響應(yīng)面優(yōu)化黃色蠶繭超聲輔助酶法脫膠工藝

邵雙雙，賀亮，韋朝陽(yáng)，李衛(wèi)旗*

(1.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州310058；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)所，杭州310023)

響應(yīng)面優(yōu)化黃色蠶繭超聲輔助酶法脫膠工藝

邵雙雙1，賀亮2，韋朝陽(yáng)1，李衛(wèi)旗1*

(1.浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，杭州310058；2.浙江省林業(yè)科學(xué)研究院生物技術(shù)所，杭州310023)

對(duì)黃色蠶繭超聲輔助酶法脫膠工藝進(jìn)行研究。在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇對(duì)蠶繭脫膠率有顯著影響的3個(gè)因素：pH(X1)、酶加量(X2)、超聲功率(X3)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。最終確定最優(yōu)條件為：pH5.5、酶加量5.5%(E/S)、超聲功率390W、超聲處理時(shí)間35min、溫度60℃、料液比1∶30(m/v)。并且該最佳條件下脫膠率(37.62±0.34%)和脫下的絲膠蛋白DPPH自由基清除率(IC502.41±0.078 mg/mL)、類胡蘿卜素含量(0.34±0.038 mg/g)和黃酮含量(0.59±0.062 mg/g)均高于水浴煮沸脫膠和酶法脫膠，進(jìn)一步表明了超聲輔助酶法脫膠的優(yōu)越性。

黃色蠶繭；脫膠；超聲波；酶法；響應(yīng)面

目前，超聲波處理技術(shù)廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。超聲輔助酶解制備中的應(yīng)用主要是通過(guò)超聲波能量作用于反應(yīng)體系改變各個(gè)組成部分的作用方式，提高產(chǎn)物的合成效率來(lái)實(shí)現(xiàn)的[1]。蛋白酶是一種無(wú)毒無(wú)害、高效環(huán)保的生物催化劑，用蛋白酶對(duì)蠶繭脫膠已經(jīng)是脫膠工藝發(fā)展的重點(diǎn)，其中木瓜蛋白酶對(duì)蠶繭脫膠的綜合效果最好[2]。

天然彩色蠶繭色素主要來(lái)源于桑葉或蠶體內(nèi)自身的合成，主要包含類胡蘿卜素，且其繭層中還含有葉黃素、黃酮、絲膠蛋白等活性物質(zhì)。國(guó)內(nèi)對(duì)彩色繭提取物抑菌活性及其抗氧化活性的研究也越來(lái)越多[3-4]，而且絲膠作為食品、化妝品添加劑也具有重要的應(yīng)用價(jià)值，天然彩色蠶繭的利用不僅對(duì)人們健康有益，而且符合當(dāng)前消費(fèi)新理念[5]。

目前，國(guó)內(nèi)對(duì)超聲輔助酶解法提取的研究越來(lái)越多[6-7]，但對(duì)天然黃色繭脫膠工藝的研究比較少。所以對(duì)黃色蠶繭超聲輔助酶法脫膠工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，并對(duì)脫膠后絲膠蛋白DPPH自由基清除率及其類胡蘿卜素和黃酮含量進(jìn)行測(cè)定，為黃色蠶繭的深度開(kāi)發(fā)和綜合利用提供科學(xué)依據(jù)，使其更好服務(wù)于人類生活。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃色蠶繭下腳料湖州農(nóng)科院；木瓜蛋白酶(≥3units/mg)，1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 購(gòu)自上海阿拉丁試劑公司；其它試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-500DB型超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；HHS型電熱恒溫水浴鍋 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠出品；Sartorius BSA224S型電子分析天平 北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；U-1900型可見(jiàn)分光光度計(jì) 日本HITACHI公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 脫膠率計(jì)算[8]。將脫膠前后的蠶繭烘干后放入玻璃干燥器中，于室溫下平衡30 min后稱得的質(zhì)量為脫膠前后的干質(zhì)量，脫膠率計(jì)算如式：

1.3.2 超聲波輔助酶法脫膠單因素實(shí)驗(yàn)。分別以不同的超聲處理時(shí)間、料液比、溫度、pH、酶加量及超聲功率為單因素，考察各單因素對(duì)黃色蠶繭脫膠率的影響。單因素基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)條件是：超聲處理30 min，溫度50℃，pH為6，酶加量為1%(E/S)，料液比為1∶40(m/v)，超聲功率為200W，脫膠1 h。各因素取值范圍：超聲時(shí)間20、25、30、35、40、45 min；溫度40、50、60、70、80℃；pH 3、4、5、6、7、8；酶加量1%、3%、4%、5%、6%、7%(E/S)；料液比1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60(m/v)；超聲功率為200、250、300、400、500W。脫膠完成后，將蠶繭取出用 40℃左右的去離子水洗滌3次，并在105℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，計(jì)算脫膠率。

1.3.3 超聲波輔助酶法脫膠單因素實(shí)驗(yàn)。 在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇對(duì)脫膠率影響顯著的pH、酶加量和超聲功率3個(gè)因素，以脫膠率為響應(yīng)值，通過(guò)響應(yīng)面法(Response Surface Method，RSM)進(jìn)行提取條件的優(yōu)化，并運(yùn)用design-expert 8.0軟件分析得到最優(yōu)制備條件。實(shí)驗(yàn)因素和水平如表1。

表1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素及水平

1.3.4 超聲波輔助酶法與傳統(tǒng)法對(duì)黃色蠶繭脫膠比較

1.3.4.1 水浴煮沸脫膠[9]。稱取50g的黃色蠶繭，置于料液比1∶40(m/v)的蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7，在電熱恒溫爐中加熱煮沸脫膠1h后，取出用 40℃左右的去離子水洗滌3次，在105℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，計(jì)算脫膠率。洗滌液與原脫膠液混合，離心(2000 r/min，10 min)，濃縮，干燥得絲膠蛋白粉末。

1.3.4.2 酶法脫膠[10]。稱取50 g的黃色蠶繭，置于料液比為1∶40(m/v)，溫度50℃，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%(E/S)的木瓜蛋白酶溶液，調(diào)節(jié)pH為7，脫膠1 h后，取出用 40℃左右的去離子水洗滌3次，蠶繭在105℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，計(jì)算脫膠率。洗滌液與原脫膠液混合，滅酶，離心(2000 r/min，10 min)，濃縮，干燥得絲膠蛋白粉末。

1.3.4.3 超聲輔助酶法脫膠。稱取50g的黃色蠶繭，在響應(yīng)面優(yōu)化后的條件下脫膠，總脫膠時(shí)間為1 h，蠶繭取出用40℃左右的去離子水洗滌3次，在105 ℃烘箱內(nèi)烘干至恒重，計(jì)算脫膠率。洗滌液與原脫膠液混合，滅酶，離心(2000 r/min，10 min)，濃縮，干燥得絲膠蛋白粉末。

1.3.5 最優(yōu)條件下得到的絲膠蛋白與傳統(tǒng)法得到的絲膠蛋白比較

1.3.5.1 絲膠蛋白DPPH自由基清除率測(cè)定[11]。1.0 mL DPPH(0.2 mM)與1.0 mL的樣品混勻，室溫靜置30 min，于517 nm處測(cè)定吸光值。

A0為空白樣品吸光值，As加樣后的吸光值，Aj為以蒸餾水代替DPPH的吸光值

1.3.5.2 類胡蘿卜素含量測(cè)定[12]。稱取絲膠蛋白粉0.5g于三角瓶中，用30倍體積的石油醚：丙酮(1∶1，v/v)浸提3次，過(guò)濾，合并濾液，定容到一定體積，在450nm處測(cè)吸光值，計(jì)算絲膠蛋白中類胡蘿卜素含量。

式中：X為類胡蘿卜素含量，A為450 nm處吸光值，y為提取液總體積，A1為胡蘿卜素平均吸收系數(shù)，g是絲膠蛋白的重量。

1.3.5.3 黃酮含量測(cè)定。采用硝酸鋁顯色法進(jìn)行黃酮含量的測(cè)定。根據(jù)文獻(xiàn)[13]方法制作蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸得到吸光度A與黃酮濃度C的線性方程：A=10.70469C-0.03996，相關(guān)系數(shù)R=0.9992。

取絲膠蛋白粉末0.5g放入試管中，加入75%乙醇至10 mL，超聲30 min，再放入60℃水浴鍋里抽提1 h，過(guò)濾去除雜質(zhì)，收集抽提液，定容于25 mL標(biāo)準(zhǔn)容量瓶。取樣液5 mL，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%亞硝酸鈉溶液0.5 mL，混勻。放置6 min，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的硝酸鋁溶液0.5 mL，混勻，放置6 min；最后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%氫氧化鈉溶液2.5mL，用75%乙醇定容至10 mL，放置15min后，在510 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度A。根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品黃酮含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波輔助酶法脫膠單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲時(shí)間對(duì)黃色蠶繭脫膠率的影響

圖1 超聲處理時(shí)間對(duì)脫膠率的影響

由圖1可以看出，在超聲處理20～45 min時(shí)間內(nèi)，蠶繭脫膠率變化不大。當(dāng)超聲處理35 min時(shí)，脫膠率達(dá)到最大為32.79%±0.21%；當(dāng)超聲時(shí)間為40 min后，脫膠率緩慢下降，這可能是因?yàn)槌暡ㄌ幚硎沟玫孜锟臻g結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，減少了底物與水解酶的結(jié)合位點(diǎn)，進(jìn)而降低了反應(yīng)速度[14]。綜合考慮生產(chǎn)成本和脫膠后蛋白活性等因素影響，可以選擇超聲處理時(shí)間為35 min來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.2 溫度對(duì)黃色蠶繭脫膠率的影響

圖2 溫度對(duì)脫膠率的影響

從圖2可以看出，本實(shí)驗(yàn)中蠶繭在40～80℃范圍內(nèi)隨溫度升高脫膠率也升高。在80℃時(shí)脫膠率為36.27%±0.26%，說(shuō)明木瓜蛋白酶對(duì)溫度具有寬泛的耐受特性，因此木瓜蛋白酶可高溫脫膠也可低溫脫膠，這與鄧一民等報(bào)道的結(jié)果類似[15]。綜合考慮生產(chǎn)成本和對(duì)脫膠蛋白活性等因素的影響，選擇溫度為60℃來(lái)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.1.3 pH對(duì)黃色蠶繭脫膠率的影響

圖3 pH對(duì)脫膠率的影響

由圖3可知，在pH3～8范圍內(nèi)，pH值為6時(shí)脫膠率最高達(dá)33.79%±0.27%，超過(guò)此pH值，蠶繭脫膠率下降，因?yàn)槊富盍κ墉h(huán)境的影響，pH不僅影響酶的構(gòu)象，而且也影響底物的解離狀態(tài)[16]。pH值為6時(shí)，木瓜蛋白酶處于最佳pH值區(qū)間，能夠發(fā)揮木瓜蛋白酶的最大活力，因此可以選擇pH為5、6、7三個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。

2.1.4 酶加量對(duì)黃色蠶繭脫膠率的影響

圖4 加酶量對(duì)脫膠率的影響

從圖4可以看出，酶加量從1%～5%(E/S)上升時(shí)，黃色蠶繭脫膠率也隨之上升，當(dāng)酶加量在5%～8%(E/S)范圍內(nèi)，脫膠率變化不大。酶量越多，酶與底物作用越充分[17]，但當(dāng)酶與底物的結(jié)合接近飽和時(shí)，過(guò)量的酶就不再使脫膠效果明顯提高。因此，確定酶加量為4%、5%、6%(E/S)三個(gè)水平進(jìn)行后續(xù)優(yōu)化較為合適。

2.1.5 料液比對(duì)黃色蠶繭脫膠率的影響

圖5 料液比對(duì)脫膠率的影響

由圖5可知，在料液比為1∶20～1∶50(m/v)蠶繭脫膠率變化不大，料液比為1∶30(m/v)，脫膠率最大。這可能是由于絲膠蛋白本身易溶于水，加水量越多，絲膠蛋白溶解速率越快，但是酶與底物接觸減少，作用減少，導(dǎo)致脫膠率增長(zhǎng)減慢，甚至減小[18]。因此，實(shí)驗(yàn)中可選取料液比為1∶30(m/v)來(lái)進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。

2.1.6 超聲功率對(duì)黃色蠶繭脫膠率的影響

由圖6可知，超聲功率在400W 時(shí)，脫膠率最大，在200～400W時(shí)，蠶繭脫膠率隨著功率的增大而明顯增大，但在400W之后，脫膠率減小。這可能是由于隨著超聲功率的增加，作用在底物上的超聲能增加，加快了絲膠蛋白的的溶解，但過(guò)高的功率可能破壞酶的活性中心，導(dǎo)致整體脫膠效果減小[19]。因此實(shí)驗(yàn)中可選取300、400、500 W進(jìn)行后續(xù)的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。

圖6 超聲功率對(duì)脫膠率的影響

2.2 響應(yīng)面結(jié)果與分析

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終選擇對(duì)黃色蠶繭脫膠率有顯著影響的三個(gè)因素：pH(X1)，酶加量(X2)，超聲功率(X3)，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，利用Design Expert 8.0軟件對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，得到脫膠率Y為目標(biāo)函數(shù)的一次回歸方程模型：Y=37.59-0.77X1+1.27X2-0.35X3-0.13X1X2+0.29X1X3+0.38X2X3-1.03X12-1.93X22-1.17X32。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及數(shù)據(jù)處理

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析可以看出(表3)：模型Pr=0.0072<0.01，表明回歸方程模型極顯著；失擬項(xiàng)Pr=0.0633>0.05，不顯著，表明該方程對(duì)實(shí)驗(yàn)擬合情況好、誤差??；模型的調(diào)整確定系數(shù)R2=0.95474，表明方程模型與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有95.474%的符合度。結(jié)合表3和圖7～圖9對(duì)模型進(jìn)行回歸方程系數(shù)顯著性分析表明：模型中X2，X22為極顯著項(xiàng)，X1，X12，X32為顯著項(xiàng)，3個(gè)因素對(duì)脫膠率影響大小順序?yàn)椋篨2>X1>X3，即pH>酶加量>超聲功率。X1X2，X1X3，X2X3的Pr值大于0.05，且等高線為圓形，所以3個(gè)因素的交互作用對(duì)蠶繭脫膠率的影響不顯著。

表3 回歸分析結(jié)果

圖7 pH和酶加量交互作用對(duì)脫膠率影響的響應(yīng)面圖

圖8 pH和超聲功率交互作用對(duì)脫膠率影響的響應(yīng)面圖

圖9 超聲功率和酶加量交互作用對(duì)脫膠率影響的響應(yīng)面圖

由模型預(yù)測(cè)得到的最佳優(yōu)化條件為：pH為5.56，酶加量為5.44%(E/S)，超聲功率為390.31W。該條件下蠶絲脫膠率的預(yù)測(cè)值為37.88%。考慮到實(shí)際操作的便利，確定最佳優(yōu)化條件為：pH為5.5，酶加量為5.5%(E/S)，超聲功率為390W，超聲處理時(shí)間為35min，溫度為60℃，料液比為1∶30(m/v)。為了檢驗(yàn)方法可靠性，將上述最優(yōu)工藝條件平行做3次實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取均值。測(cè)得蠶絲脫膠率的為37.62%±0.34%，該值與理論預(yù)測(cè)值37.88%相比，其相對(duì)誤差較小(約為0.69%)。

2.3 超聲波輔助酶法與傳統(tǒng)方法對(duì)黃色蠶繭脫膠比較

圖10 超聲波輔助酶法與傳統(tǒng)法對(duì)黃色蠶繭脫膠比較

從圖10可以看出，超聲波輔助酶法脫膠率(37.62%±0.34%)高于水浴煮沸脫膠(19.8%±0.21%)和酶法脫膠(26.25%±0.22%)。說(shuō)明超聲輔助酶法脫膠要優(yōu)于水浴煮沸脫膠和酶法脫膠。

2.4 不同方法脫膠后絲膠蛋白DPPH自由基清除率、類胡蘿卜素和黃酮含量比較

超聲輔助酶法脫膠(最優(yōu)條件)、水浴煮沸法脫膠以及酶法脫膠方法得到的絲膠蛋白中類胡蘿卜素和黃酮含量以及絲膠蛋白DPPH自由基清除率結(jié)果如表4。結(jié)果表明：DPPH自由基清除效果為：超聲輔助酶法(IC502.41±0.078mg/mL)>酶法(IC502.97±0.036mg/mL)>水浴煮沸(IC505.85±0.047 mg/mL)；類胡蘿卜素含量為：超聲輔助酶法(0.34±0.038mg/g)>酶法(0.27±0.041 mg/g)>水浴煮沸(0.16±0.024 mg/g)；黃酮含量為：超聲輔助酶法(0.59±0.062 mg/g)>酶法(0.51±0.045 mg/g)>水浴煮沸(0.32±0.076 mg/g)。

表4 絲膠蛋白類胡蘿卜素和黃酮含量以及DPPH自由基清除率

3 結(jié)論

3.1 超聲波輔助酶法脫膠率(37.62%±0.34%)高于水浴煮沸脫膠(19.8%±0.21%)和酶法脫膠(26.25%±0.22%)。說(shuō)明超聲輔助酶法對(duì)黃色蠶繭脫膠，比水浴煮沸法脫膠和酶法脫膠效果要好。

3.2 本文根據(jù)Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，優(yōu)化超聲輔助酶法對(duì)黃色蠶繭脫膠的工藝，并建立了相應(yīng)的數(shù)學(xué)模型。最后確定最佳工藝條件為：pH為5.5，酶加量為5.5%(E/S)，超聲功率為390W，超聲處理時(shí)間為35min，溫度為60℃，料液比為1∶30(m/v)。該條件下蠶繭脫膠率為37.62%±0.34%，該值與理論預(yù)測(cè)值37.88%相比，其相對(duì)誤差較小(約為0.69%)。研究結(jié)果表明，中心組合設(shè)計(jì)響應(yīng)面法可優(yōu)化工藝參數(shù)，為工業(yè)應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

3.3 超聲輔助酶法脫膠率(37.62%±0.34%)和脫膠后得到的絲膠蛋白DPPH自由基清除率(IC502.41±0.078 mg/mL)、類胡蘿卜素含量(0.34±0.038 mg/g)和黃酮含量(0.59±0.062 mg/g)均高于水浴煮沸脫膠和酶法脫膠，進(jìn)一步說(shuō)明了超聲輔助酶法脫膠的優(yōu)越性。

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[19]王振偉,申森.超聲波輔助酶法制備殼寡糖及抗氧化活性研究[J].中國(guó)食品添加劑,2014(4):70-75.

Process Optimization of Ultrasonic-assisted Enzymatic Degumming of Yellow Cocoons by Response Surface Methodology

Shao Shuangshuang1, He Liang2,Wei Chaoyang1,Li Weiqi1*

(1.College of Life Sciences, Zhejiang University, Hangzhou 310058;2.Institute or Biological Technology, Zhejiang Forestry Academy, Hangzhou 310023)

The purpose of this research is to study the process of ultrasonic-assisted enzymatic degumming of yellow cocoons. Based on the single factor tests, the three factors: pH (X1), enzyme amount (X2), and the ratio of material to solvent (X3) had a significant impact on degumming rate of natural yellow cocoons. Then the three factors were assessed by response surface methodology (RSM) involving a three factors and three levels. The optimal process was determined as follows: the pH was 5.5, the enzyme amount was 5.5% (E/S), the ultrasonic power was 390 W , the ultrasonic treatment time was 35 min, the temperature was 60℃, and the ratio of material to solvent was 1∶30(m/v). Under such conditions, the ultrasonic-assisted enzymatic has higher degumming rate of 37.62%±0.34%, and the sericin protein after ultrasonic-assisted enzymatic degumming has higher DPPH scavenging activity (IC502.41±0.078mg/mL), content of carotenoids (0.34±0.038mg/g), and flavonoids (0.59±0.062mg/g) than boiling water bath and enzymatic degumming. The ultrasonic-assisted enzymatic degumming was further demonstrated superior.

Yellow cocoons; Degumming; Ultrasonic; Enzyme; Response surface methodology

2015-05-26

浙江省科技攻關(guān)計(jì)劃(2014C32085)；浙江省科技攻關(guān)計(jì)劃(2013GZ09)

邵雙雙(1990-)，女，碩士在讀，研究方向：微生物學(xué)；*通訊作者：李衛(wèi)旗(1964-)，男，博士，副教授，研究方向：微生物發(fā)酵,E-mail:kite006@163.com。

TS202.3

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2015.04.001