黃芩中抗菌有效成分提取工藝研究

王 雪， 劉燕隔， 逯家輝， 王春月， 賈冰璇， 孟慶繁， 張 洋， 王 迪

(吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130012)

·研究報(bào)告——生物質(zhì)活性成分·

黃芩中抗菌有效成分提取工藝研究

王 雪， 劉燕隔， 逯家輝， 王春月， 賈冰璇， 孟慶繁， 張 洋， 王 迪*

(吉林大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 吉林 長(zhǎng)春 130012)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取提取溫度、提取時(shí)間和液料比為影響因素,應(yīng)用 Box-Behnken中心組合進(jìn)行3因素3水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì),以對(duì)白色念珠菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑作為響應(yīng)值,對(duì)結(jié)果進(jìn)行多元線性和二項(xiàng)式擬合,采用響應(yīng)面(RSA)法選取黃芩中抗菌有效成分提取的最佳工藝條件。最佳工藝條件為:提取溫度61 ℃，提取時(shí)間2 h，液料比13∶1(mL∶g),經(jīng)3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)得黃芩水提物質(zhì)量濃度為0.5 g/mL時(shí)，抑菌圈平均直徑為12.637 mm，與預(yù)測(cè)值12.665 mm接近，陽(yáng)性對(duì)照枯草桿菌肽的平均抑菌圈直徑為11.85 mm，表明響應(yīng)面法優(yōu)化得到的黃岑水提物對(duì)白色念珠菌的抑菌作用顯著。

黃芩；抗菌成分；提取工藝；中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法

黃芩為唇形科植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)的干燥根，具有清熱燥濕，瀉火解毒之功效。黃芩的粗提物及其活性部位、單體具有抗真菌、抗突變、抗炎癥、抗血管平滑肌增殖、抗氧化和抗腫瘤等多方面的藥理活性和很好的臨床價(jià)值[1-5]。白念珠菌(Canidiaalbicans)是臨床最常見(jiàn)的女性婦科疾病致病真菌[6]，目前治療婦科炎癥類疾病的抗生素和化學(xué)合成類藥物極為有限, 且毒副作用較大,中草藥在抗白念珠菌感染的預(yù)防和治療中的應(yīng)用克服了上述問(wèn)題[7],大量研究表明,黃芩對(duì)白念珠菌等深部真菌感染有良好的抗菌作用[8]。 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面分析法(RSM)能將多因素試驗(yàn)中各個(gè)因素與響應(yīng)值之間的復(fù)雜關(guān)系，以多元二次回歸方程表示，簡(jiǎn)單、快速地對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行全面的研究，并得到最優(yōu)化參數(shù)[9]，被廣泛的應(yīng)用于中藥提取工藝優(yōu)化[10]、菌粉發(fā)酵工藝優(yōu)化[11]及胞內(nèi)有效成分提取優(yōu)化[12]中。本研究采用響應(yīng)面法對(duì)黃芩抗菌有效成分提取工藝進(jìn)行研究，通過(guò)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合模型，研究了提取溫度、提取時(shí)間和液料比對(duì)黃芩中抗菌有效成分的影響以及各因素之間的相互作用，確定了最優(yōu)的提取工藝，為黃芩抗菌、抗病毒新藥的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 材料與儀器

黃芩藥材購(gòu)自吉林省龍康藥業(yè)有限公司。白色念珠菌購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所(ATCC 10231)。陽(yáng)性對(duì)照藥枯草桿菌肽購(gòu)于上海，阿拉丁試劑；酵母浸粉、蛋白胨,均為BR,北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；氯化鈉,AR；瓊脂粉,生化試劑。

HDM-2000回流裝置,北京中興偉業(yè)儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器；BS2243電子分析天平；ZHJH-C1109C超凈工作臺(tái),上海智城分析儀器制造有限公司；HZQ-F160A高低溫恒溫振蕩培養(yǎng)箱,上海一恒科技有限公司；Mf 3菌落自動(dòng)計(jì)數(shù)多功能一體機(jī),杭州迅數(shù)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 LB液體培養(yǎng)基:酵母浸粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，以NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4,121 ℃高壓滅菌30 min,備用。 LB固體培養(yǎng)基:酵母浸粉5 g/L,蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，以NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4，瓊脂粉20 g/L,121 ℃高壓滅菌30 min,備用。

1.2.2 菌種的活化 菌株于實(shí)驗(yàn)前接種于沙氏斜面,37 ℃培養(yǎng)24 h，活化2次, 使之處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),以沙氏液體培養(yǎng)基調(diào)整菌液濃度至106CFU/mL。

1.2.3 抑菌效果的測(cè)定 采用濾紙片平板擴(kuò)散法測(cè)抑菌效果。用無(wú)菌移液管取0.5 mL菌濃度為106CFU/mL的菌懸液于濕熱滅菌的培養(yǎng)皿中,再將經(jīng)高壓蒸氣滅菌后的培養(yǎng)基冷卻至50～60 ℃,無(wú)菌操作傾注于加有0.5 mL菌液的培養(yǎng)皿中,每皿約15～20 mL的培養(yǎng)基,將培養(yǎng)皿置于超凈工作臺(tái)上輕輕搖動(dòng),將菌與培養(yǎng)基充分混勻,制成含菌平板。將滅菌后直徑6 mm的濾紙片置于一定質(zhì)量濃度的黃芩水提物中，浸泡30 min后取出,自然烘干,按無(wú)菌操作貼于含菌平板上，陰性對(duì)照組為不加黃岑水提物的處理液，陽(yáng)性對(duì)照組為枯草桿菌肽，每皿貼4片,置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h后，用全自動(dòng)菌落計(jì)數(shù)儀觀察有無(wú)抑菌作用,并測(cè)量其抑菌圈的大小，取平均值。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 精密稱取干燥的黃芩飲片15 g，在一定溫度下按一定的液料比加入適量水，于回流裝置中提取,濾出藥液后減壓濃縮, 靜置5 h，取上清液，即為黃芩水提物。主要考察提取溫度、提取時(shí)間和液料比對(duì)黃芩中抗菌有效成分的影響。

1.2.5 中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行3因素3水平的Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)[13-15]。采用響應(yīng)面分析法研究3個(gè)隨機(jī)因素(提取溫度、提取時(shí)間和液料比)對(duì)響應(yīng)值(抑菌圈直徑)的影響。每一自變量的低、中、高水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼。用SAS V 8.0的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)工具箱對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行回歸擬合，對(duì)回歸方程和關(guān)鍵因素進(jìn)行方差分析，并得到最優(yōu)的抗菌有效成分提取條件。應(yīng)用Matlab 7.0根據(jù)響應(yīng)方程繪制響應(yīng)曲面圖和等高線圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溫度 液料比10∶1(mL∶g，下同)，提取溫度分別為60、70、80、90和100 ℃，提取1 h，藥液濃縮至適當(dāng)濃度，靜置5 h，取上清液，測(cè)定各組水提物對(duì)白色念珠菌的抑菌活性，結(jié)果如圖1所示。從圖1中可以看出，當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，隨著提取溫度的逐漸增加，黃芩水提物對(duì)白色念珠菌產(chǎn)生的抑菌圈直徑逐漸減小，可能由于黃芩中有效抑菌活性成分經(jīng)高溫加熱后易失活，故黃芩中抗菌有效活性成分提取的最佳溫度為70 ℃。

2.1.2 提取時(shí)間 液料比10∶1,提取溫度70 ℃條件下分別提取1、2、3、4和5 h，藥液濃縮至適當(dāng)濃度，靜置5 h，取上清液，測(cè)定各組水提物對(duì)白色念珠菌的抑菌活性，結(jié)果如圖2所示。從圖2可以清楚的看出，隨著提取時(shí)間的增加，黃芩提取物的抑菌活性增加，2 h后抑菌圈直徑下降，故選擇黃芩抗菌有效成分的提取時(shí)間單因素優(yōu)化值為2 h。

2.1.3 液料比 在篩選得到的最佳提取溫度70 ℃，提取時(shí)間2 h下，分別按液料比5∶1、10∶1、20∶1、30∶1和40∶1對(duì)黃芩進(jìn)行提取，藥液濃縮至適當(dāng)濃度，靜置5 h，取上清液，測(cè)定各組水提物對(duì)白色念珠菌的抑菌活性，結(jié)果如圖3所示。從圖3中可以看出，液料比高于10∶1后，抑菌圈直徑有所降低，故選擇黃芩抗菌有效成分提取的最優(yōu)液料比為10∶1。

圖1 提取溫度對(duì)抑菌圈直徑的影響

Fig.1 Effect of extraction temp. on the bacteriostatic circle diameter

圖2 提取時(shí)間對(duì)抑菌圈直徑的影響

Fig.2 Effect of extraction time on the bacteriostatic circle diameter

圖3 液料比對(duì)抑菌圈直徑的影響

Fig.3 Effect of solvent/solid on the bacteriostatic circle diameter

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化黃芩抗菌有效成分提取條件

2.2.1 提取條件優(yōu)化 根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的優(yōu)化結(jié)果，以提取溫度(X1)、提取時(shí)間(X2)和液料比(X3)為自變量，抑菌圈直徑Y(jié)為響應(yīng)值，進(jìn)行3因素3水平的Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素和水平的設(shè)計(jì)及實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示，采用多元二次回歸方法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)分析，并采用偏導(dǎo)方法求解多元二次回歸方程的極值，得到最佳提取條件。

表1 Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果

采用SAS RSREG程序?qū)Ρ?中數(shù)據(jù)進(jìn)行響應(yīng)面分析，多元二次回歸方程為:

響應(yīng)面二次回歸模型ANOVA分析結(jié)果如表2所示。該模型的R2值為0.978 1，P值為0.001 3,說(shuō)明試驗(yàn)點(diǎn)的數(shù)據(jù)的這種擬合方法是合理可靠的, 使用該方程模擬真實(shí)的3因素3水平的分析是可行的。各因素的顯著作用采用P檢測(cè)和F檢測(cè)方法。t值越大，P值越小則該因素對(duì)響應(yīng)值的影響越顯著。從結(jié)果中可以看出，提取溫度(X1)對(duì)抑菌圈直徑的影響非常大，P值為0.003 5，對(duì)二次變量而言，X1X3、X22項(xiàng)P值分別為0.000 6、 0.000 2，對(duì)Y值有極顯著影響(P<0.001)，X12、X32項(xiàng)P值分別為0.004 7和0.006 3，對(duì)Y值有顯著影響(P<0.05)。

表2 回歸分析結(jié)果

根據(jù)回歸方程，繪制響應(yīng)面圖，結(jié)果如圖4所示。從各因素之間兩兩相互作用的響應(yīng)面圖形觀察，發(fā)現(xiàn)其中曲線走勢(shì)越陡，其影響越顯著；曲線走勢(shì)越平滑，其影響越小。提取溫度、液料比和提取時(shí)間的圖形曲線走勢(shì)較陡，說(shuō)明其對(duì)抑菌圈直徑影響最為顯著。

圖4 響應(yīng)面圖和等高線圖

采用SAS工具箱計(jì)算黃芩抗菌有效活性成分最優(yōu)提取條件的編碼值為：X1=-0.863 74，X2=0.073 316,X3=0.657 436。根據(jù)編碼值與非編碼值的轉(zhuǎn)換式解得真實(shí)值為X1=61.36，X2=2.037，X3=13.285。因此，將數(shù)據(jù)圓整后可得黃芩中抗菌有效成分的最佳提取工藝為：提取溫度61 ℃、提取時(shí)間2h、液料比13∶1。由回歸方程預(yù)測(cè)對(duì)白色念珠菌產(chǎn)生的抑菌圈理論值可達(dá)到12.665mm。

2.2.2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 為檢驗(yàn)響應(yīng)面法的可行性，采用模型預(yù)測(cè)的最佳提取條件進(jìn)行黃芩中抗菌有效成分提取的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，采用的提取工藝為提取溫度61 ℃,提取時(shí)間2h,液料比13∶1。3次平行試驗(yàn)得到當(dāng)黃芩水提物質(zhì)量濃度為0.5g/mL時(shí)，抑菌圈的平均值為12.637mm，相對(duì)誤差小于0.1%，可見(jiàn)預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值吻合得很好，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

2.3 抑菌性比較

按照響應(yīng)面法優(yōu)選的最佳工藝條件對(duì)黃芩進(jìn)行提取，并減壓濃縮到質(zhì)量濃度0.5 g/mL，另作陽(yáng)性和陰性對(duì)照進(jìn)行抑菌活性的測(cè)定，黃芩水提物濃縮液對(duì)白色念珠菌平均抑菌圈直徑為12.64 mm，陽(yáng)性對(duì)照組平均抑菌圈直徑為11.85 mm，陰性對(duì)照組平均抑菌圈直徑為0 mm。

3 結(jié) 論

采用單因素及中心組合設(shè)計(jì)-響應(yīng)面法優(yōu)化黃芩中抗菌有效活性成分的提取工藝，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明, 最優(yōu)的提取工藝為：提取溫度61 ℃、提取時(shí)間2 h、液料比13∶1(mL∶g)，在此條件下0.5 g/mL的黃芩水提物，能夠顯著抑制白色念珠菌活性，抑菌圈的平均直徑為12.637 mm，與理論預(yù)測(cè)值(12.665)的相對(duì)誤差小0.1%。

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Extraction of Effective Ingredients fromScutellariaBacalensisGeorgi

WANG Xue， LIU Yan-ge， LU Jia-hui， WANG Chun-yue， JIA Bing-xuan， MENG Qing-fan，ZHANG Yang， WANG Di

(School of Life Science,Jilin University, Changchun 130012, China)

In order to optimize the extraction condition for effective active ingredient from Scutellaria Bacalensis Georgi, a three-factor-three-level experiments design was developed by using Box-Benhken central composite design method based on single-factor experiments with extraction temperature, extraction time, solvent-solid ratio as influence factors. The bacteriostatic ring diameter againstCandidaalbicanswas used as the responsive values. The data were fitted by using multi-linear equation and second-order polynomial equation. And the extraction conditions were optimized by response surface method. The optimum conditions were as follows: extraction temperature 61 ℃, extraction time 2 h and solvent-solid ratio 13∶1. Under these conditions,the average diameter of bacteriostatic circles verified by three experiments was 12.637 mm closing to the predicted value(12.664 88 mm)，when the concentration of extractions was 0.5 g/mL.And the average diameter of bacteriostatic circle of positive contrast was 11.85 mm.The results showed that the aqueous extract ofScutellariabacalensisGeorgi had significant bacteriostatic effects onCandidaalbicans.

ScutellariabacalensisGeorgi; antibacterial ingredient; extraction; central composite design-response surface metho- dology

10.3969/j.issn.1673-5854.2015.05.007

2014- 04- 03

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究規(guī)劃項(xiàng)目(3R114P821413)

王 雪(1990—)，女，黑龍江齊齊哈爾，碩士生，主要從事微生物與生化藥學(xué)研究

*通訊作者：王 迪，講師，研究方向?yàn)槲⑸锱c生化藥學(xué)、分子藥理學(xué)；E-mail:jluwangdi@outlook.com。

TQ35

A

1673-5854(2015)05- 0034- 05