腹腔鏡和開(kāi)腹結(jié)直腸癌根治術(shù)患者外周血GCC mRNA和h TERT mRNA的表達(dá)及意義

廖信芳 李正榮 楊清水 王萬(wàn)川 李柱 揭志剛

（1南方醫(yī)科大學(xué)附屬南海醫(yī)院普外二科 廣東佛山 528200；2南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院胃腸外科）

隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變和人們生活水平的不斷提高，結(jié)直腸癌發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，僅次于肺癌和胃癌［1］。臨床對(duì)結(jié)直腸癌的治療原則是盡可能的減少創(chuàng)傷的同時(shí)保留最大程度的功能。目前臨床多采用腹腔鏡和傳統(tǒng)開(kāi)腹結(jié)直腸癌根治術(shù)進(jìn)行治療，但是研究發(fā)現(xiàn)許多患者可能在腫瘤根治術(shù)前或術(shù)中已經(jīng)發(fā)生血行轉(zhuǎn)移，從而導(dǎo)致治療效果不佳［2］。鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶C（GCC）和端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（h TERT）作為腫瘤細(xì)胞血行微轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物，它們?cè)谡＝M織不會(huì)表達(dá)，只有當(dāng)組織發(fā)生癌變或惡性腫瘤中才表達(dá)為陽(yáng)性［3］。本研究通過(guò)檢測(cè)結(jié)直腸癌患者外周血中GCC mRNA和h TERT mRNA水平，比較兩種手術(shù)治療方式對(duì)腫瘤細(xì)胞血循環(huán)微轉(zhuǎn)移的影響，以期為臨床治療提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2011年7月至2013年7月我院肛腸門診收治的接受根治手術(shù)的結(jié)直腸癌患者為本試驗(yàn)研究，納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)纖維結(jié)腸鏡和病理組織學(xué)證實(shí)為結(jié)直腸癌患者；無(wú)手術(shù)禁忌證者；影像學(xué)檢查證實(shí)只能通過(guò)手術(shù)進(jìn)行治療者；術(shù)前未接受任何放化療及手術(shù)治療者；患者及家屬知情同意，并簽署知情同意書(shū)者。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕產(chǎn)婦、哺乳期婦女；合并有心功能不全者；合并有肝、腎功能障礙者；合并有癌細(xì)胞遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者；合并有其他可能影響本研究結(jié)果的疾病，如糖尿病、高血壓等基礎(chǔ)性疾病。

符合納入標(biāo)準(zhǔn)的患者共79例，按照隨機(jī)數(shù)字表法將其分為腹腔鏡組和開(kāi)腹手術(shù)組，腹腔鏡組39例，其中男24例，女15例；年齡43～75歲，平均（54.2±10.5）歲；癌癥分型：結(jié)腸癌17例，直腸癌22例；病理分型：黏液腺癌6例，腺癌33例；根據(jù)美國(guó)癌癥學(xué)會(huì)（AJCC）第7版中結(jié)直腸癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)［4］：I期5例，Ⅱ期17例，Ⅲ期17例。開(kāi)腹手術(shù)組40例，其中男27例，女13例；年齡45～74歲，平均（55.3±9.7）歲；癌癥分型：結(jié)腸癌19例，直腸癌21例；病理分型：黏液腺癌3例，腺癌37例；結(jié)直腸癌TNM分期：I期3例，Ⅱ期21例，Ⅲ期16例。兩組基本資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 手術(shù)方法 腹腔鏡結(jié)直腸癌根治術(shù)操作方法 患者全身麻醉后取截石位仰臥于手術(shù)臺(tái)上，將消毒毛巾鋪于手術(shù)切口處，通過(guò)穿刺Trocar以建立氣腹來(lái)查探腹腔內(nèi)的臟器有無(wú)轉(zhuǎn)移等，當(dāng)明確沒(méi)有臟器轉(zhuǎn)移和腹腔種植時(shí)嚴(yán)格按照腹腔鏡根治術(shù)治療原則進(jìn)行左半結(jié)腸切除術(shù)、右半結(jié)腸切除術(shù)、乙狀結(jié)腸切除術(shù)以及腹會(huì)陰聯(lián)合直腸切除術(shù)和直腸前切除術(shù)。開(kāi)腹組行全身麻醉后進(jìn)行氣管插管仰臥于手術(shù)臺(tái)上，按照開(kāi)腹手術(shù)的常規(guī)方式行根治性切除手術(shù)。兩組術(shù)后均行抗感染治療和常規(guī)治療及護(hù)理。

1.2.2 采集標(biāo)本 在手術(shù)進(jìn)行之前的1d，分別抽取兩組患者空腹?fàn)顟B(tài)下肘靜脈血3m L（以第2管計(jì)算），在術(shù)后3d抽取兩組患者空腹?fàn)顟B(tài)下肘靜脈血3m L（以第2管計(jì)算），手術(shù)治療前后的靜脈血標(biāo)本均采用枸櫞酸鈉進(jìn)行抗凝處理，在添加淋巴細(xì)胞分離液分離出有核細(xì)胞后將其放置于－80℃的冰箱中保存。

1.2.3 外周血單核細(xì)胞總RNA提取 ①將已分離過(guò)有核細(xì)胞備用的血標(biāo)本放置于1.5m L進(jìn)口的無(wú)菌管中，離心后將上清液棄之不用；②加入1m L的Trizol試劑混勻后，置于室溫下消化，10min后加入200μL的氯仿混勻并放置于室溫下3min后再進(jìn)行離心15min；③將上清液加入到1.5m L的試管中，同時(shí)加入0.5m L的異丙醇混勻，在室溫下靜置15min再離心；④將上層清液棄之不用，加入200μL的750m L／L的乙醇漂洗1次并快速離心以吸干液體；⑤待RNA沉淀適度干燥后就加入20μL的0.1%的無(wú)菌DEPC水溶解RNA，并置于－80℃低溫保存以備用。

1.2.4 GCC基因和h TERT基因的引物序列GCC基因引物 序列：Homo-GC-C-F：5-TCTCCTGATGCTCAGAAAAT-3；Homo-GC-C-R：5-TCGTATTTGCACTGTCGTAG-3，片 段 的 長(zhǎng) 度：177bp。h TERT基因的引物序列：Homo-h TERT-F：5-GAGCGACTACTCCAGCTATG-3；Homo-h TERTR：5-GCAGGAGGATCTTGTAGATG-3，片 段 長(zhǎng)度：19bp。

1.2.5 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 將上述得到的RNA加熱到70℃使其變性并迅速將其置于冰浴以預(yù)防RNA的復(fù)性。在無(wú)菌離心管中加入18μL的RT反應(yīng)液、1μL的莫洛尼鼠白血病病毒（M-MLV）逆轉(zhuǎn)錄酶、1μL的RNasin并將其混勻，然后通過(guò)微量加樣器在每個(gè)反應(yīng)管中加入20μL，并同時(shí)加入5μL的RNA，最后置于37℃水浴反應(yīng)30min。

1.2.6 PCR擴(kuò)增 根據(jù)每個(gè)反應(yīng)取43μL的PCR反應(yīng)液和2μL的Taq酶于無(wú)菌的離心管中混勻，再通過(guò)微量加樣器在每個(gè)反應(yīng)管中加入45μL的反應(yīng)液和5μL的RT反應(yīng)產(chǎn)物，最后進(jìn)行擴(kuò)增：95℃下預(yù)變性5min，95℃下30s，62℃下20s，72℃下20s，總共35個(gè)循環(huán)，延伸72℃10min以后置于4℃環(huán)境下保存。

1.2.7 瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)產(chǎn)物 采用1.5%的瓊脂凝膠對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行電泳，加樣量為10μL，電壓設(shè)定為120V，電泳完以后將其置于溴化乙錠（EB）染色，時(shí)間為15min，然后利用清水進(jìn)行漂洗，最后通過(guò)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。陽(yáng)性判斷標(biāo)準(zhǔn)：①GCC m RNA陽(yáng)性：特異性擴(kuò)增帶為177bp；②h TERT mRNA陽(yáng)性：特異性擴(kuò)增帶為191bp。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的錄入及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料的描述采用（）表示，兩獨(dú)立樣本的比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料的描述采用率表示，比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩組患者手術(shù)效果的比較 腹腔鏡組手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)于開(kāi)腹手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），術(shù)中出血量、術(shù)后排氣時(shí)間、住院時(shí)間均少于開(kāi)腹組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 兩組患者手術(shù)前后外周血中GCC mRNA和h TERT m RNA的表達(dá)情況 腹腔鏡組和開(kāi)腹組患者手術(shù)前、手術(shù)后的GCC mRNA、h TERT mRNA陽(yáng)性率表達(dá)分別進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），兩組患者手術(shù)前后 GCC mRNA、h TERT mRNA陽(yáng)性率表達(dá)比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），手術(shù)后的陽(yáng)性率高于手術(shù)前。見(jiàn)表2、表3。

表1 兩組患者手術(shù)效果的比較（）

表1 兩組患者手術(shù)效果的比較（）

組別 手術(shù)時(shí)間（min）術(shù)中出血量（m L）術(shù)后排氣時(shí)間（h）住院時(shí)間（d）腹腔鏡組（n＝39）198.6±28.9136.2±40.551.2±6.8 8.5±2.2開(kāi)腹組（n＝40） 172.5±29.5237.8±38.6 64.5±7.2 14.1±3.0 t值 3.872 6.931 3.056 5.892 P值0.011 0.000 0.002 0.000

表2 兩組患者手術(shù)前后GCC mRNA的表達(dá)情況［n（%）］

表3 兩組患者手術(shù)前后h TERT mRNA的表達(dá)情況［n（%）］

3 討 論

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的胃腸道惡性腫瘤，其發(fā)病年齡以30～60歲為主，男性多于女性［5］。目前臨床治療結(jié)直腸癌多采用腹腔鏡手術(shù)和傳統(tǒng)開(kāi)腹手術(shù)進(jìn)行根治性治療，腹腔鏡手術(shù)較傳統(tǒng)開(kāi)腹手術(shù)治療具有創(chuàng)傷小、手術(shù)并發(fā)癥少等特點(diǎn)，但是研究顯示腹腔鏡手術(shù)根治結(jié)直腸癌盡管取得了較好的療效，但是患者最后可能會(huì)因?yàn)槟[瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移或復(fù)發(fā)而死亡［6］。那么腹腔鏡手術(shù)根治術(shù)在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中是否具有促進(jìn)的作用，目前許多的臨床醫(yī)生均已開(kāi)始關(guān)注。研究顯示結(jié)直腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移主要通過(guò)血循環(huán)，而手術(shù)治療失敗的原因之一也是因?yàn)槟[瘤細(xì)胞通過(guò)血行發(fā)生了轉(zhuǎn)移，常規(guī)情況下在血液中沒(méi)有癌細(xì)胞的表達(dá)，因此通過(guò)檢測(cè)血循環(huán)中有無(wú)癌細(xì)胞的表達(dá)就可以判斷是否存在血液微轉(zhuǎn)移。微轉(zhuǎn)移（micrometastasis，MM）的直徑常小于2mm，可作為獨(dú)立腫瘤細(xì)胞灶存在，也可以是單獨(dú)的腫瘤細(xì)胞，臨床上常無(wú)明顯的癥狀，因此超聲多普勒、CT以及MRI及常規(guī)的病理學(xué)檢查方法等均不能檢查出［7］。研究顯示微轉(zhuǎn)移可通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應(yīng)法（RT-PCR）技術(shù)進(jìn)行基因水平的檢測(cè)，其主要特點(diǎn)是利用物質(zhì)的反復(fù)擴(kuò)增來(lái)擴(kuò)大極微量物質(zhì)，以至于通過(guò)肉眼就可以觀察到而達(dá)到檢測(cè)的目的［8］。目前RT-PCR技術(shù)因具有高靈敏度及特異度等特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于腫瘤標(biāo)志物的表達(dá)。鳥(niǎo)苷酸環(huán)化酶（GCC）作為含有374bp核苷酸序列的N－連接糖蛋白受體，主要分布在腸絨毛上皮細(xì)胞的頂端，研究發(fā)現(xiàn)腸外組織中不能檢測(cè)到GCC，只有當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)惡化、惡變和轉(zhuǎn)移等，GCC才會(huì)持續(xù)的表達(dá)，因此其可作為結(jié)直腸癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移檢測(cè)和診斷的重要指標(biāo)［9］。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（h TERT）是一種只在癌前病變和惡性腫瘤組織中才會(huì)表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄酶，也可以作為判斷癌細(xì)胞有無(wú)轉(zhuǎn)移的重要標(biāo)志物［10］。本研究采用腹腔鏡和開(kāi)腹結(jié)直腸癌根治術(shù)治療結(jié)直腸癌患者，并通過(guò)RT-PCR技術(shù)檢測(cè)GCC mRNA和h TERT mRNA的表達(dá)情況，探討兩種手術(shù)方式對(duì)腫瘤細(xì)胞血行微轉(zhuǎn)移的影響。

結(jié)果顯示，腹腔鏡組手術(shù)時(shí)間長(zhǎng)于開(kāi)腹手術(shù)組，術(shù)中出血量、術(shù)后排氣時(shí)間、住院時(shí)間均少于開(kāi)腹組，說(shuō)明腹腔鏡手術(shù)具有創(chuàng)傷小，療效好等特點(diǎn)，這與有關(guān)研究結(jié)果一致［11］。腹腔鏡組和開(kāi)腹組患者手術(shù)前、手術(shù)后的GCC mRNA、h TERT m RNA陽(yáng)性率表達(dá)分別進(jìn)行比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說(shuō)明兩種手術(shù)方式治療結(jié)直腸癌患者后血循環(huán)無(wú)明顯的差別，這與有關(guān)研究結(jié)果一致［3］。結(jié)果提示我們腹腔鏡結(jié)直腸癌根治術(shù)較傳統(tǒng)開(kāi)腹手術(shù)比較，并不會(huì)增加外周血中腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。結(jié)果還表明兩組患者手術(shù)后的GCC m RNA、h TERT mRNA陽(yáng)性率表達(dá)高于手術(shù)前，說(shuō)明兩組患者術(shù)后確實(shí)有血循環(huán)微轉(zhuǎn)移，這與有關(guān)研究結(jié)果不一致，不一致的原因可能是因?yàn)槠渌芯康臉颖玖肯鄬?duì)較少導(dǎo)致結(jié)果有偏差所致［12］，這也說(shuō)明兩種標(biāo)志物可以較好的檢測(cè)手術(shù)方式對(duì)微循環(huán)的影響，臨床上有重要參考價(jià)值。

［1］ Dueland S，Guren TK，Hagness M，et al.Chemotherapy or Liver Transplantation for Nonresectable Liver Metastases From Colorectal Cancer［J］.Ann Surg，2014［Epub ahead of print］.

［2］ Sawbridge D，Probert C.Population-based screening in colorectal cancer-current practice and future developments：faecal biomarkers review［J］.J Gastrointestin Liver Dis，2014，23（2）：195-202.

［3］ 江少鋒.GCC mRNA、h TERT m RNA聯(lián)合檢測(cè)開(kāi)腹和腹腔鏡結(jié)直腸癌根治術(shù)對(duì)血循環(huán)微轉(zhuǎn)移影響的臨床研究［D］.湖南：中南大學(xué)，2012.

［4］ 劉兆龍，龔航軍，韓剛，等.腹腔鏡與傳統(tǒng)開(kāi)腹結(jié)直腸癌手術(shù)對(duì)免疫應(yīng)激的影響［J］.腹腔鏡外科雜志，2014，19（3）：161-164.

［5］ 呂晶晶.結(jié)直腸癌中EHD2、PDLIM7表達(dá)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究［D］.上海：第二軍醫(yī)大學(xué)，2013.

［6］ WangG，Jiang Z，Zhao K，et al.Immunologic response after laparoscopic colon cancer operation within an enhanced recovery program［J］.J Gastrointest Surg，2012，16（7）：1379-1388.

［7］ Shimada Y，Ajioka Y，Wakai T.Detection of micrometastasis in patients with colorectal cancer［J］.Nihon Rinsho，2014，72（1）：89-94.

［8］ 包英夫，宋德光，賀文琦，等.抗ORFV免疫球蛋白重鏈可變區(qū)基因序列的RT-PCR擴(kuò)增及其多樣性［J］.中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2014，34（4）：526-529.

［9］ Begg DP，Steinbrecher KA，Mul JD，et al.Effect of guanylate cyclase-C activity on energy and glucose homeostasis［J］.Diabetes，2014［Epub ahead of print］.

［10］Hsu CC，Chen CH，Hsu TI，et al.The 58-kda microspherule protein（MSP58）represses human telomerase reverse transcriptase（h TERT）gene expression and cell proliferation by interacting with telomerase transcriptional element-interacting factor（TEIF）［J］.Biochim Biophys Acta，2014，1843（3）：565-579.

［11］韓剛，王以東，曹羽，等.直腸癌腹腔鏡與開(kāi)腹根治術(shù)的近遠(yuǎn)期療效及安全性評(píng)估［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2013，13（8）：1511-1513，1553.

［12］Song Y，Xin X，Xia Z，et al.Selective suppression of autocatalytic caspase-3driven by two-step transcriptional amplified humantelomerase reverse transcriptase promoter on ovarian carcinoma growth in vitro and in mice［J］.Oncol Rep，2014，32（1）：225-234.