• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型的比較研究

    2015-02-24 01:57:29陳啟鑫韓冠英郭躍偉
    中國全科醫(yī)學(xué) 2015年24期
    關(guān)鍵詞:硝普鈉軟骨染色

    陳啟鑫,韓冠英,郭 斌,郭躍偉

    ?

    ·論著·

    不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型的比較研究

    陳啟鑫,韓冠英,郭 斌,郭躍偉

    目的 比較不同濃度硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型,為進一步探討藥物對軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用提供理論支持。方法 2014年9—12月選取4周齡健康雄性新西蘭大耳白兔8只,體質(zhì)量200~250 g,體外分離培養(yǎng)并鑒定兔軟骨細(xì)胞,采用不同濃度SNP(0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 mmol/L)誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞,分別于12、24、48 h采用四甲基偶氮唑鹽比色試驗法(MTT法)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)評價并比較不同濃度SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型,記錄兔軟骨細(xì)胞增殖情況(OD值)和兔軟骨細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 不同濃度SNP誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞在不同時間點的OD值比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值高于SNP濃度為0 mmol/L(P<0.05);SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值均低于SNP濃度為0 mmol/L;SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值在不同濃度間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度SNP誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞在不同時間點的凋亡率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞凋亡率均高于SNP濃度為0 mmol/L(P<0.05);且不同濃度間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 SNP濃度為0.25~2 mmol/L且誘導(dǎo)12、24、48 h時可制備不同嚴(yán)重程度的軟骨細(xì)胞凋亡模型,為進一步探討藥物對軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用提供了理論支持。

    硝普鈉;軟骨細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

    陳啟鑫,韓冠英,郭斌,等.不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型的比較研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2015,18(24):2939-2945.[www.chinagp.net]

    Chen QX,Han GY,Guo B,et al.Rabbit chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP[J].Chinese General Practice,2015,18(24):2939-2945.

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病,其發(fā)病機制尚不清楚[1]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中與修復(fù)破壞軟骨組織有關(guān)的細(xì)胞,在一定程度上能控制細(xì)胞外基質(zhì)的分布,對維持軟骨的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和組織結(jié)構(gòu)的完整性發(fā)揮著重要作用,軟骨細(xì)胞的凋亡是OA發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[2]。目前,體外常用于誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型的途徑有過氧化氫、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和一氧化氮(NO)等,其中采用NO誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型是常用方法之一[3-6]。NO通過兩種途徑誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷,一種是抑制與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及枸櫞酸循環(huán)相關(guān)的酶,另一種是抑制與超氧陰離子反應(yīng)生成氧化亞硝基的陰離子,其在一定條件下可分解為具有細(xì)胞毒性的OH-和NO2[7]。NO供體S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine,SNAP),即硝普鈉(SNP),可產(chǎn)生外源性的NO,進而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。采用SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型的方法雖有報道,但SNP的劑量和誘導(dǎo)時間各不相同,且對不同濃度SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡比較的研究較少,不利于不同嚴(yán)重程度凋亡模型的建立,進而影響藥物對OA的療效判定及作用機制研究。本研究采用不同濃度SNP誘導(dǎo)兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡,以建立不同嚴(yán)重程度的凋亡模型,為進一步篩選治療OA的藥物并評價其療效及作用機制提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 研究材料 2014年9—12月選取4周齡健康雄性新西蘭大耳白兔8只,體質(zhì)量200~250 g,合格證號:Lnyxy20140507,由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。實驗過程中對動物的處置經(jīng)遼寧醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.2 研究試劑 Ⅱ型膠原酶、四甲基偶氮唑鹽〔3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT〕、SNP(購自美國Sigma公司);DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(購自美國Gibco公司);Alexa 555連接的羊抗兔二抗、4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(購自美國Invitrogen公司);臺盼

    本研究背景:

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病,其發(fā)病機制尚不清楚。目前我國OA的患病人數(shù)已達到1.5億左右,是世界上OA患病人數(shù)最多的國家之一。OA導(dǎo)致的疼痛和功能障礙將影響患者的生活質(zhì)量并給家庭和社會帶來極大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此,開發(fā)有效治療OA的藥物具有很高的社會價值和應(yīng)用價值。研究表明,藥物對OA的療效與OA的嚴(yán)重程度有關(guān),故選擇合適的模型對評價藥物對OA的療效及作用機制的研究具有重要意義。采用硝普鈉誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型的方法雖有報道,但硝普鈉的劑量和誘導(dǎo)時間各不相同,且對不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的比較研究較少,不利于不同嚴(yán)重程度凋亡模型的建立,進而影響藥物對OA的療效判定及作用機制研究。本研究采用不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡,以建立不同嚴(yán)重程度的凋亡模型,為進一步篩選治療OA藥物并評價其療效及作用機制提供理論支持。

    藍、甲苯胺藍、番紅-O (購自中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司);末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移的dUTP缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyltransferase-nediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL )試劑盒(購自中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)(購自中國北京索萊寶科技有限公司)。

    1.3 兔軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 耳緣靜脈注射空氣20 ml栓塞處死白兔,無菌條件下取白兔股骨髁和脛骨平臺表面軟骨并剪碎(體積<1 mm3),加入10 ml 0.25%胰蛋白酶溶液于37 ℃水浴并振蕩30 min,以1 500 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)后棄掉胰酶,加入10 ml 0.2%Ⅱ型膠原酶于37 ℃水浴并振蕩,每2 h取上清液以1 500 r/min離心5 min(離心半徑10 cm),收集細(xì)胞,重復(fù)3次并接種于培養(yǎng)瓶中,每3 d換液1次,連續(xù)換液3次,每24 h觀察1次細(xì)胞形態(tài),連續(xù)觀察7 d。

    1.4 兔軟骨細(xì)胞鑒定

    1.4.1 兔軟骨細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測 兔軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)共2代,取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,臺盼藍染色,以1×105/ml接種于6孔板中,每孔2 ml加入經(jīng)1%(W/V)明膠處理的蓋玻片上。在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)基,以PBS清洗,加入4%多聚甲醛溶液固定30 min。分別使用甲苯胺藍染色30 min和番紅-O染色10 min,脫水,封固,空氣干燥,倒置顯微鏡下觀察蓋玻片上的軟骨細(xì)胞并拍照。

    1.4.2 兔軟骨細(xì)胞免疫熒光檢測 取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,臺盼藍染色,以1×105/ml接種于6孔板中,每孔2 ml加入經(jīng)1%(W/V)明膠處理的蓋玻片上。在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后棄掉培養(yǎng)基,以PBS清洗,加入4%多聚甲醛溶液固定30 min后,過氧化氫滅活30 min。5%正常山羊血清封閉,再加入兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體(1∶100),4 ℃過夜。PBS 清洗3次后加入Alexa 555標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶100),避光37 ℃孵育1 h,DAPI復(fù)染,PBS清洗3次。以PBS代替兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體作為陰性對照。共聚焦顯微鏡下觀察蓋玻片上的軟骨細(xì)胞并拍照。

    1.5 SNP誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型 取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,臺盼藍染色,以1×105/ml接種于96孔板內(nèi),每孔100 μl,每組各6個復(fù)孔,96孔板四周邊緣各孔加入200 μl PBS。兔軟骨細(xì)胞在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,PBS清洗1次,換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使其同步化,棄掉培養(yǎng)板中的無血清培養(yǎng)基,更換含SNP濃度為0 mmol/L、0.062 5 mmol/L、0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L和2 mmol/L的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h并進行評價。

    1.6 模型評價

    1.6.1 MTT法檢測兔軟骨細(xì)胞增殖 采用MTT法檢測兔軟骨細(xì)胞增殖。每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄掉上清液,每孔加入150 μl二甲基亞砜,置振蕩器振蕩15 min。用96孔板邊緣僅含有PBS的孔調(diào)零,在酶標(biāo)儀上檢測570 nm 波長處的吸光度(OD值),重復(fù)3次取均值。

    1.6.2 TUNEL法檢測兔軟骨細(xì)胞凋亡 取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,臺盼藍染色,以1×105/ml接種于6孔板中,每孔2 ml加入經(jīng)1%(W/V)明膠處理的蓋玻片上。在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后棄掉培養(yǎng)基,PBS清洗1次后更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,棄掉培養(yǎng)基并加入含SNP濃度為0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L和2 mmol/L的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄掉無血清培養(yǎng)基,加入4%多聚甲醛溶液固定30 min,余下步驟按試劑盒說明書進行操作。DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,顯微鏡下觀察并拍照,重復(fù)3次。凋亡的軟骨細(xì)胞核被染成棕黃色或褐色,正常細(xì)胞的細(xì)胞核被染成藍色。兔軟骨細(xì)胞凋亡率=(棕黃色或褐色兔軟骨細(xì)胞數(shù)/兔軟骨細(xì)胞總數(shù))×100%。

    2 結(jié)果

    2.1 兔軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞剛接種時呈小圓形,細(xì)胞大小相似,懸浮于培養(yǎng)液中,折光性強。培養(yǎng)8~24 h后細(xì)胞陸續(xù)貼壁,貼壁細(xì)胞輪廓清晰,呈星形(見圖1A)。第2 天細(xì)胞圓形增大,呈扁平狀并伸展為多邊形,細(xì)胞核清晰為圓形或橢圓形,可見核仁,細(xì)胞質(zhì)豐富。第3~4 天細(xì)胞聚集生長,多呈梭形,可見大多數(shù)細(xì)胞處于分裂期(見圖1B)。第5天細(xì)胞增殖明顯,緊密排列(見圖1C)。第6~7天細(xì)胞鋪滿瓶底,可見“鋪路石”樣,細(xì)胞質(zhì)回縮,分裂象少見(見圖1D)。

    2.2 兔軟骨細(xì)胞鑒定 倒置顯微鏡下:番紅-O染色可見細(xì)胞被染成紅色(見圖2A);甲苯胺藍染色可見細(xì)胞被染成藍色(見圖2B)。共聚焦顯微鏡下:Ⅱ型膠原免疫熒光染色細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜可見紅色熒光,DAPI復(fù)染后,細(xì)胞核呈藍色熒光(見圖 2C);陰性對照細(xì)胞核出現(xiàn)藍色熒光而細(xì)胞質(zhì)無紅色熒光(見圖2D)。

    2.3 模型評價

    2.3.1 兔軟骨細(xì)胞增殖檢測 不同濃度SNP誘導(dǎo)下兔軟骨細(xì)胞在不同時間點OD值比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值高于SNP濃度為0 mmol/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值均低于SNP濃度為0 mmol/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值在不同濃度間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

    注:A為第1天,B為第3天,C為第5天,D為第7天

    圖1 倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞形態(tài)(×200)

    Figure 1 The morphology of primary rabbit chondrocytes with inverted microscope

    注:A為番紅-O染色,B為甲苯胺藍染色,C為Ⅱ型膠原免疫熒光染色,D為Ⅱ型膠原免疫熒光染色陰性對照

    圖2 倒置顯微鏡和共聚焦顯微鏡下第2代兔軟骨細(xì)胞鑒定(×200)

    Figure 2 The identification of rabbit chondrocytes of passage two with inverted microscope and confocal microscope

    Table 1 Comparison of OD value of rabbit chondrocytes induced by different concentrations of SNP at different times

    SNP濃度(mmol/L)12h24h48h00.71±0.020.86±0.020.95±0.060.06250.79±0.05a1.11±0.04a1.13±0.05a0.1250.81±0.02a1.12±0.05a1.15±0.03a0.250.63±0.03ab0.57±0.02ab0.48±0.03ab0.50.56±0.01abc0.46±0.02abc0.29±0.02abc10.33±0.01abcd0.19±0.03abcd0.14±0.01abcd20.20±0.02abcde0.07±0.02abcde0.05±0.01abcdeF值85.57227.40182.60P值<0.05<0.05<0.05

    注:SNP=硝普鈉;與SNP濃度為0 mmol/L比較,aP<0.05;與SNP濃度為0.125 mmol/L比較,bP<0.05;與SNP濃度為0.25 mmol/L比較,cP<0.05;與SNP濃度為0.5 mmol/L比較,dP<0.05;與SNP濃度為1 mmol/L比較,eP<0.05

    2.3.2 兔軟骨凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 SNP濃度為0 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞排列緊密,輪廓清晰可見。12 h時,SNP濃度為0.25 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞偶見

    凋亡小體出現(xiàn),SNP濃度為0.5、1、2 mmol/L 時,隨著濃度的增加兔軟骨細(xì)胞受損程度越嚴(yán)重并可見細(xì)胞排列稀疏、皺縮明顯、凋亡小體大量出現(xiàn)甚至大片細(xì)胞脫落(見圖3A~E);24 h時細(xì)胞較12 h細(xì)胞損傷程度嚴(yán)重,在SNP濃度為0.25 mmol/L時便可見細(xì)胞脫落,凋亡小體較多出現(xiàn)(見圖3F~J);48 h時細(xì)胞形態(tài)較12、24 h體積明顯減小,細(xì)胞從SNP濃度為0.5 mmol/L時開始脫落(見圖3K~Q)。

    2.3.3 兔軟骨細(xì)胞凋亡檢測 TUNEL染色結(jié)果表明,SNP濃度為0 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞細(xì)胞核被染成藍色(見圖4A、F、K)。SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)棕色和褐色,且隨著濃度和時間的增加,棕色細(xì)胞核數(shù)目也隨之增加(見圖4B~E、G~J、L~O)。不同濃度SNP誘導(dǎo)下兔軟骨細(xì)胞在不同時間點的凋亡率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞凋亡率均高于SNP濃度為0 mmol/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且不同濃度間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

    注:A~E為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12 h時兔軟骨細(xì)胞形態(tài)變化,F(xiàn)~J為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)24 h時兔軟骨細(xì)胞形態(tài)變化,K~Q為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)48 h時兔軟骨細(xì)胞形態(tài)變化

    圖3 倒置顯微鏡下兔軟骨凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×200)

    Figure 3 The morphological observation of apoptotic cells of rabbit chondrocytes with inverted microscope

    注:A~E為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12 h時TUNEL染色,F(xiàn)~J為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)24 h時TUNEL染色,K~Q為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)48 h時TUNEL染色

    圖4 兔軟骨細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×200)

    Figure 4 The apoptosis of chondrocyte

    Table 2 Comparison of apoptosis rate of chondrocytes induced by different concentration of SNP at different times

    SNP濃度(mmol/L)12h24h48h01.55±0.342.35±0.293.50±1.300.2514.50±1.42a31.88±1.23a47.95±2.37a0.532.50±1.58ab51.88±2.07ab90.57±2.02ab174.33±2.40abc84.21±2.75abc94.93±0.95abc285.63±1.82abcd95.18±2.01abcd96.08±1.40abcdF值347.52294.17344.59P值<0.05<0.05<0.05

    注:與SNP濃度為0 mmol/L比較,aP<0.05;與SNP濃度為0.25 mmol/L比較,bP<0.05;與SNP濃度為0.5 mmol/L比較,cP<0.05;與SNP濃度為1 mmol/L比較,dP<0.05

    3 討論

    有研究發(fā)現(xiàn),藥物對OA的療效與OA的嚴(yán)重程度有關(guān)[8-9]。因此,建立合適的模型對于篩選潛在治療OA的藥物具有重要意義。采用SNP誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型雖有多項報道,但SNP濃度和作用時間各異,不利于有針對性地篩選治療OA的藥物及評價療效。Eo等[10]采用SNP濃度為1 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞24 h,Todd Allen等[11]采用SNP濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞16 h,Wu等[12]采用SNP 濃度為2 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞24 h,Terauchi等[13]和Tonomura等[14]采用SNP濃度為 0.5 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞12 h和10 h建立兔軟骨細(xì)胞凋亡模型。本研究通過不同濃度SNP、作用不同時間來考察SNP對兔軟骨細(xì)胞凋亡的影響,采用MTT法在倒置顯微鏡下觀察兔軟骨凋亡細(xì)胞形態(tài)變化,TUNEL法評價與比較了不同濃度SNP誘導(dǎo)不同嚴(yán)重程度的軟骨細(xì)胞凋亡模型。

    有研究表明,低濃度SNP(0.1 mmol/L)可激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進軟骨細(xì)胞增殖,高濃度SNP(0.5~2 mmol/L)可通過激活p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進軟骨細(xì)胞凋亡[5,15-16]。因此,在采用SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡時應(yīng)篩選出可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的SNP濃度范圍。本研究分別采用SNP濃度為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞,以建立不同嚴(yán)重程度的兔軟骨細(xì)胞凋亡模型。體外培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞可分泌糖胺聚糖以及Ⅱ型膠原等兔軟骨細(xì)胞特異性成分,證實所培養(yǎng)的細(xì)胞為兔軟骨細(xì)胞后,采用MTT法及TUNEL法比較了不同濃度SNP作用不同時間對兔軟骨細(xì)胞凋亡的影響。本研究結(jié)果顯示,SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值高于SNP濃度為0 mmol/L,SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值均低于SNP濃度為0 mmol/L,SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值在不同濃度間兩兩比較有差異。提示SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L時可促進兔軟骨細(xì)胞增殖,SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L時可抑制兔軟骨細(xì)胞增殖,能夠制備不同嚴(yán)重程度的兔軟骨細(xì)胞凋亡模型,且隨著濃度的增加對兔軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用增強。

    本研究結(jié)果顯示,SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞凋亡率均高于SNP濃度為0 mmol/L,且不同濃度間兔軟骨細(xì)胞凋亡率比較有差異,提示隨著SNP濃度的增加兔軟骨細(xì)胞凋亡率增加。本研究結(jié)果還顯示,建立凋亡率為10%~20%兔軟骨細(xì)胞凋亡模型,可采用SNP濃度為0.25 mmol/L培養(yǎng)12 h;建立凋亡率為30%~60%兔軟骨細(xì)胞凋亡模型,可采用SNP濃度為0.25 mmol/L培養(yǎng)24 h和48 h以及SNP濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)12 h和24 h;建立凋亡率為70%~90%兔軟骨細(xì)胞凋亡模型,可采用SNP濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)48 h以及SNP濃度為1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24和48 h。此外,在TUNEL實驗過程中,可采用1%明膠包被的蓋玻片來制備細(xì)胞玻片,可較好地防止細(xì)胞在后續(xù)處理過程中脫落。此外,還可適當(dāng)增加聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)破膜的時間,本研究采用1% Triton X-100 通透軟骨細(xì)胞7 min效果較好。研究中也可配制含0.1% Triton X-100的PBS作為洗液并適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和時間,可有效防止雜質(zhì)對研究結(jié)果的影響[17]。

    綜上所述,本研究利用SNP誘導(dǎo)建立軟骨細(xì)胞凋亡模型,比較了不同嚴(yán)重程度的凋亡模型,為篩選潛在治療不同嚴(yán)重程度OA的藥物提供合適的模型,便于進一步判定和探討藥物對OA的療效及藥物降低OA導(dǎo)致疼痛機制的研究。但本研究僅針對家兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進行考察,其他種屬來源的膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞尚未進行研究,而不同種屬間存在一定差異,故仍需在今后進行深入探討。

    [1]Lee AS,Ellman MB,Yan D,et al.A current review of molecular mechanisms regarding osteoarthritis and pain[J].Gene,2013,527(2):440-447.

    [2]van der Kraan PM,van den Berg WB.Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis:role in initiation and progression of cartilage degeneration[J].Osteoarthritis Cartilage,2012,20(3):223-232.

    [3]Ma J,Li A,Zhu S,et al.Response toTNF/TNFR signal transduction pathway-mediated anti-apoptosis and anti-inflammatory effects of sodium ferulate on IL-1beta-induced rat osteoarthritis chondrocytes in vitro[J].Arthritis Res Ther,2013,15 (3):408-409.

    [4]Chen Q,Liu SQ,Du YM,et al.Carboxymethyl chitosan protects rabbit chondrocytes from interleukin-1β-induced apoptosis[J].Eur J Pharmacol,2006,541 (1/2):1-8.

    [5]Wang H,Wang Z,Chen J,et al.Apoptosis induced by NO via phosphorylation of p38 MAPK that stimulates NF-kB,p53 and caspase-3 activation in rabbit articular chondrocytes[J].Cell Biol Int,2007,31(9):1027-1035.

    [6]Bhatti FU,Mehmood A,Wajid N,et al.Vitamin E protects chondrocytes against hydrogen peroxideinduced oxidative stress in vitro[J].Inflamm Res,2013,62(8):781-789.

    [7]Abramson SB,Attur M,Yazici Y.Prospects for disease modification in osteoarthritis[J].Nat Clin Pract Rheumatol,2006,2(6):304-312.

    [8]寧德花,朱瑜琪.膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎應(yīng)用透明質(zhì)酸鈉注射配合中藥熏洗治療的療效觀察與護理[J].中國全科醫(yī)學(xué),2005,8(22):1892-1893.

    [9]Chen LX.Diagnesis and treatment of ostarthritis of knee joints[J].Chinese General Practice,2009,12(4):297-298.(in Chinese) 陳臨新.膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的診療[J].中國全科醫(yī)學(xué),2009,12(4):297-298.

    [10]Eo SH,Cho H,Kim SJ.Resveratrol inhibits nitric oxide-induced apoptosis via the NF-Kappa B pathway in rabbit articular chondrocytes[J].Biomol Ther (Seoul),2013,21(5):364-370.

    [11]Todd Allen R,Robertson CM,Harwood FL,et al.Characterization of mature vs aged rabbit articular cartilage:analysis of cell density,apoptosis-related gene expression and mechanisms controlling chondrocyte apoptosis[J].Osteoarthritis Cartilage,2004,12 (11):917-923.

    [12]Wu W,Gao X,Xu X,et al.Saponin-rich fraction from Clematis chinensis Osbeck roots protects rabbit chondrocytes against nitric oxide-induced apoptosis via preventing mitochondria impairment and caspase-3 activation[J].Cytotechnology,2013,65(2):287-295.

    [13]Terauchi R,Takahashi KA,Arai Y,et al.Hsp70 prevents nitric oxide-induced apoptosis in articular chondrocytes[J].Arthritis Rheum,2003,48 (6):1562-1568.

    [14]Tonomura H,Takahashi KA,Mazda O,et al.Glutamine protects articular chondrocytes from heat stress and NO-induced apoptosis with HSP70 expression[J].Osteoarthritis Cartilage,2006,14(6):545-553.

    [15]Kim HA,Lee KB,Bae SC.The mechanism of low-concentration sodium nitroprusside mediated protection of chondrocyte death[J].Arthritis Res Ther,2005,7(3):R526-535.

    [16]Ryu JS,Jung YH,Cho MY,et al.Co-culture with human synovium-derived mesenchymal stem cells inhibits in?ammatory activity and increases cell proliferation of sodium nitroprusside-stimulated chondrocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,447 (4):715-720.

    [17]Han G,Shao H,Zhu X,et al.The protective effect of xanthan gum on interleukin-1β induced rabbit chondrocytes[J].Carbohydr Polym,2012,89 (3):870-875.

    (本文編輯:李婷婷)

    Rabbit Chondrocytes Apoptosis Models Induced by Different Concentrations of SNP

    CHENQi-xin,HANGuan-ying,GUOBin,etal.

    CollegeofPharmacy,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China

    Objective To compare the chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of sodium nitroprusside (SNP),in order to provide theoretical support for the further investigation of the regulating effect of drugs on chondrocytes apoptosis.Methods Eight 4-week-old healthy New Zealand male rabbits (weight,200-250 g) were selected from September to December in 2014.Rabbit chondrocytes were cultured and researched in vitro.Different concentrations of SNP (0.062 5,0.125,0.25,0.5,1,2 mmol/L) were used to induce rabbit chondrocytes.At 12,24 and 48 h,MTT method and TUNEL method were employed to evaluate the chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP.The OD value and apoptosis rate of rabbit chondrocytes were recorded.Results At different time points,chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP were significantly different (P<0.05) in OD value.At 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.062 5 mmol/L and 0.125 mmol/L of SNP were higher (P<0.05) than the chondrocytes apoptosis model induced by 0 mmol/L of SNP in OD value;at 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.25,0.5,1 and 2 mmol/L of SNP were lower (P<0.05) than the chondrocytes apoptosis model induced by 0 mmol/L of SNP in OD value;at 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.25,0.5,1 and 2 mmol/L of SNP were significantly different (P<0.05) in OD value.At different time points,chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP were significantly different (P<0.05) in apoptosis rate.At 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.25,0.5,1 and 2 mmol/L of SNP were higher (P<0.05) than the chondrocytes apoptosis model induced by 0 mmol/L of SNP in apoptosis rate;chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP were significantly different (P<0.05) in apoptosis rate.Conclusion Chondrocytes apoptosis models of different severity degrees can be build by SNP with the concentration ranging from 0.25 mmol/L to 2 mmol/L,which provides theoretical support for the regulating effect of drugs on chondrocytes apoptosis.

    Nitroprusside;Chondrocytes;Apoptosis

    國家自然科學(xué)基金資助項目(81302681);國家“十二五”重大新藥創(chuàng)制基金(2012ZX093016-002);遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(2013022051);遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金-奧鴻博澤基金(XZJJ20130106-02);遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金-全民口腔研究生科研創(chuàng)新基金(QM2014007)

    121001遼寧省錦州市,遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院(陳啟鑫);遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院(韓冠英,郭斌);中國科學(xué)院上海藥物研究所(韓冠英,郭躍偉)

    韓冠英,121001 遼寧省錦州市,遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院,中國科學(xué)院上海藥物研究所;E-mail:hgy19800223@163.com

    R 963

    A

    10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.y01

    2015-02-21;

    2015-06-13)

    猜你喜歡
    硝普鈉軟骨染色
    鞍區(qū)軟骨黏液纖維瘤1例
    平面圖的3-hued 染色
    簡單圖mC4的點可區(qū)別V-全染色
    原發(fā)肺軟骨瘤1例報告并文獻復(fù)習(xí)
    油紅O染色在斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)染色中的應(yīng)用
    硝普鈉聯(lián)合多巴胺治療心衰合并低血壓的療效
    分析硝普鈉治療高血壓急性心力衰竭的護理干預(yù)
    硝普鈉與多巴胺和呋塞米合用治療頑固性心衰療效觀察
    兩類冪圖的強邊染色
    注射用硝普鈉與葡萄糖注射液配伍穩(wěn)定性研究
    美女国产视频在线观看| 一个人观看的视频www高清免费观看| 久久久久网色| 精品一区二区三卡| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 久久97久久精品| 亚洲人与动物交配视频| 亚洲丝袜综合中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国内揄拍国产精品人妻在线| videossex国产| 亚洲一区高清亚洲精品| 伊人久久精品亚洲午夜| 3wmmmm亚洲av在线观看| 91在线精品国自产拍蜜月| 水蜜桃什么品种好| 久久久久久久久中文| 色网站视频免费| 日本午夜av视频| 乱人视频在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 天堂网av新在线| 欧美区成人在线视频| 26uuu在线亚洲综合色| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 免费黄色在线免费观看| 少妇的逼水好多| 国产高潮美女av| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国内精品宾馆在线| 精品久久久噜噜| 插逼视频在线观看| 精品午夜福利在线看| 一区二区三区免费毛片| 国产 一区 欧美 日韩| 国产精品一区二区在线观看99 | 久久精品夜色国产| 亚洲欧美成人精品一区二区| 欧美日韩在线观看h| 乱人视频在线观看| 中文字幕亚洲精品专区| 久久久久国产网址| 日韩制服骚丝袜av| 免费观看的影片在线观看| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 丝瓜视频免费看黄片| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 日本wwww免费看| 丝袜美腿在线中文| 精品人妻一区二区三区麻豆| av在线蜜桃| xxx大片免费视频| 免费观看的影片在线观看| 在线观看人妻少妇| 久久久亚洲精品成人影院| 国产黄a三级三级三级人| 人妻少妇偷人精品九色| 人妻一区二区av| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 国产亚洲最大av| 免费黄色在线免费观看| 人妻制服诱惑在线中文字幕| 国产成人免费观看mmmm| 日韩亚洲欧美综合| 18+在线观看网站| 日韩av在线免费看完整版不卡| 麻豆国产97在线/欧美| 成人性生交大片免费视频hd| 国产精品不卡视频一区二区| 国产黄频视频在线观看| 免费大片18禁| 丝瓜视频免费看黄片| av天堂中文字幕网| 国产亚洲91精品色在线| 国产中年淑女户外野战色| 国产午夜精品一二区理论片| 美女大奶头视频| 91在线精品国自产拍蜜月| 中文字幕制服av| 精品酒店卫生间| 久久这里只有精品中国| 国产精品久久久久久精品电影小说 | 亚洲四区av| 免费少妇av软件| av网站免费在线观看视频 | 免费黄频网站在线观看国产| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产精品女同一区二区软件| 成年av动漫网址| 亚洲av二区三区四区| www.色视频.com| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 精品久久久久久久久亚洲| 免费观看无遮挡的男女| 国产成人精品一,二区| av在线蜜桃| 一级毛片电影观看| a级毛色黄片| 伦精品一区二区三区| 亚洲精品日韩av片在线观看| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲电影在线观看av| 777米奇影视久久| 精品人妻熟女av久视频| 免费av观看视频| 国产精品福利在线免费观看| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 精品国产露脸久久av麻豆 | 亚洲不卡免费看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 精品午夜福利在线看| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲在久久综合| 黄片wwwwww| 日韩欧美精品免费久久| 成人综合一区亚洲| 久久国产乱子免费精品| 久久国内精品自在自线图片| 国产午夜精品一二区理论片| 精品久久久久久久久亚洲| 欧美成人一区二区免费高清观看| 国产激情偷乱视频一区二区| 五月伊人婷婷丁香| 国产片特级美女逼逼视频| 精品久久久久久久人妻蜜臀av| 2021天堂中文幕一二区在线观| 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美高清性xxxxhd video| 美女脱内裤让男人舔精品视频| 精品午夜福利在线看| 午夜激情欧美在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 国产精品一及| 女人被狂操c到高潮| 亚洲色图av天堂| 我的女老师完整版在线观看| 秋霞在线观看毛片| .国产精品久久| 国产成年人精品一区二区| 亚洲国产色片| 看免费成人av毛片| 高清av免费在线| 韩国高清视频一区二区三区| 国产老妇女一区| 国产国拍精品亚洲av在线观看| 少妇熟女欧美另类| 一个人看的www免费观看视频| 我的女老师完整版在线观看| 免费看av在线观看网站| 欧美最新免费一区二区三区| 日韩强制内射视频| 内地一区二区视频在线| 久久精品人妻少妇| 大片免费播放器 马上看| 中文字幕久久专区| 亚洲自拍偷在线| 97热精品久久久久久| 联通29元200g的流量卡| 日韩伦理黄色片| 国产熟女欧美一区二区| 搡老乐熟女国产| 亚洲国产成人一精品久久久| 国产爱豆传媒在线观看| 性插视频无遮挡在线免费观看| 亚洲在线自拍视频| 五月伊人婷婷丁香| 国内精品宾馆在线| 欧美不卡视频在线免费观看| 精品一区在线观看国产| videos熟女内射| 国产黄色免费在线视频| 久久久久九九精品影院| 欧美+日韩+精品| 精品久久久久久电影网| 国产精品国产三级国产专区5o| 精品酒店卫生间| 亚洲av成人av| 中文字幕免费在线视频6| 成年女人看的毛片在线观看| 久久久精品欧美日韩精品| 中文字幕免费在线视频6| 人妻夜夜爽99麻豆av| 在线观看美女被高潮喷水网站| 中文在线观看免费www的网站| 午夜日本视频在线| 亚洲国产精品成人综合色| 免费少妇av软件| 国产 一区精品| 毛片女人毛片| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产成人精品婷婷| 特大巨黑吊av在线直播| 国产乱人视频| 欧美成人一区二区免费高清观看| 欧美高清成人免费视频www| 最新中文字幕久久久久| 久久久久网色| 在线a可以看的网站| 精品午夜福利在线看| 国产精品伦人一区二区| 日韩欧美 国产精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产又色又爽无遮挡免| 中文精品一卡2卡3卡4更新| 国产精品一二三区在线看| 在线a可以看的网站| 激情 狠狠 欧美| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 久久6这里有精品| 国产探花在线观看一区二区| 久久久成人免费电影| 成人性生交大片免费视频hd| 大陆偷拍与自拍| 青春草亚洲视频在线观看| 伊人久久国产一区二区| 亚洲精品,欧美精品| 久久午夜福利片| 天堂网av新在线| 黄片wwwwww| 久久6这里有精品| 如何舔出高潮| 成人毛片a级毛片在线播放| 色吧在线观看| 午夜爱爱视频在线播放| 免费观看在线日韩| 99九九线精品视频在线观看视频| 成人欧美大片| 日韩欧美三级三区| 中文字幕亚洲精品专区| 亚洲真实伦在线观看| 97热精品久久久久久| 日韩成人伦理影院| 亚洲精品乱久久久久久| 午夜福利成人在线免费观看| 亚洲乱码一区二区免费版| 婷婷色综合www| 欧美激情国产日韩精品一区| 亚洲最大成人av| 乱码一卡2卡4卡精品| 国产黄频视频在线观看| 嫩草影院入口| 色5月婷婷丁香| 777米奇影视久久| 精品久久久久久成人av| 亚洲成人精品中文字幕电影| 少妇熟女欧美另类| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 可以在线观看毛片的网站| 日韩伦理黄色片| 五月天丁香电影| 女人久久www免费人成看片| 国产成人福利小说| 国产日韩欧美在线精品| 国产精品久久久久久精品电影| 免费看av在线观看网站| 只有这里有精品99| 大香蕉97超碰在线| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 夫妻午夜视频| 国产探花在线观看一区二区| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 亚洲美女搞黄在线观看| 91av网一区二区| 人妻少妇偷人精品九色| 天堂中文最新版在线下载 | 国产精品熟女久久久久浪| 不卡视频在线观看欧美| 成人特级av手机在线观看| 韩国高清视频一区二区三区| 永久网站在线| 能在线免费看毛片的网站| 国产伦理片在线播放av一区| 天堂√8在线中文| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 男女边摸边吃奶| 欧美成人一区二区免费高清观看| 亚洲av二区三区四区| 一级二级三级毛片免费看| 夜夜爽夜夜爽视频| 免费av毛片视频| 超碰97精品在线观看| 欧美精品一区二区大全| 亚洲av免费高清在线观看| 三级经典国产精品| 国产综合精华液| 可以在线观看毛片的网站| 美女黄网站色视频| 高清在线视频一区二区三区| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 国产乱来视频区| av网站免费在线观看视频 | 99久久九九国产精品国产免费| 国产黄a三级三级三级人| 天堂影院成人在线观看| 国产伦精品一区二区三区视频9| 久久人人爽人人片av| 亚洲欧美精品自产自拍| 能在线免费看毛片的网站| 黄色一级大片看看| 免费观看性生交大片5| 中文资源天堂在线| 91久久精品国产一区二区三区| 亚洲在线自拍视频| 精品午夜福利在线看| 久久久久久久久久久丰满| 少妇人妻一区二区三区视频| a级毛色黄片| 日韩人妻高清精品专区| 亚洲精品日本国产第一区| 全区人妻精品视频| 好男人视频免费观看在线| 九草在线视频观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 人人妻人人看人人澡| 久久久国产一区二区| 一级爰片在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 观看免费一级毛片| 亚洲精品色激情综合| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 深夜a级毛片| 51国产日韩欧美| 精品一区二区三区人妻视频| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲丝袜综合中文字幕| 午夜日本视频在线| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 久99久视频精品免费| 精品国产露脸久久av麻豆 | 亚洲精品一二三| 少妇的逼好多水| 真实男女啪啪啪动态图| 亚洲国产欧美在线一区| 精品久久久噜噜| 最近最新中文字幕免费大全7| 亚洲美女搞黄在线观看| 热99在线观看视频| 久久精品国产亚洲av天美| 精华霜和精华液先用哪个| 又爽又黄无遮挡网站| 亚洲精品自拍成人| 建设人人有责人人尽责人人享有的 | 成人鲁丝片一二三区免费| 日韩av不卡免费在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 国产精品一区二区性色av| 亚洲欧美清纯卡通| 三级国产精品欧美在线观看| 男人爽女人下面视频在线观看| 亚洲第一区二区三区不卡| 欧美日韩国产mv在线观看视频 | 99re6热这里在线精品视频| 激情五月婷婷亚洲| 国产亚洲精品av在线| 嫩草影院精品99| 91精品一卡2卡3卡4卡| 麻豆国产97在线/欧美| 成人一区二区视频在线观看| 777米奇影视久久| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99热这里只有精品一区| 99久久精品热视频| 伊人久久国产一区二区| 色吧在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国内精品一区二区在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 国产综合懂色| 亚洲精品色激情综合| 亚洲av成人精品一区久久| 爱豆传媒免费全集在线观看| 国产色婷婷99| 夫妻午夜视频| 尾随美女入室| 日本爱情动作片www.在线观看| 欧美激情国产日韩精品一区| 国产免费视频播放在线视频 | 精品欧美国产一区二区三| 人妻夜夜爽99麻豆av| 亚洲精品日本国产第一区| 欧美精品一区二区大全| 久久久久性生活片| 深夜a级毛片| 中文字幕制服av| 热99在线观看视频| 老师上课跳d突然被开到最大视频| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲精品一区蜜桃| 亚洲怡红院男人天堂| 99久久人妻综合| 国产伦精品一区二区三区视频9| 精品久久久久久久久久久久久| 热99在线观看视频| 久久久久久久亚洲中文字幕| 夫妻午夜视频| 亚洲无线观看免费| 免费观看性生交大片5| 亚洲最大成人中文| 六月丁香七月| 肉色欧美久久久久久久蜜桃 | 日韩欧美一区视频在线观看 | 少妇高潮的动态图| videossex国产| 免费观看av网站的网址| 五月天丁香电影| 久久久亚洲精品成人影院| 久久久久久久久久久丰满| 国产成人免费观看mmmm| 联通29元200g的流量卡| or卡值多少钱| 欧美激情久久久久久爽电影| 亚洲va在线va天堂va国产| 九九在线视频观看精品| 久久久久网色| 男女边摸边吃奶| 午夜激情福利司机影院| av国产免费在线观看| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产不卡一卡二| 国产久久久一区二区三区| 免费av毛片视频| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 午夜免费男女啪啪视频观看| 天美传媒精品一区二区| 老司机影院毛片| 丰满少妇做爰视频| av网站免费在线观看视频 | av在线蜜桃| 日韩 亚洲 欧美在线| 国产亚洲5aaaaa淫片| 18禁动态无遮挡网站| 国产精品av视频在线免费观看| 久久久a久久爽久久v久久| 亚洲精品色激情综合| 亚洲av中文字字幕乱码综合| 日本爱情动作片www.在线观看| 白带黄色成豆腐渣| 久久国内精品自在自线图片| 久久精品人妻少妇| 亚洲国产成人一精品久久久| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 丝瓜视频免费看黄片| 亚洲av免费在线观看| 精品国内亚洲2022精品成人| 亚洲av电影在线观看一区二区三区 | 亚洲国产高清在线一区二区三| 久久国内精品自在自线图片| 亚洲精品视频女| 99久国产av精品| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 天堂网av新在线| 男女国产视频网站| 看免费成人av毛片| 亚洲最大成人手机在线| 国产黄色免费在线视频| 国产91av在线免费观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 少妇的逼水好多| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 青春草亚洲视频在线观看| 色5月婷婷丁香| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 99热网站在线观看| 欧美97在线视频| 舔av片在线| 天天一区二区日本电影三级| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 欧美精品一区二区大全| 免费看日本二区| 色吧在线观看| 久久久久久久久中文| 欧美激情在线99| 亚洲欧美一区二区三区黑人 | 亚洲av男天堂| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 亚洲最大成人av| 白带黄色成豆腐渣| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 亚洲欧美精品专区久久| 在线观看人妻少妇| or卡值多少钱| 老司机影院毛片| 国产美女午夜福利| 91av网一区二区| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 成人亚洲精品一区在线观看 | 男女边吃奶边做爰视频| 免费看光身美女| 免费观看的影片在线观看| 亚洲精品自拍成人| 日本黄色片子视频| 街头女战士在线观看网站| 在线免费观看不下载黄p国产| 三级国产精品欧美在线观看| 亚洲人与动物交配视频| eeuss影院久久| 欧美一级a爱片免费观看看| 欧美一区二区亚洲| 国产男女超爽视频在线观看| 99热6这里只有精品| 草草在线视频免费看| 免费少妇av软件| 亚洲av一区综合| av天堂中文字幕网| 99热6这里只有精品| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 精品一区二区三卡| 久久6这里有精品| 午夜福利网站1000一区二区三区| 免费看日本二区| 精品午夜福利在线看| 搞女人的毛片| 毛片女人毛片| 免费观看a级毛片全部| 中文在线观看免费www的网站| 搡老乐熟女国产| 色网站视频免费| 久久久久性生活片| 日韩大片免费观看网站| 国产亚洲精品av在线| 性色avwww在线观看| 国产亚洲5aaaaa淫片| 中文在线观看免费www的网站| 舔av片在线| 国产av码专区亚洲av| 久久99热6这里只有精品| 一级毛片 在线播放| 91狼人影院| 一本久久精品| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品 | 成人鲁丝片一二三区免费| 日韩中字成人| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久 | 欧美最新免费一区二区三区| 国产成人aa在线观看| 搡女人真爽免费视频火全软件| 免费观看精品视频网站| 免费观看性生交大片5| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 欧美3d第一页| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 久久精品国产亚洲av涩爱| 日韩亚洲欧美综合| 看非洲黑人一级黄片| 免费人成在线观看视频色| 综合色丁香网| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 三级国产精品片| 一本—道久久a久久精品蜜桃钙片 精品乱码久久久久久99久播 | 久久亚洲国产成人精品v| 97热精品久久久久久| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产综合懂色| 一夜夜www| 国产精品一区二区性色av| 欧美极品一区二区三区四区| 色哟哟·www| 欧美激情久久久久久爽电影| 国产麻豆成人av免费视频| 国产成人91sexporn| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看| 一本久久精品| 国产午夜精品久久久久久一区二区三区| 国产成人精品一,二区| 欧美激情在线99| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 免费黄网站久久成人精品| 一级毛片电影观看| 欧美日韩综合久久久久久| 欧美3d第一页| 床上黄色一级片| 成人亚洲精品一区在线观看 | 岛国毛片在线播放| 国产片特级美女逼逼视频| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 看黄色毛片网站| 高清欧美精品videossex| 亚洲熟女精品中文字幕| 中文字幕久久专区| 精品久久久久久久末码| 只有这里有精品99| 中文字幕久久专区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 亚洲精品亚洲一区二区| 最近最新中文字幕大全电影3| 91在线精品国自产拍蜜月| 22中文网久久字幕| 日日啪夜夜爽| 日本爱情动作片www.在线观看| 久久热精品热| 国产 一区 欧美 日韩| 搡老妇女老女人老熟妇| 久久久亚洲精品成人影院| 免费黄频网站在线观看国产| 免费观看无遮挡的男女| av在线观看视频网站免费| 老女人水多毛片| 日日摸夜夜添夜夜爱| 亚洲av中文av极速乱| 国产成人a区在线观看| 日日摸夜夜添夜夜爱| 人人妻人人澡欧美一区二区| 日本一本二区三区精品|