谷各300粒，分3組，每組100粒，按照朱映東等方法［17］稱量糙米百粒重、百粒胚重，并計(jì)算胚與糙米質(zhì)量比。

選取‘上師大5號(hào)’、‘超2－10’、‘M－2－565－11－3－B（ge）’和‘日本晴’水稻具有代表性的糙米，在LeicaDFC290體式顯微鏡下觀察不同水稻糙米的胚大小并進(jìn)行拍照。

1.3 ‘上師大5號(hào)’巨胚突變性狀的遺傳分析

以‘上師大5號(hào)’為母本，分別與3種正常胚水稻‘超2－10’、‘261S’和‘IRAT109’進(jìn)行雜交。收獲F1種子以及從F1植株上分單株收獲F2種子，去掉F2種子穎殼，以‘上師大5號(hào)’為對(duì)照，直接觀察F2糙米胚大小，并進(jìn)行小胚和巨胚分離比統(tǒng)計(jì)分析。以‘261S’ב上師大5號(hào)’組合F1植株為父本，與‘261S’回交，收獲回交F1種子，觀察回交F1植株自交所結(jié)種子的胚大小，統(tǒng)計(jì)分析有巨胚種子單株和無(wú)巨胚種子單株的分離比。采用χ2檢驗(yàn)雜交后代巨胚和小胚分離比，以及回交植株有無(wú)巨胚種子單株的分離比，分析控制巨胚性狀的遺傳模式。

將巨胚稻‘上師大5號(hào)’與‘M－2－565－11－3－B（ge）’雜交及自交，收獲F1和F2種子，剝?nèi)シf殼，直接觀察F1和F2糙米胚大小。

1.4 水稻巨胚基因的擴(kuò)增及序列比對(duì)

使用TPS法［18］微量提取‘超2－10’、‘上師大5號(hào)’和‘M－2－565－11－3－B（ge）’3種水稻苗期葉片總DNA。在rice genome annotation（http：／／rice.plantbiology.msu.edu／analyses.shtml）查找‘日本晴’水稻LOC＿Os07g41240基因（NCBI網(wǎng)站中為Os07g0603700）序列，并截取該基因CDS區(qū)上下游分別延伸3kb和1kb的序列。利用Primer Premier 5.0軟件，以該基因起始密碼子ATG的A堿基為起點(diǎn)（＋1bp），在上游－2 649bp至下游＋2 090 bp，分4段設(shè)計(jì)4對(duì)引物（表1）。預(yù)測(cè)每個(gè)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度介于1 333～1 563bp之間，每段PCR產(chǎn)物相互搭接至少大于2 0 0bp。使用高保真酶KOD（KOD－101，TOYOBO），以‘超2－10’、‘上師大5號(hào)’和‘M－2－565－11－3－B（ge）’水稻葉片總DNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。采用50μL PCR反應(yīng)體系，ddH2O 32μL，10×Buffer 5μL，dNTP（2mmol／L）5μL，MgSO43μL，10μmol·L－1的上下游引物各1.5μL，KOD酶1μL，模板1μL。PCR程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性2min；94℃變性15s，50～55℃退火（不同片段擴(kuò)增采用不同的退火溫度，表1）30s，68℃延伸45～55s（不同片段擴(kuò)增采用不同的延伸時(shí)間，表1），35個(gè)循環(huán)；最后68℃充分延伸5min。PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)?；厥疹A(yù)期分子量正確（表1）的目的條帶，送上海華大基因公司測(cè)序。使用DNAMAN軟件對(duì)3種水稻Os07g0603700基因測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接和比對(duì)，以‘日本晴’水稻的Os07g0603700基因序列為對(duì)照進(jìn)行比較分析。

1.5 水稻巨胚基因表達(dá)分析

分別取‘日本晴’、‘超2－10’和‘上師大5號(hào)’3種水稻開(kāi)花后4～7d的幼嫩種子，－80℃冷凍保存。剝?nèi)?種水稻幼嫩種子穎殼，用Trizol（Cat.No.15596－026，Invitrogen）試劑提取穎果總RNA。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（DRR047A，TAKARA）進(jìn)行基因組DNA消化和cDNA合成，用實(shí)時(shí)熒光定量RT－PCR法檢測(cè)3種水稻Os07g0603700基因的相對(duì)表達(dá)量（PCR儀為Bio－Rad公司產(chǎn)品，美國(guó)）。Os07g0603700和內(nèi)參actin基因引物以及擴(kuò)增反應(yīng)程序參照Wang等［5］的報(bào)道。每種樣品都做3個(gè)生物學(xué)重復(fù)?；蛳鄬?duì)表達(dá)量以2ΔCT表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘上師大5號(hào)’和‘超2－10’糙米及胚性狀考察

分析‘上師大5號(hào)’和‘超2－10’的糙米及胚性狀。結(jié)果（表2）顯示，‘上師大5號(hào)’平均百粒胚重和胚與糙米質(zhì)量比值分別為0.26g和13.83%，都極顯著高于‘超2－10’（0.12g和5.50%）。

體式顯微鏡對(duì)‘上師大5號(hào)’、‘超2－10’、‘M－2－565－11－3－B（ge）’和‘日本晴’水稻糙米拍照結(jié)果（圖1）顯示，‘上師大5號(hào)’的胚遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于‘超2－10’和‘日本晴’；‘M－2－565－11－3－B（ge）’水稻胚雖顯著大于‘超2－10’和‘日本晴’，但小于‘上師大5號(hào)’；2種正常胚水稻中，‘超2－10’胚大于‘日本晴’。

2.2 ‘上師大5號(hào)’巨胚性狀遺傳分析

觀察‘上師大5號(hào)’分別與‘超2－10’、‘261S’和‘IRAT109’3種小胚水稻雜交的F1種子，發(fā)現(xiàn)所有F1種子均表現(xiàn)小胚。從3個(gè)雜交組合中各取1棵F1植株，觀察其F1植株自交獲得的F2種子，將胚大小與‘上師大5號(hào)’相似的定為巨胚，其余為小胚。3個(gè)雜交組合F2種子小胚／巨胚種子數(shù)分別為729／239、246／69和719／250，3組雜交F2代種子中小胚與巨胚種子的分離比χ2檢測(cè)均符合3∶1。將‘261S’ב上師大5號(hào)’F1植株與‘261S’回交，收獲的F1種子都為小胚性狀。但是觀察回交F1植株所結(jié)種子發(fā)現(xiàn)，完全結(jié)小胚種子的植株數(shù)和含有巨胚與小胚分離的植株數(shù)分別為24和26。采用χ2檢測(cè)回交結(jié)果符合1∶1分離比。通過(guò)雜交及回交分析，說(shuō)明‘上師大5號(hào)’巨胚性狀是受1對(duì)隱性單基因控制。

將巨胚水稻‘上師大5號(hào)’與‘M－2－565－11－3－B（ge）’水稻進(jìn)行正反雜交，收獲的F1種子均為巨胚表型，而且自交后代種子都是巨胚表型。由此表明，‘上師大5號(hào)’與‘M－2－565－11－3－B（ge）’水稻中的巨胚基因?qū)儆谙嗤任换蛲蛔儭?/p>

2.3 水稻巨胚基因序列分析

為了解‘上師大5號(hào)’巨胚基因GE是否屬于目前已報(bào)道的Os07g0603700巨胚基因突變，擴(kuò)增和測(cè)序了‘上師大5號(hào)’以及對(duì)照‘超2－10’的Os07g0603700巨胚基因序列，并與‘日本晴’Os07g0603700基因序列進(jìn)行比較。

以O(shè)s07g0603700巨胚基因起始密碼子第一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸（A）為＋1bp，從上游－2 570bp至下游＋1 990bp，‘超2－10’的Os07g0603700基因序列與‘日本晴’水稻僅在啟動(dòng)子－777與－778之間有1個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸（A）的插入，其他序列都相同；‘超2－10’與‘上師大5號(hào)’的Os07g0603700基因序列，僅在‘上師大5號(hào)’第一外顯子＋125bp處的G突變?yōu)锳。

雜交試驗(yàn)檢測(cè)顯示，‘上師大5號(hào)’與‘M－2－565－11－3－B（ge）’的巨胚基因?yàn)榈任换?。比較分析‘日本晴’和‘M－2－565－11－3－B（ge）’的Os07g0603700基因序列，發(fā)現(xiàn)‘M－2－565－11－3－B（ge）’在起始密碼子第一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸（A）＋1bp至上游－2 570 bp之間的序列與‘日本晴’水稻完全相同，而在起始密碼子第一個(gè)腺嘌呤脫氧核苷酸（A）＋1bp至下游＋1 990bp之間的序列中，位于第二外顯子＋1 260處的堿基由G突變?yōu)锳，其他序列都與‘日本晴’水稻相同。目前，已明確突變位點(diǎn)的各個(gè)GE等位基因及本研究分析的2種巨胚水稻GE等位基因，在編碼鏈上脫氧核苷酸突變引起氨基酸前后種類變化以及氨基酸發(fā)生改變的位置主要分布在Os07g0603700基因前2個(gè)區(qū)域中（圖2）。

2.4 水稻巨胚基因RT－PCR分析

采用定量RT－PCR分析‘日本晴’、‘超2－10’和‘上師大5號(hào)’在開(kāi)花后4～7d幼嫩穎果中Os07g0603700巨胚基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Os07g0603700基因在‘日本晴’中表達(dá)量都非常低，在‘超2－10’開(kāi)花后4和5d的幼嫩穎果中表達(dá)量非常低，但在開(kāi)花后6d時(shí)，表達(dá)量增加，在開(kāi)花后7d時(shí)，表達(dá)量又非常低；而在‘上師大5號(hào)’開(kāi)花后4～6d的幼嫩穎果中，Os07g0603700巨胚基因表達(dá)模式與‘超2－10’相似，但在開(kāi)花后7d的表達(dá)量增加（圖3）。

3 討 論

目前已報(bào)道的巨胚等位基因有十多個(gè)，但是這些等位基因都是位于Os07g0603700基因編碼區(qū)的突變。與正常小胚水稻‘日本晴’比較，‘超2－10’的GE基因啟動(dòng)子具有一個(gè)脫氧核苷酸插入突變，同時(shí)胚體積大于‘日本晴’水稻。與前人報(bào)道比較，‘超2－10’胚重不僅明顯超過(guò)已報(bào)道的小胚水稻，而且接近甚至超過(guò)了部分巨胚水稻品種［4，6，19－21］。相對(duì)于‘上師大5號(hào)’而言，雖然我們將‘超2－10’稱為小胚水稻，但與前人文獻(xiàn)比較顯示，‘超2－10’實(shí)際上應(yīng)該屬于巨胚水稻，只是它的胚體積和胚重增大程度不如有些編碼鏈突變位點(diǎn)的巨胚水稻明顯。韓國(guó)的‘M－2－565－11－3－B（ge）’巨胚水稻已有文獻(xiàn)報(bào)道［2］，本研究進(jìn)一步報(bào)道了其GE基因序列。研究結(jié)果顯示，引起‘上師大5號(hào)’和‘M－2－565－11－3－B（ge）’2種水稻巨胚表型的GE基因都屬于Os07g0603700基因突變，并且都屬于新的Os07g0603700等位基因，可分別用geh和gec表示。本研究還報(bào)道了1個(gè)屬于啟動(dòng)子突變類型的GE等位基因，用geP表示?！蠋煷?號(hào)’中的gec基因是在geP基礎(chǔ)上的再次突變，屬于編碼鏈和啟動(dòng)子都有突變的等位基因類型。與前人報(bào)道比較，‘上師大5號(hào)’的胚重幾乎超過(guò)了目前已報(bào)道的所有巨胚水稻［1，3，4，6，7，19－21］。

在啟動(dòng)子上一些特定的脫氧核苷酸序列還可能作為調(diào)控基因表達(dá)的重要順式作用元件［22－24］。本研究利用PlantCARE網(wǎng)站（http：／／bioinformatics.psb.ugent.be／webtools／plantcare／html／）對(duì)‘超2－10’及‘上師大5號(hào)’編碼鏈上游－2 570～－1bp序列進(jìn)行啟動(dòng)子元件分析，在這2種水稻啟動(dòng)子的突變位點(diǎn)上沒(méi)有預(yù)測(cè)到順式作用元件的存在。

雖然在啟動(dòng)子上有些調(diào)控元件序列及功能目前可能并未被發(fā)現(xiàn)，但是通過(guò)對(duì)序列有突變的個(gè)體進(jìn)行基因表達(dá)分析，從而會(huì)使人們對(duì)啟動(dòng)子上某些或某個(gè)脫氧核苷酸的作用有了新的認(rèn)識(shí)。目前有研究顯示，Os07g0603700基因呈反調(diào)控模式，巨胚突變體表達(dá)量明顯高于正常的小胚水稻［5，13］。與‘日本晴’水稻比較，在Os07g0603700基因啟動(dòng)子存在相同突變的‘超2－10’和‘上師大5號(hào)’兩種水稻，在種子發(fā)育5～6d，它們Os07g0603700基因的表達(dá)模式相同，都有表達(dá)上調(diào)的現(xiàn)象。由此推測(cè)，位于Os07g0603700基因啟動(dòng)子上游－777bp和－778 bp之間插入腺嘌呤脫氧核苷酸后，對(duì)該基因的表達(dá)發(fā)揮了一定的作用。對(duì)于有些基因，如果在啟動(dòng)子上和編碼鏈特定位點(diǎn)都出現(xiàn)脫氧核苷酸突變，有可能使該基因的表達(dá)產(chǎn)生一種新的表達(dá)模式。Nagasawa等分析了具有g(shù)e －10巨胚等位基因水稻發(fā)育早期穎果中的Os07g0603700基因表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從開(kāi)花4～7d，ge －10巨胚等位基因的表達(dá)量呈現(xiàn)連續(xù)下降的趨勢(shì)［13］。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于啟動(dòng)子在－777bp與－778bp之間具有腺嘌呤脫氧核苷酸插入突變以及編碼鏈＋125脫氧核苷酸由G突變?yōu)锳的gec巨胚等位基因，從開(kāi)花4～7d，其表達(dá)量呈現(xiàn)連續(xù)上調(diào)的趨勢(shì)，完全不同于ge －10等位基因。

CYP78B5蛋白具有一些結(jié)構(gòu)比較保守的結(jié)構(gòu)域［15］，如N端的亮氨酸富集區(qū)，它與膜定位有關(guān)［25］；P450家族結(jié)構(gòu)域，包含一個(gè)非常保守的氧結(jié)合位點(diǎn)來(lái)行使單加氧功能；血紅素結(jié)合區(qū)，與Fe結(jié)合從而行使酶催化功能。與其他GE等位基因突變位點(diǎn)比較，發(fā)現(xiàn)‘上師大5號(hào)’的突變位點(diǎn)導(dǎo)致蛋白翻譯在第41個(gè)氨基酸處被提前終止，只具有一個(gè)不完整亮氨酸富集區(qū)，后面的細(xì)胞色素P450結(jié)構(gòu)域和血紅素結(jié)合區(qū)完全丟失。而目前報(bào)道的所有突變位點(diǎn)除ge－5在亮氨酸富集區(qū)提前終止之外，其他GE等位基因都是在細(xì)胞色素P450家族保守結(jié)構(gòu)域序列中出現(xiàn)單個(gè)氨基酸的替換，或在保守結(jié)構(gòu)域之后翻譯提前終止。Nagasawa等發(fā)現(xiàn)，在相同遺傳背景下，巨胚基因合成蛋白功能受損程度，以及突變位點(diǎn)所在基因結(jié)構(gòu)域的保守程度都與胚大小性狀關(guān)系密切，如在Kinmaze水稻背景下ge －5等位基因的水稻胚大于ge －1和ge －4等位基因的水稻胚；在Taichung水稻背景下，ge －9等位基因水稻的胚大于其他等位基因?qū)е碌木夼弑硇停?3］。在‘上師大5號(hào)’中被發(fā)現(xiàn)的gec等位基因，不僅在編碼鏈最上游的亮氨酸富集區(qū)發(fā)生了突變，而且在啟動(dòng)子區(qū)域也存在突變，由此表明，gec等位基因是一個(gè)更具巨胚潛力的優(yōu)良巨胚等位基因。

致謝：本研究使用的韓國(guó)‘M－2－565－11－3－B（ge）’巨胚水稻由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院樸鐘澤研究員提供，‘261S’和旱稻‘IRAT109’分別由上海市閔行區(qū)農(nóng)科所陸文龍高級(jí)農(nóng)藝師和上海師范大學(xué)董彥君教授提供。特此致謝。

［1］ SEO W D，KIM J Y，PARK D－S，et al.Comparative analysis of physico－chemicals and antioxidative properties of new giant embryo mutant，yr23517acp79，in rice（Oryza sativa L.）［J］.Journal of the Korean Society for Applied Biological Chemistry，2011，54（5）：700－709.

［2］ PU ZH Z（樸鐘澤），ZHANG J M（張建明），LU J A（陸家安），et al.The breeding and application of a new variety of functional rice named giant embryo japonic No.1［J］.China Rice（中國(guó)稻米），2009，15（3）：34－35（in Chinese）.

［3］ PARK D S，PARK S K，LEE B C，et al.Molecular characterization and physico－chemical analysis of a new giant embryo mutant allele（get）in rice（Oryza sativa L.）［J］.Genes ＆Genomics，2009，31（4）：277－282.

［4］ ZHANG L L，HU P S，TANG S Q，et al.Comparative studies on major nutritional components of rice with a giant embryo and a normal embryo［J］.Journal of Food Biochemistry，2005，29（6）：653－661.

［5］ WANG X，SONG Y E，LI J Y.High expression of tocochromanol biosynthesis genes increases the vitamin E level in a new line of giant embryo rice［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2013，61（24）：5 860－5 869.

［6］ JENG T L，SHIH Y J，HO P T，et al.Gamma－oryzanol，tocol and mineral compositions in different grain fractions of giant embryo rice mutants［J］.Journal of the Science of Food and Agriculture，2012，92（7）：1 468－1 474.

［7］ ZHANG L L，SHU X L，WANG X Y，et al.Characterization of indica－type giant embryo mutant rice enriched with nutritional components［J］.Cereal Research Communications，2007，35（3）：1 459－1 468.

［8］ SATOH H，OMURA T.New endosperm mutations induced by chemical mutagens in rice（Oryza sativa L.）［J］.Japanese Journal of Breeding，1981，31（3）：316－326.

［9］ QIAN Q，XIONG Z M，MIN S K，et al.The RFLP of tagging of giant embryo gene［J］.Rice Science，1995，10（2）：65－57.

［10］ ZHANG S B（張所兵），QIN G J（秦根基），et al.Molecular characterization and development of molecular marker of a new giant embryo allele（ge）in rice（Oryza sativa L.）［J］.Molecular Plant Breeding（分子植物育種），2011，9（5）：525－530（in Chinese）.

［11］ KOH H J，HEU M H，MCCOUH S R.Molecular mapping of the gesgene controlling the super－giant embryo character in rice（Oryza sativa L.）［J］.Theoretical and Applied Genetics，1996，93（1－2）：257－261.

［12］ CAHOON R E，HEPPARD E P，et al.Alteration of embryo／endosperm size during seed development，US Patent 20，030，126，645［P］.2003－07－03

［13］ NAGASAWA N，HIBARA K I，HEPPARD E P，et al.Giant embryo encodes CYP78A13，required for proper size balance between embryo and endosperm in rice［J］.The Plant Journal，2013，75（4）：592－605.

［14］ YANG W B，GAO M J，YIN X，et al.Control of rice embryo development，shoot apical meristem maintenance，and grain yield by a novel cytochrome P450［J］.Molecular Plant，2013，6（6）：1 945－1 960.

［15］ CHEN Y L，LIU L L，SHEN Y Y，et al.Loss of function of the cytochrome P450gene CYP78B5causes giant embryos in rice［J］.Plant Molecular Biology Reporter，2015，33（1）：69－83.

［16］ REN Y G（任永剛），ZHANG J ZH（張建中），ZHANG H M（張紅梅），et al.A new mutants for rice giant embryo induced thoughin vitro culture of mature embryos and analyses of its characters and grain qualities［J］.Journal of Shanghai Normal University（Natural Sciences）（上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版），2011，40（3）：289－294（in Chinese）.

［17］ ZHU Y D（朱映東），SHI Y Q（石亞瓊），et al.Development of aromatic giant－embryo rice by molecular marker－assisted selection［J］.Journal of Shanghai Normal University（Nat.Sci.Edi.）（上海師范大學(xué)學(xué)報(bào)·自然科學(xué)版），2013，42（6）：623－628（in Chinese）.

［18］ MIURA K，YAMAMOTO E，MORINAKA Y，et al.The hybrid breakdown 1（t）locus induces interspecific hybrid breakdown between rice Oryza sativa cv.koshihikari and its wild relative O.nivara［J］.Breeding Science，2008，58（2）：99－105.

［19］ ZHAO Z SH（趙則勝），JIANG J Y（蔣家云）.Preliminary study on high－nutritive and functional large－embryo rice［J］.Acta Agriculturae Shanghai（上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)），2002，18（B12）：5－8（in Chinese）.

［20］ ZHANG Q Q（章清杞），YANG Y L（楊艷荔），LI Y（李毓），et al.Development of giant embryo CMS line TgeA［J］.Journal of Nuclear Agricultural Sciences（核農(nóng)學(xué)報(bào)），2003，17（4）：245－248（in Chinese）.

［21］ LIU L L（劉玲瓏），JIANG L（江玲），LIU SH J（劉世家），et al.Accumulation of theγ－aminobutyric acid in brown rice—a new rice strain W025with giant－embryo during water soaking［J］.Acta Agronomica Sinica（作物學(xué)報(bào)），2006，31（10）：1 265－1 270（in Chinese）.

［22］ JETHA K，GUNTER T，RAINER M.Arabidopsis SEPALLATAproteins differ in cooperative DNA－binding during the formation of floral quartet－like complexes［J］.Nucleic Acids Research，2014，42（17）：10 927－10 942.

［23］ BEHRINGER C，BASTAKIS E，RANFTL Q L，et al.Functional diversification within the family of B－GATA transcription factors through the leucine－leucine－methionine domain［J］.Plant Physiology，2014，166（1）：293－305.

［24］ KAUMANN K，MUINO J M，JAUREGUI R，et al.Target genes of the MADStranscription factor SEPALLATA3：Integration of developmental and hormonal pathways in the arabidopsis flower［J］.PLoS Biology，2009，7（4）：854－875.

［25］ ZONDLO S C，IRISH V F.CYP78A5encodes a cytochrome P450that marks the shoot apical meristem boundary in Arabidopsis［J］.The Plant Journal，1999，19（3）：259－268.

（編輯：宋亞珍）

Molecular Characterization，Phenotype Investigation and Expression Analysis of a New Giant Embryo Allele

PING Baozhe，SHI Yaqiong，XIE Mixue，ZHANG Xin，WANG Xin，ZHANG Tao，LI Jianyue＊
（Development Center of Plant Germplasm Resources，College of Life and Environment Sciences，Shanghai Normal University，Shanghai 200234，China）

In this paper，we used normal embryo rice‘Chao2－10’and giant embryo rice‘Shangshida No.5’as materials.The embryo weight and mass ratio of embryo to brown rice of‘Shangshida No.5’were compared with those of‘Chao2－10’.Then we did the genetic analysis of giant embryo phenotype.Giant embryo gene（GE）of‘Shangshida No.5’，‘Chao2－10’and Korea giant embryo rice‘M－2－565－11－3－B（ge）’were cloned to analyse their sequence.The expression levels of GEgene in‘Shangshida No.5’，‘Chao2－10’were analysed by Real time－PCR with the‘Nipponbare’as a control.The results were as follows：（1）Both embryo weight and mass ratio of embryo of brown rice‘Shangshida No.5’were significantly larger than these of‘Chao2－10’（P＜0.01）.However，embryo weight of the‘Chao2－10’is close to or more than some of the giant embryo rice cultivars reported previously；（2）Giant embryo phenotype of‘Shangshida No.5’is controlled by a single recessive gene，which is same to‘M－2－565－11－3－B（ge）’；（3）GEgene in these three cultivars is also a newGEallele：‘Chao2－10’has a mutation（gep）in the promoter；‘Shangshida No.5’has mutations（gec）both in the promoter and CDS；‘M－2－565－11－3－B（ge）’only has a mutation（geh）in CDS；（4）The expression pattern of the gecin young caryopses was different from other GEalleles reported，which increase steadily from 4day to 7day after flowering.This paper first reported two new GEalleles，one is mutated in the promoter，and the other has mutations in both promoter and CDS.

giant embryo gene；‘Shangshida No.5’；‘Chao2－10’；‘M－2－565－11－3－B（ge）’；new allele；expression analysis

Q789

A

1000－4025（2015）08－1518－06

10.7606／j.issn.1000－4025.2015.08.1518

2015－04－07；修改稿收到日期：2015－06－08

上海市科委項(xiàng)目（063919141）

平寶哲（1988－），男，碩士，主要從事分子遺傳學(xué)與基因工程研究。E－mail：18217098045＠163.com

＊通信作者：李建粵，副教授，主要從事分子遺傳學(xué)與基因工程研究。E－mail：lijianyue01＠aliyun.com