六味地黃湯輔助環(huán)磷酰胺對荷H22小鼠肝癌組織VEGF及VEGFR2蛋白表達(dá)的影響*

★　謝斌　余功　饒斌　劉紅寧　(江西中醫(yī)藥大學(xué)　南昌 330004)

六味地黃湯輔助環(huán)磷酰胺對荷H22小鼠肝癌組織VEGF及VEGFR2蛋白表達(dá)的影響*

★謝斌*第一作者：謝斌,博士,副教授，碩士生導(dǎo)師。研究方向：中醫(yī)藥抗腫瘤。余功饒斌劉紅寧*通信作者：劉紅寧,博士,教授。研究方向：中醫(yī)基礎(chǔ)理論。E-mail: lhongnin@yahoo.com.cn。(江西中醫(yī)藥大學(xué)南昌 330004)

摘要：目的：觀察六味地黃湯輔助環(huán)磷酰胺對荷H22肝癌小鼠肝癌組織VEGF及VEGFR2蛋白表達(dá)的影響。方法：雄性昆明小鼠40只，隨機(jī)分為模型組、化療組、六味組、六味化療聯(lián)合組，每組10只。腋下注射H22細(xì)胞建立H22荷瘤模型，六味組造模前兩周開始用藥[劑量為22 g/(kg·d)]，化療組[劑量為50mg/(kg·d),隔日1次]及六味化療組造模后用藥，造模14 d后處死小鼠稱重，取瘤組織稱重計(jì)算抑瘤率，取脾組織稱重計(jì)算脾指數(shù)，免疫組化檢測VEGF與VEGFR2蛋白的表達(dá)。結(jié)果：化療組與六味化療聯(lián)合組有良好的抑瘤作用；六味組脾指數(shù)增大，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，六味化療聯(lián)合組VEGF蛋白表達(dá)明顯減少，與化療組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與六味組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；六味化療聯(lián)合組VEGFR2蛋白表達(dá)減少，與模型組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與六味組比較,有顯著性差異(P<0.01)。結(jié)論：六味地黃湯輔助環(huán)磷酰胺可抑制荷H22肝癌小鼠組織VEGF與VEGFR2蛋白表達(dá)，減少肝癌組織血管增殖，從而發(fā)揮輔助化療作用。

關(guān)鍵詞：肝癌；六味地黃湯；環(huán)磷酰胺；VEGF；VEGFR2

臨床上六味地黃湯與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用既可使化療藥物增效，又能降低各種化療毒副作用，具有良好的對癥輔助治療效果[1-2]。然而，六味地黃湯輔助化療藥物的作用機(jī)理卻鮮有報(bào)導(dǎo)，本課題前期研究表明,六味地黃丸與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用有較好的抑瘤作用,故在前期研究基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步探究六味地黃湯輔助環(huán)磷酰胺對荷H22肝癌小鼠VEGF與VEGFR2蛋白表達(dá)的影響，從抑制腫瘤血管增殖生的角度，探討該方對化療藥物輔助作用的起效機(jī)制。

1材料和方法

1.1動(dòng)物及瘤株動(dòng)物：SPF級雄性KM小鼠,體重(20±2)g,江西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK(贛)2011-0001。

瘤株：小鼠H22肝癌細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤細(xì)胞庫提供。

1.2藥物及制備六味地黃湯：熟地15 g，山茱萸12 g，山藥12 g，丹皮10 g，澤瀉10 g，茯苓10 g(購自江西省中醫(yī)院中藥房)。將以上中藥加10倍量的清水浸泡1 h,然后煎煮，水沸后以小火煎40 min，過濾；第二次加8倍量的清水煎熬，水沸后小火煎40 min，過濾，合并濾液，常壓濃縮至69 mL(即每毫升藥液含1 g原藥)，冷卻后密封，4 ℃保存?zhèn)溆?。?shí)驗(yàn)藥物濃度22 g/(kg·d)。陽性藥物為注射用環(huán)磷酰胺(Cyclophosphamide, CTX，批號：13111325，0.2 g/瓶，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司提供)。CTX藥物濃度為50 mg/(kg·d),隔日1次。

1.3試劑及儀器抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(Dako Denmark A/S，批號：20140425)；VEGFR2一抗(Affnity，批號：00017012)；VEGF一抗(Proteintech，批號：19003-1-AP)；二抗HRP標(biāo)記山羊抗兔(谷歌生物，批號：20140415)；BSA(Roche，批號：3200687)；倒置顯微鏡(LEICA,DMI3000B)；切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，RM2016)；烘箱(上海福瑪實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司，DGX-9003B)；脫色搖床(北京六一儀器廠，WD-9405A)；普通光學(xué)顯微鏡(重慶光電儀器有限公司，XSP-C204)。

1.4動(dòng)物處理

1.4.1肝癌H22細(xì)胞接種方法小鼠肝癌H22細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代：將腹水型小鼠肝癌H22細(xì)胞,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱，用含10% FCS的RPMI1640完全培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)。取最佳生長狀態(tài)的小鼠肝癌H22細(xì)胞，濃度調(diào)為5×106個(gè)/mL，以0.2 mL/只(1×106個(gè)細(xì)胞/只)無菌注入小鼠腹腔進(jìn)行接種傳代，于接種7～9 d,小鼠腹部膨隆出現(xiàn)腹，可用于小鼠皮下移植瘤的接種。

1.4.2動(dòng)物模型制作荷H22肝癌小鼠模型的建立：將接種H22瘤種7～9 d，腹部隆起明顯的腹水瘤小鼠以脫頸法處死，無菌條件下從腹腔抽出瘤液，以無菌生理鹽水稀釋后，1500 r/min離心5 min，調(diào)整瘤細(xì)胞濃度為5×106個(gè)/mL，于小鼠右腋下行皮下無菌接種，接種量為每只0.2 mL/只。

1.4.3動(dòng)物分組造模結(jié)束后，小鼠隨機(jī)分為模型組、化療組、六味組、六味化療聯(lián)合組，每組10只。

1.4.4給藥模型組：接種24 h后，以0.2 mL生理鹽水灌胃，q12 h；化療組：接種24 h后，CTX以50 mg/(kg·d)劑量隔日腹腔注射；六味組：造模前兩周即開始按22g/(kg·d)灌胃給藥，q12 h；六味化療聯(lián)合組：接種24 h后，六味按22g/(kg·d)灌胃給藥，q12 h，CTX以50 mg/(kg·d)劑量隔日腹腔注射。2 w后處死各組小鼠并稱重，取瘤組織及脾臟稱重。

1.5免疫組織化學(xué)法腫瘤組織檢測VEGF，VEGFR2蛋白的表達(dá)水平方法如下：組織切片、脫蠟、水化、洗滌、抗原修復(fù)、洗滌、滅活酶、洗滌、5% BSA封閉、一抗分別為VEGF(1∶100)、VEGFR2(1∶100)，4 ℃過夜孵育14 h；第2日室溫復(fù)溫3 h后，PBS漂洗3×5 min；加入二抗，4℃孵育50 min；漂洗，DAB顯色；漂洗，蘇木素復(fù)染，貼片，脫水和透明，中性樹膠封片。以LEICA倒置顯微鏡拍照，每張標(biāo)本按順序選5個(gè)視野，使用Image-Pro Plus 6.0軟件分析，用平均光密度(D)表示陽性物質(zhì)的相對含量。

2結(jié)果

2.1六味地黃湯輔助CTX對荷H22肝癌小鼠抑瘤率及脾指數(shù)的影響結(jié)果見表1。結(jié)果表明：化療組及六味化療聯(lián)合組均具有明顯的抑瘤作用；六味組脾指數(shù)增大，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，六味組、六味化療聯(lián)合組的脾指數(shù)均高于化療組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表1　六味地黃湯聯(lián)合CTX

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與化療組比較,#P<0.05,##P<0.01;與六味組比較▲P<0.05;注：實(shí)驗(yàn)過程中，化療組及六味化療聯(lián)合組有1只小鼠死亡。

2.2六味地黃湯輔助CTX對荷H22肝癌小鼠VEGF，VEGFR2蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見表2和圖1。結(jié)果顯示：聯(lián)合組VEGF蛋白表達(dá)明顯減少，與化療組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，與六味組相比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組VEGFR2蛋白表達(dá)減少，與模型組比較，有顯著性差異(P<0.05)；與六味組比較,有顯著性差異(P<0.01)。六味組VEGF蛋白表達(dá)增高，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表2六味地黃湯輔助CTX對荷H22肝癌小鼠

組別VEGF光密度VEGFR2光密度模型組0.149±0.0310.088±0.017化療組0.166±0.0220.064±0.019*六味組0.172±0.030*0.093±0.012##六味化療組0.129±0.025#▲0.055±0.021**▲▲

注：與模型組比較,*P<0.05,**P<0.01;與化療組比較,#P<0.05,##P<0.01;與六味組比較,▲P<0.05,▲▲P<0.01。

圖1　各組小鼠VEGF、VEGFR2蛋白表達(dá)切片圖

3討論

血管增生是惡性腫瘤生長與轉(zhuǎn)移過程中的重要一環(huán)，惡性腫瘤生長必須依賴血管的不斷形成，沒有血管生成腫瘤就不能增殖[3]。因此抑制血管增生對惡性腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)后具有至關(guān)重要的作用。而在眾多對新生血管的形成具有調(diào)控作用的因子中，血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是作用最強(qiáng)的正性調(diào)控因子之一，它與相應(yīng)血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGF receptor，VEGFR)結(jié)合后，通過特定的信號傳導(dǎo)途徑刺激內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，從而促進(jìn)新生血管的形成[4]VEGF是誘導(dǎo)腫瘤血管形成的作用最強(qiáng)、特異性最高的血管生長因子,且無論在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞中，還是在腫瘤細(xì)胞接種荷瘤裸鼠動(dòng)物模型的腫瘤細(xì)胞中,或是在人體癌組織中均有VEGF的高表達(dá)[5]。VEGF能特異性地作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，參與腫瘤血管的新生[6-7]，并提高血管通透性，引起周圍組織纖維蛋白沉著，促進(jìn)單核細(xì)胞，成纖維細(xì)胞內(nèi)皮細(xì)胞侵潤，有利于腫瘤基質(zhì)形成和腫瘤細(xì)胞進(jìn)入新生血管，促進(jìn)腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移。VEGFR2是VEGF的主要功能受體，主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞以及腫瘤間質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上和胞質(zhì)內(nèi),其與VEGF結(jié)合形成二聚體及酪氨酸發(fā)生自身磷酸化,激活并將細(xì)胞膜/細(xì)胞質(zhì)激酶級聯(lián)反應(yīng)信號傳遞到細(xì)胞核,可引發(fā)內(nèi)皮細(xì)胞的一系列變化,這些級聯(lián)反應(yīng)通過抗凋亡等機(jī)制調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的存活,促進(jìn)新生血管形成并維持其完整性[8]。有研究表明，VEGF與VEGFR2的高表達(dá)與癌組織有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及肝癌的分化程度密切相關(guān)[9]。因此檢測VEGF與VEGFR2表達(dá)可作為判斷腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移、預(yù)后等生物學(xué)行為的參考指標(biāo)。

環(huán)磷酰胺是臨床常用的化療藥，其能有效地殺傷癌細(xì)胞，但荷瘤小鼠的體重下降，精神、飲食都比較差。六味地黃湯是中醫(yī)滋陰經(jīng)典方劑，由熟地黃、山茱萸、山藥、澤瀉、茯苓、牡丹皮組成，功效滋補(bǔ)肝腎，主治肝腎陰虛，臨床常用該方作為化療輔助藥物。現(xiàn)代藥理研究證實(shí)，該方具有抗腫瘤、抗化療藥物毒性、保肝等作用[10]。故本實(shí)驗(yàn)六味地黃湯輔助化療的起效機(jī)理進(jìn)行了初步的探索，研究結(jié)果顯示，六味地黃湯與化療藥物聯(lián)用能有效減少VEGF及其受體VEGFR2表達(dá)，效果優(yōu)于單獨(dú)使用化療藥物組；由此推測，在與化療的聯(lián)合治療方案中，六味地黃湯的輔助作用可明顯降低荷瘤小鼠肝癌組織中VEGF與VEGFR2蛋白表達(dá)，破壞腫瘤血管的生成，從而達(dá)到輔助化療藥物抑制腫瘤增殖的功效。該研究結(jié)果可能為六味地黃湯在臨床肝癌的輔助治療作用提供一些理論依據(jù)。同時(shí)，在本次研究中我們也發(fā)現(xiàn)單用六味組VEGF與VEGFR表達(dá)增高，這一現(xiàn)象仍有待進(jìn)一步研究。

參考文獻(xiàn)

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Effect of Liuwei Dihuang Decoction for Assisting Cyclophosphamide on VEGF, VEGFR2 Expression in H22 Tumor-bearing Rats

XIE Bin, YU Gong, RAO Bin, LIU Hong-ning

JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China.

Abstract:Objective: To observe the effect of Liuwei Dihuang decoction (LW) for assisting cyclophosphamide(CTX) on VEGF, VEGFR2 expression in H22 tumor-bearing mice. Methods: 40 male Kunming mice were randomly divided into model group, CTX group, LW group, the LW combined CTX group, 10 rats in each group. The establishment of H22 tumor model by axillary injection of H22 cells, LW group began to use medication of two weeks before molding [dose of 22 g/(kg·d)], CTX group [at a dose of 50mg/(kg·d), every other day for 1 time] and LW group for drug after molding.Put the mice to death after 14 days of the group establishment,then take weighing, take tumor tissue weighing to calculate tumor-inhibition rate, spleen tissue weighing to calculate the spleen index, make the protein expression after immunohistochemical detection of VEGF, VEGFR2.Results: the CTX group and combination group had a significant role in inhibiting tumor;LW group spleen index increased, the difference being statistically significant compared to the model group(P<0.05),combination group's VEGF protein expression decreased obviously,compared with CTX group,the difference was statistically significant (P<0.05),compared with LW group,the difference was statistically significant (P<0.05);combination group's VEGFR2 protein expression decreased obviously, compared with the model group, there was statistical significance difference (P<0.05);compared with LW group,there was significant difference (P<0.01).Conclusion:The LW could enhance the antitumor effects of CTX. Its mechanism may be related to the combination which can reach the synergistic inhibitory effects of VEGF and VEGFR2 protein expression.

Key words:Cancer of the Liver; Liuwei Dihuang Decoction; Cyclophosphamide; VEGF; VEGFR2

收稿日期：(2015-01-13)編輯：曾文雪

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

基金項(xiàng)目：*國家自然科學(xué) (81260523)；江西省研究生創(chuàng)新 (YC2014-S275)；江西中醫(yī)藥大學(xué)研究生創(chuàng)新 (JZYC14A02)。