IP3R介導(dǎo)的鈣釋放在DI發(fā)生中的作用研究*

鄭霽 方強(qiáng) 陳志文 陳志朋 何鵬 鄧國(guó)賢 代林勇 潘進(jìn)洪

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院·全軍泌尿外科研究所, 重慶 400038)

IP3R介導(dǎo)的鈣釋放在DI發(fā)生中的作用研究*

鄭霽 方強(qiáng) 陳志文 陳志朋 何鵬 鄧國(guó)賢 代林勇 潘進(jìn)洪

(第三軍醫(yī)大學(xué)西南醫(yī)院·全軍泌尿外科研究所, 重慶 400038)

目的 探討IP3R的功能改變是否參與了逼尿肌不穩(wěn)定(DI)的發(fā)生。方法 對(duì)比分析DI和對(duì)照組大鼠膀胱平滑肌IP3R mRNA和蛋白表達(dá)的變化，觀察IP3R阻斷劑Heparin對(duì)DI和對(duì)照組膀胱平滑肌條收縮幅度和頻率的影響。 結(jié)果 DI逼尿肌細(xì)胞IP3R mRNA和蛋白表達(dá)較對(duì)照組顯著增加。IP3R阻斷劑Heparin能顯著抑制DI、正常組大鼠逼尿肌肌條自發(fā)收縮頻率及收縮幅度，且Heparin對(duì)DI逼尿肌條的影響效應(yīng)要顯著高于正常組。結(jié)論 IP3R功能在DI逼尿肌組織興奮、收縮發(fā)生中明顯上調(diào)，這種上調(diào)在DI的發(fā)生中起著重要作用。

IP3R； 鈣離子通道； 逼尿肌不穩(wěn)定； 尿動(dòng)力學(xué)

正常成年人只在排尿期出現(xiàn)逼尿肌收縮而在儲(chǔ)尿期不會(huì)出現(xiàn)逼尿肌收縮,如果在儲(chǔ)尿期出現(xiàn)具有一定強(qiáng)度(≥15 cm H2O)、人為意識(shí)不能抑制的逼尿肌收縮即稱為逼尿肌不穩(wěn)定(detrusor instability,DI)。DI發(fā)病率高，臨床治療效果欠佳，已經(jīng)成為一個(gè)較為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題[1]。鈣離子及其相關(guān)鈣離子通道是包括逼尿肌細(xì)胞在內(nèi)的平滑肌收縮和興奮性調(diào)控的重要傳導(dǎo)介質(zhì)和通路[2]。IP3受體通道(inositol 1,4,5-trisphosphate receptor，IP3R)可參與釋放肌漿網(wǎng)(SR, sarcoplasmic reticulum )鈣庫(kù)鈣，是調(diào)控平滑肌細(xì)胞收縮的關(guān)鍵通道之一。本研究旨在探討IP3R的功能改變是否參與了DI的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 3～4月齡雌性Wistar大鼠30只, 體質(zhì)量180～200g, 購(gòu)自第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 制作DI模型 1%苯巴比妥( 40mg/kg) 腹腔注射麻醉, 下腹部正中切口,直徑為1mm的聚乙烯探子插入尿道, 近端尿道稍作分離, 2-0絲線結(jié)扎尿道, 松緊以牽拉探子周圍組織可隨之移動(dòng), 而探子又可輕易拔出為度, 拔出探子, 關(guān)閉切口。對(duì)照組除不予結(jié)扎尿道外其余操作均同上。

1.3 尿動(dòng)力學(xué)檢查 所有動(dòng)物均行膀胱壓力容積測(cè)定( 膀胱灌注速率為0.2ml/min), 記錄膀胱壓力波形、大小變化, 根據(jù)尿動(dòng)力學(xué)檢查結(jié)果將大鼠分為DI組和對(duì)照組。

1.4 離體逼尿肌條試驗(yàn) 猛擊大鼠頭部致昏, 剪開(kāi)下腹部, 全切膀胱, 稱質(zhì)量。即刻置入盛有4℃Krebs營(yíng)養(yǎng)液的平皿中, 每個(gè)膀胱制作2～3 根肌條。Krebs 液中通95% O2、5%CO2, 肌條靜置30 min 后進(jìn)行以下試驗(yàn), 記錄肌條的收縮力和收縮頻率。每步試驗(yàn)后更換肌條。

1.5 IP3R mRNA的檢測(cè) IP3R1引物序列：上游引物5′-ACCAGTTGGCTCGGCATA-3′，下游引物5′-TGGGCACAGGGAAGACAA-3′。IP3R2引物序列：上游引物5′-ATGT GGCTCAAATGATTGTGGA-3′下游引物5′-ATGTGGCT CAAATGATTGTGGA- 3′。GADPH引物序列:上游引物5′-CATC AC TGCCACCCAGAAGAC-3′下游引物5′-ACTCCT T GGAGGCC ATGT AGAC-3′。

將標(biāo)本加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液中， 42℃反轉(zhuǎn)錄50 min，95℃ 5 min 滅活反轉(zhuǎn)錄酶。在將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品加入PCR 反應(yīng)液中，PCR 熱循環(huán)參數(shù): 96℃ 4 min，然后三步反應(yīng): 94℃ 30s， 58℃ 30 s， 72℃ 30 s，進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)，于每個(gè)循環(huán)的第3 步即72℃ 30 s 收集熒光信號(hào)。擴(kuò)增完畢后，進(jìn)入結(jié)果分析界面，以GAPDH 為內(nèi)參照基因，與對(duì)照組相比，得到目的基因表達(dá)的相對(duì)定量值( RQ 值)，將RQ值用于統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 IP3R蛋白的Western blot檢測(cè) 將離心管中的細(xì)胞加入RIPA 裂解液勻漿。冰浴反應(yīng)30 min; 4℃，8 000 r /min 離心10 min，取上清( 即蛋白提取液) 加入PMSF 調(diào)至終濃度為1%，-20℃ 保存。取少量蛋白提取液，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物，采用改良酚試劑法，檢測(cè)其中總蛋白含量。并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，應(yīng)用5% 脫脂奶粉封閉，隨后置于IP3RⅠ或IP3R II一抗中。室溫洗膜，共3 次。之后置入二抗溶液中，抗體結(jié)合區(qū)帶用化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)定量值( IOD 值)，將IOD 值用于統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

發(fā)現(xiàn)DI逼尿肌細(xì)胞IP3R mRNA(圖1)和蛋白(圖2)表達(dá)較對(duì)照組顯著增加。發(fā)現(xiàn)IP3R 阻斷劑 Heparin(圖3) 能顯著抑制DI、正常組大鼠逼尿肌肌條自發(fā)收縮頻率及收縮幅度，且Heparin對(duì)DI逼尿肌條的影響效應(yīng)要顯著高于正常組(圖3)，提示IP3R功能在DI逼尿肌組織興奮、收縮發(fā)生中明顯上調(diào)。

圖1 DI后逼尿肌細(xì)胞IP3R mRNA表達(dá)顯著增加

Figure 1 The increased IP3R mRNA

圖2 DI后逼尿肌細(xì)胞IP3R 蛋白表達(dá)顯著增加

Figure 2 The increased IP3R protein

3 討論

鈣離子及其相關(guān)鈣離子通道是包括逼尿肌細(xì)胞在內(nèi)的平滑肌收縮和興奮性調(diào)控的重要傳導(dǎo)介質(zhì)和通路[2]。平滑肌細(xì)胞收縮依賴于細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度瞬時(shí)增加，平滑肌細(xì)胞內(nèi)的鈣通常有兩個(gè)來(lái)源，一是動(dòng)作電位期間經(jīng)細(xì)胞膜電壓依賴性鈣通道(VDCC)或其它非選擇性離子通道內(nèi)流入胞的細(xì)胞外鈣，另一個(gè)來(lái)源是由肌漿網(wǎng)(SR, sarcoplasmic reticulum )鈣庫(kù)內(nèi)通過(guò)Ryanodine受體通道(RyR, Ryanodine receptor)和IP3受體通道(IP3R, inositol 1,4,5-trisphos-

圖3 IP3 blocker(Heparin)可明顯抑制DI逼尿肌組織自發(fā)性收縮頻率和幅度。DI逼尿肌受抑制程度顯著高于對(duì)照組逼尿肌。

Figure 3 IP3 blocker inhibited fasciculation of detrusor muscle

phate receptor )釋放的細(xì)胞內(nèi)鈣[3]。

平滑肌細(xì)胞興奮收縮時(shí)，SR中鈣通過(guò)IP3R通道和/或RyR通道釋放可將細(xì)胞外鈣內(nèi)流的信號(hào)顯著擴(kuò)大，迅速引起細(xì)胞內(nèi)更大峰度的鈣離子濃度升高[4]，從而引起細(xì)胞收縮。而SR中的鈣離子釋放也可通過(guò)作用胞膜上的鈣離子激活鉀/氯離子通道(Ca2+activated K+/Cl-Channel, Kca/Kcl)[5]，影響細(xì)胞膜電位和細(xì)胞外鈣通過(guò)VDCC內(nèi)流入胞。此外細(xì)胞膜電位和細(xì)胞內(nèi)的鈣濃度也可通過(guò)影響細(xì)胞內(nèi)源性IP3的生成，從而調(diào)控SR中鈣離子釋放[6]。這表明平滑肌細(xì)胞興奮、收縮時(shí)，通過(guò)鈣離子及胞膜、肌漿網(wǎng)上相關(guān)鈣通道，細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流入胞與肌漿網(wǎng)(SR)中鈣離子釋放入胞漿可相互關(guān)聯(lián)和影響，從而調(diào)控平滑肌的收縮和興奮性。

有研究證實(shí)，RyR通道和IP3R通道介導(dǎo)的SR中鈣釋放均參與逼尿肌自發(fā)性收縮的發(fā)生[7]。我們既往研究證實(shí),RyR通道功能下調(diào)，從而導(dǎo)致介導(dǎo)的SR中鈣釋下降參與了DI的發(fā)生[8]。但I(xiàn)P3R通道功能的變化是否參與DI的發(fā)生，目前國(guó)內(nèi)外尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)IP3R 阻斷劑 Heparin能顯著抑制DI、正常組大鼠逼尿肌肌條自發(fā)收縮頻率及收縮幅度，且Heparin對(duì)DI逼尿肌條的影響效應(yīng)要顯著高于正常組，提示IP3R功能在DI逼尿肌組織興奮、收縮發(fā)生中明顯上調(diào)。IP3R功能上調(diào)在DI的發(fā)生中起重要作用。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果顯示，IP3R通道和/或RyR通道均可被鈣離子所激活，IP3R通道和RyR通道除了單獨(dú)發(fā)揮介導(dǎo)SR中的鈣釋放外，兩者之間很可能具有相互激活、相互促進(jìn)的作用(IP3R-RyR Cross talk)[9]。鑒于平滑肌細(xì)胞中存在IP3R-RyR cross talk介導(dǎo)的肌漿網(wǎng)中鈣釋放， 且該Cross talk效應(yīng)介導(dǎo)的鈣釋放很可能對(duì)膀胱平滑肌細(xì)胞收縮和興奮性具有重要調(diào)控作用，我們推測(cè)，DI逼尿肌組織中，除單純IP3R介導(dǎo)的SR中鈣釋放外，IP3R-RyR交叉對(duì)話介導(dǎo)的鈣釋放功能上調(diào)也可能是DI逼尿肌細(xì)胞興奮、收縮異常增強(qiáng)發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，值得進(jìn)一步深入研究。

[1]Buser N, Ivic S, Kessler TM, Kessels AG, Bachmann LM. Efficacy and adverse events of antimuscarinics for treating overactive bladder: network meta-analyses[J]. Eur Urol， 2012，62(6):1040-1060.

[2]Andersson KE. Sellers DJ, Chess-Williams R. Muscarinic agonists and antagonists: effects on the urinary bladder[J]. Handb Exp Pharmacol， 2012，(208):375-400.

[3]Fry CH, Young JS, Jabr RI,etal.Modulation of spontaneous activity in the overactive bladder: the role of P2Y agonists[J].Am J Physiol Renal Physiol， 2012，302(11):F1447-1454.

[4]Sui G, Fry CH, Malone-Lee J,etal. Suppression of human detrusor smooth muscle excitability and contractility via pharmacological activation of large conductance Ca2+-activated K+channels[J]. Am J Physiol Cell Physiol， 2012，302(11):C1632-1641.

[5]Li L, Jiang C, Song B,etal.Altered expression of calcium-activated K and Cl channels in detrusor overactivity of rats with partial bladder outlet obstruction[J].BJU Int， 2008，101(12):1588-1594.

[6]Andersson KE. Sellers DJ, Chess-Williams R. Muscarinic agonists and antagonists: effects on the urinary bladder[J]. Handb Exp Pharmacol， 2012，(208):375-400.

[7]McCarthy CJ, Zabbarova IV, Brumovsky PR,etal.Spontaneous contractions evoke afferent nerve firing in mouse bladders with detrusor overactivity[J].J Urol, 2009,181(3):1459-1466.

[8]Jiang HH, Song B, Lu GS,etal. Loss of ryanodine receptor calcium-release channel expression associated with overactive urinary bladder smooth muscle contractions in a detrusor instability model[J]. BJU Int, 2005,96:428-433.

[9]Tjondrokoesoemo A, Li N, Lin PH,etal.Type 1 inositol (1,4,5)-trisphosphate receptor activates ryanodine receptor 1 to mediate calcium spark signaling in adult Mammalian skeletal muscle[J].J Biol Chem, 2013,288(4):2103-2109.

Role of IP3R mediated Ca2+release in detrusor instability

ZHENG Ji, FANG Qiang, CHEN Zhi-peng,etal

(InstituteofUrinarySurgery,SouthwestHospital,TheThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400038)

Objective To investigate the role of IP3R mediated Ca2+release in detrusor instability. Methods The expression of IP3R mRNA and protein were tested from rat detrusor of DI and control group group. The effect of IP3R blocker heparin on detrusor strips were then recorded for further analysis. Results Compared with control group, the expression of IP3R mRNA and protein were significantly increased in detrusor strips from DI group. Heparin can significantly inhibited the frequency and amplitude of spontaneous contractile activity in both the DI and control strips. The inhibit effect by heparin was more obvious in DI group. Conclusion The elevated expression and function of IP3R contributed to detrusor instability.

IP3R; Ca2+channel; Detrusor instability; Urodynamic

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金(NSFC81100539)

陳志文，Tel:13983602535

R 446.8

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2015.02.003

2014-11-03； 編輯： 張文秀)