• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型的比較研究

    2015-02-24 01:57:29陳啟鑫韓冠英郭躍偉
    中國全科醫(yī)學(xué) 2015年24期
    關(guān)鍵詞:硝普鈉軟骨染色

    陳啟鑫,韓冠英,郭 斌,郭躍偉

    ?

    ·論著·

    不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型的比較研究

    陳啟鑫,韓冠英,郭 斌,郭躍偉

    目的 比較不同濃度硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型,為進一步探討藥物對軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用提供理論支持。方法 2014年9—12月選取4周齡健康雄性新西蘭大耳白兔8只,體質(zhì)量200~250 g,體外分離培養(yǎng)并鑒定兔軟骨細(xì)胞,采用不同濃度SNP(0、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 mmol/L)誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞,分別于12、24、48 h采用四甲基偶氮唑鹽比色試驗法(MTT法)和末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移的dUTP缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)評價并比較不同濃度SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型,記錄兔軟骨細(xì)胞增殖情況(OD值)和兔軟骨細(xì)胞凋亡率。結(jié)果 不同濃度SNP誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞在不同時間點的OD值比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值高于SNP濃度為0 mmol/L(P<0.05);SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值均低于SNP濃度為0 mmol/L;SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值在不同濃度間兩兩比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。不同濃度SNP誘導(dǎo)的兔軟骨細(xì)胞在不同時間點的凋亡率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞凋亡率均高于SNP濃度為0 mmol/L(P<0.05);且不同濃度間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 SNP濃度為0.25~2 mmol/L且誘導(dǎo)12、24、48 h時可制備不同嚴(yán)重程度的軟骨細(xì)胞凋亡模型,為進一步探討藥物對軟骨細(xì)胞凋亡的調(diào)控作用提供了理論支持。

    硝普鈉;軟骨細(xì)胞;細(xì)胞凋亡

    陳啟鑫,韓冠英,郭斌,等.不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型的比較研究[J].中國全科醫(yī)學(xué),2015,18(24):2939-2945.[www.chinagp.net]

    Chen QX,Han GY,Guo B,et al.Rabbit chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP[J].Chinese General Practice,2015,18(24):2939-2945.

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病,其發(fā)病機制尚不清楚[1]。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中與修復(fù)破壞軟骨組織有關(guān)的細(xì)胞,在一定程度上能控制細(xì)胞外基質(zhì)的分布,對維持軟骨的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和組織結(jié)構(gòu)的完整性發(fā)揮著重要作用,軟骨細(xì)胞的凋亡是OA發(fā)生發(fā)展的重要原因之一[2]。目前,體外常用于誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型的途徑有過氧化氫、白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)和一氧化氮(NO)等,其中采用NO誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型是常用方法之一[3-6]。NO通過兩種途徑誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷,一種是抑制與線粒體呼吸傳遞系統(tǒng)及枸櫞酸循環(huán)相關(guān)的酶,另一種是抑制與超氧陰離子反應(yīng)生成氧化亞硝基的陰離子,其在一定條件下可分解為具有細(xì)胞毒性的OH-和NO2[7]。NO供體S-亞硝基-N-乙酰青霉胺(S-nitroso-N-acetylpenicillamine,SNAP),即硝普鈉(SNP),可產(chǎn)生外源性的NO,進而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。采用SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型的方法雖有報道,但SNP的劑量和誘導(dǎo)時間各不相同,且對不同濃度SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡比較的研究較少,不利于不同嚴(yán)重程度凋亡模型的建立,進而影響藥物對OA的療效判定及作用機制研究。本研究采用不同濃度SNP誘導(dǎo)兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡,以建立不同嚴(yán)重程度的凋亡模型,為進一步篩選治療OA的藥物并評價其療效及作用機制提供理論支持。

    1 材料與方法

    1.1 研究材料 2014年9—12月選取4周齡健康雄性新西蘭大耳白兔8只,體質(zhì)量200~250 g,合格證號:Lnyxy20140507,由遼寧醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供。實驗過程中對動物的處置經(jīng)遼寧醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準(zhǔn)。

    1.2 研究試劑 Ⅱ型膠原酶、四甲基偶氮唑鹽〔3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT〕、SNP(購自美國Sigma公司);DMEM/F-12培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(購自美國Gibco公司);Alexa 555連接的羊抗兔二抗、4,6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)(購自美國Invitrogen公司);臺盼

    本研究背景:

    骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病,其發(fā)病機制尚不清楚。目前我國OA的患病人數(shù)已達到1.5億左右,是世界上OA患病人數(shù)最多的國家之一。OA導(dǎo)致的疼痛和功能障礙將影響患者的生活質(zhì)量并給家庭和社會帶來極大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)。因此,開發(fā)有效治療OA的藥物具有很高的社會價值和應(yīng)用價值。研究表明,藥物對OA的療效與OA的嚴(yán)重程度有關(guān),故選擇合適的模型對評價藥物對OA的療效及作用機制的研究具有重要意義。采用硝普鈉誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡模型的方法雖有報道,但硝普鈉的劑量和誘導(dǎo)時間各不相同,且對不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡的比較研究較少,不利于不同嚴(yán)重程度凋亡模型的建立,進而影響藥物對OA的療效判定及作用機制研究。本研究采用不同濃度硝普鈉誘導(dǎo)兔膝骨關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞凋亡,以建立不同嚴(yán)重程度的凋亡模型,為進一步篩選治療OA藥物并評價其療效及作用機制提供理論支持。

    藍、甲苯胺藍、番紅-O (購自中國國藥集團化學(xué)試劑有限公司);末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移的dUTP缺口末端標(biāo)記法(terminal deoxynucleotidyltransferase-nediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL )試劑盒(購自中國南京凱基生物科技發(fā)展有限公司),磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution,PBS)(購自中國北京索萊寶科技有限公司)。

    1.3 兔軟骨細(xì)胞的分離和培養(yǎng) 耳緣靜脈注射空氣20 ml栓塞處死白兔,無菌條件下取白兔股骨髁和脛骨平臺表面軟骨并剪碎(體積<1 mm3),加入10 ml 0.25%胰蛋白酶溶液于37 ℃水浴并振蕩30 min,以1 500 r/min離心5 min(離心半徑10 cm)后棄掉胰酶,加入10 ml 0.2%Ⅱ型膠原酶于37 ℃水浴并振蕩,每2 h取上清液以1 500 r/min離心5 min(離心半徑10 cm),收集細(xì)胞,重復(fù)3次并接種于培養(yǎng)瓶中,每3 d換液1次,連續(xù)換液3次,每24 h觀察1次細(xì)胞形態(tài),連續(xù)觀察7 d。

    1.4 兔軟骨細(xì)胞鑒定

    1.4.1 兔軟骨細(xì)胞免疫組織化學(xué)檢測 兔軟骨細(xì)胞傳代培養(yǎng)共2代,取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,臺盼藍染色,以1×105/ml接種于6孔板中,每孔2 ml加入經(jīng)1%(W/V)明膠處理的蓋玻片上。在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)基,以PBS清洗,加入4%多聚甲醛溶液固定30 min。分別使用甲苯胺藍染色30 min和番紅-O染色10 min,脫水,封固,空氣干燥,倒置顯微鏡下觀察蓋玻片上的軟骨細(xì)胞并拍照。

    1.4.2 兔軟骨細(xì)胞免疫熒光檢測 取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,臺盼藍染色,以1×105/ml接種于6孔板中,每孔2 ml加入經(jīng)1%(W/V)明膠處理的蓋玻片上。在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后棄掉培養(yǎng)基,以PBS清洗,加入4%多聚甲醛溶液固定30 min后,過氧化氫滅活30 min。5%正常山羊血清封閉,再加入兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體(1∶100),4 ℃過夜。PBS 清洗3次后加入Alexa 555標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶100),避光37 ℃孵育1 h,DAPI復(fù)染,PBS清洗3次。以PBS代替兔抗Ⅱ型膠原單克隆抗體作為陰性對照。共聚焦顯微鏡下觀察蓋玻片上的軟骨細(xì)胞并拍照。

    1.5 SNP誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型 取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,臺盼藍染色,以1×105/ml接種于96孔板內(nèi),每孔100 μl,每組各6個復(fù)孔,96孔板四周邊緣各孔加入200 μl PBS。兔軟骨細(xì)胞在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)板中的培養(yǎng)基,PBS清洗1次,換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h使其同步化,棄掉培養(yǎng)板中的無血清培養(yǎng)基,更換含SNP濃度為0 mmol/L、0.062 5 mmol/L、0.125 mmol/L、0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L和2 mmol/L的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12、24、48 h并進行評價。

    1.6 模型評價

    1.6.1 MTT法檢測兔軟骨細(xì)胞增殖 采用MTT法檢測兔軟骨細(xì)胞增殖。每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄掉上清液,每孔加入150 μl二甲基亞砜,置振蕩器振蕩15 min。用96孔板邊緣僅含有PBS的孔調(diào)零,在酶標(biāo)儀上檢測570 nm 波長處的吸光度(OD值),重復(fù)3次取均值。

    1.6.2 TUNEL法檢測兔軟骨細(xì)胞凋亡 取第2代兔軟骨細(xì)胞制備細(xì)胞懸液,臺盼藍染色,以1×105/ml接種于6孔板中,每孔2 ml加入經(jīng)1%(W/V)明膠處理的蓋玻片上。在含10% FBS的培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h 后棄掉培養(yǎng)基,PBS清洗1次后更換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,棄掉培養(yǎng)基并加入含SNP濃度為0.25 mmol/L、0.5 mmol/L、1 mmol/L和2 mmol/L的無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。棄掉無血清培養(yǎng)基,加入4%多聚甲醛溶液固定30 min,余下步驟按試劑盒說明書進行操作。DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染,顯微鏡下觀察并拍照,重復(fù)3次。凋亡的軟骨細(xì)胞核被染成棕黃色或褐色,正常細(xì)胞的細(xì)胞核被染成藍色。兔軟骨細(xì)胞凋亡率=(棕黃色或褐色兔軟骨細(xì)胞數(shù)/兔軟骨細(xì)胞總數(shù))×100%。

    2 結(jié)果

    2.1 兔軟骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 原代培養(yǎng)的兔軟骨細(xì)胞剛接種時呈小圓形,細(xì)胞大小相似,懸浮于培養(yǎng)液中,折光性強。培養(yǎng)8~24 h后細(xì)胞陸續(xù)貼壁,貼壁細(xì)胞輪廓清晰,呈星形(見圖1A)。第2 天細(xì)胞圓形增大,呈扁平狀并伸展為多邊形,細(xì)胞核清晰為圓形或橢圓形,可見核仁,細(xì)胞質(zhì)豐富。第3~4 天細(xì)胞聚集生長,多呈梭形,可見大多數(shù)細(xì)胞處于分裂期(見圖1B)。第5天細(xì)胞增殖明顯,緊密排列(見圖1C)。第6~7天細(xì)胞鋪滿瓶底,可見“鋪路石”樣,細(xì)胞質(zhì)回縮,分裂象少見(見圖1D)。

    2.2 兔軟骨細(xì)胞鑒定 倒置顯微鏡下:番紅-O染色可見細(xì)胞被染成紅色(見圖2A);甲苯胺藍染色可見細(xì)胞被染成藍色(見圖2B)。共聚焦顯微鏡下:Ⅱ型膠原免疫熒光染色細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜可見紅色熒光,DAPI復(fù)染后,細(xì)胞核呈藍色熒光(見圖 2C);陰性對照細(xì)胞核出現(xiàn)藍色熒光而細(xì)胞質(zhì)無紅色熒光(見圖2D)。

    2.3 模型評價

    2.3.1 兔軟骨細(xì)胞增殖檢測 不同濃度SNP誘導(dǎo)下兔軟骨細(xì)胞在不同時間點OD值比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值高于SNP濃度為0 mmol/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值均低于SNP濃度為0 mmol/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值在不同濃度間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

    注:A為第1天,B為第3天,C為第5天,D為第7天

    圖1 倒置顯微鏡下觀察原代培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞形態(tài)(×200)

    Figure 1 The morphology of primary rabbit chondrocytes with inverted microscope

    注:A為番紅-O染色,B為甲苯胺藍染色,C為Ⅱ型膠原免疫熒光染色,D為Ⅱ型膠原免疫熒光染色陰性對照

    圖2 倒置顯微鏡和共聚焦顯微鏡下第2代兔軟骨細(xì)胞鑒定(×200)

    Figure 2 The identification of rabbit chondrocytes of passage two with inverted microscope and confocal microscope

    Table 1 Comparison of OD value of rabbit chondrocytes induced by different concentrations of SNP at different times

    SNP濃度(mmol/L)12h24h48h00.71±0.020.86±0.020.95±0.060.06250.79±0.05a1.11±0.04a1.13±0.05a0.1250.81±0.02a1.12±0.05a1.15±0.03a0.250.63±0.03ab0.57±0.02ab0.48±0.03ab0.50.56±0.01abc0.46±0.02abc0.29±0.02abc10.33±0.01abcd0.19±0.03abcd0.14±0.01abcd20.20±0.02abcde0.07±0.02abcde0.05±0.01abcdeF值85.57227.40182.60P值<0.05<0.05<0.05

    注:SNP=硝普鈉;與SNP濃度為0 mmol/L比較,aP<0.05;與SNP濃度為0.125 mmol/L比較,bP<0.05;與SNP濃度為0.25 mmol/L比較,cP<0.05;與SNP濃度為0.5 mmol/L比較,dP<0.05;與SNP濃度為1 mmol/L比較,eP<0.05

    2.3.2 兔軟骨凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 SNP濃度為0 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞排列緊密,輪廓清晰可見。12 h時,SNP濃度為0.25 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞偶見

    凋亡小體出現(xiàn),SNP濃度為0.5、1、2 mmol/L 時,隨著濃度的增加兔軟骨細(xì)胞受損程度越嚴(yán)重并可見細(xì)胞排列稀疏、皺縮明顯、凋亡小體大量出現(xiàn)甚至大片細(xì)胞脫落(見圖3A~E);24 h時細(xì)胞較12 h細(xì)胞損傷程度嚴(yán)重,在SNP濃度為0.25 mmol/L時便可見細(xì)胞脫落,凋亡小體較多出現(xiàn)(見圖3F~J);48 h時細(xì)胞形態(tài)較12、24 h體積明顯減小,細(xì)胞從SNP濃度為0.5 mmol/L時開始脫落(見圖3K~Q)。

    2.3.3 兔軟骨細(xì)胞凋亡檢測 TUNEL染色結(jié)果表明,SNP濃度為0 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞細(xì)胞核被染成藍色(見圖4A、F、K)。SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞細(xì)胞核出現(xiàn)棕色和褐色,且隨著濃度和時間的增加,棕色細(xì)胞核數(shù)目也隨之增加(見圖4B~E、G~J、L~O)。不同濃度SNP誘導(dǎo)下兔軟骨細(xì)胞在不同時間點的凋亡率比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞凋亡率均高于SNP濃度為0 mmol/L,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);且不同濃度間兩兩比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表2)。

    注:A~E為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12 h時兔軟骨細(xì)胞形態(tài)變化,F(xiàn)~J為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)24 h時兔軟骨細(xì)胞形態(tài)變化,K~Q為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)48 h時兔軟骨細(xì)胞形態(tài)變化

    圖3 倒置顯微鏡下兔軟骨凋亡細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察(×200)

    Figure 3 The morphological observation of apoptotic cells of rabbit chondrocytes with inverted microscope

    注:A~E為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12 h時TUNEL染色,F(xiàn)~J為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)24 h時TUNEL染色,K~Q為SNP濃度為0、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)48 h時TUNEL染色

    圖4 兔軟骨細(xì)胞凋亡情況(TUNEL染色,×200)

    Figure 4 The apoptosis of chondrocyte

    Table 2 Comparison of apoptosis rate of chondrocytes induced by different concentration of SNP at different times

    SNP濃度(mmol/L)12h24h48h01.55±0.342.35±0.293.50±1.300.2514.50±1.42a31.88±1.23a47.95±2.37a0.532.50±1.58ab51.88±2.07ab90.57±2.02ab174.33±2.40abc84.21±2.75abc94.93±0.95abc285.63±1.82abcd95.18±2.01abcd96.08±1.40abcdF值347.52294.17344.59P值<0.05<0.05<0.05

    注:與SNP濃度為0 mmol/L比較,aP<0.05;與SNP濃度為0.25 mmol/L比較,bP<0.05;與SNP濃度為0.5 mmol/L比較,cP<0.05;與SNP濃度為1 mmol/L比較,dP<0.05

    3 討論

    有研究發(fā)現(xiàn),藥物對OA的療效與OA的嚴(yán)重程度有關(guān)[8-9]。因此,建立合適的模型對于篩選潛在治療OA的藥物具有重要意義。采用SNP誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞凋亡模型雖有多項報道,但SNP濃度和作用時間各異,不利于有針對性地篩選治療OA的藥物及評價療效。Eo等[10]采用SNP濃度為1 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞24 h,Todd Allen等[11]采用SNP濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞16 h,Wu等[12]采用SNP 濃度為2 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞24 h,Terauchi等[13]和Tonomura等[14]采用SNP濃度為 0.5 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞12 h和10 h建立兔軟骨細(xì)胞凋亡模型。本研究通過不同濃度SNP、作用不同時間來考察SNP對兔軟骨細(xì)胞凋亡的影響,采用MTT法在倒置顯微鏡下觀察兔軟骨凋亡細(xì)胞形態(tài)變化,TUNEL法評價與比較了不同濃度SNP誘導(dǎo)不同嚴(yán)重程度的軟骨細(xì)胞凋亡模型。

    有研究表明,低濃度SNP(0.1 mmol/L)可激活細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶1/2(ERK1/2)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進軟骨細(xì)胞增殖,高濃度SNP(0.5~2 mmol/L)可通過激活p38信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進軟骨細(xì)胞凋亡[5,15-16]。因此,在采用SNP誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡時應(yīng)篩選出可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的SNP濃度范圍。本研究分別采用SNP濃度為0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)兔軟骨細(xì)胞,以建立不同嚴(yán)重程度的兔軟骨細(xì)胞凋亡模型。體外培養(yǎng)兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞并鑒定所培養(yǎng)的細(xì)胞可分泌糖胺聚糖以及Ⅱ型膠原等兔軟骨細(xì)胞特異性成分,證實所培養(yǎng)的細(xì)胞為兔軟骨細(xì)胞后,采用MTT法及TUNEL法比較了不同濃度SNP作用不同時間對兔軟骨細(xì)胞凋亡的影響。本研究結(jié)果顯示,SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值高于SNP濃度為0 mmol/L,SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值均低于SNP濃度為0 mmol/L,SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞OD值在不同濃度間兩兩比較有差異。提示SNP濃度為0.062 5、0.125 mmol/L時可促進兔軟骨細(xì)胞增殖,SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L時可抑制兔軟骨細(xì)胞增殖,能夠制備不同嚴(yán)重程度的兔軟骨細(xì)胞凋亡模型,且隨著濃度的增加對兔軟骨細(xì)胞增殖的抑制作用增強。

    本研究結(jié)果顯示,SNP濃度為0.25、0.5、1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24、48 h時兔軟骨細(xì)胞凋亡率均高于SNP濃度為0 mmol/L,且不同濃度間兔軟骨細(xì)胞凋亡率比較有差異,提示隨著SNP濃度的增加兔軟骨細(xì)胞凋亡率增加。本研究結(jié)果還顯示,建立凋亡率為10%~20%兔軟骨細(xì)胞凋亡模型,可采用SNP濃度為0.25 mmol/L培養(yǎng)12 h;建立凋亡率為30%~60%兔軟骨細(xì)胞凋亡模型,可采用SNP濃度為0.25 mmol/L培養(yǎng)24 h和48 h以及SNP濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)12 h和24 h;建立凋亡率為70%~90%兔軟骨細(xì)胞凋亡模型,可采用SNP濃度為0.5 mmol/L培養(yǎng)48 h以及SNP濃度為1、2 mmol/L培養(yǎng)12、24和48 h。此外,在TUNEL實驗過程中,可采用1%明膠包被的蓋玻片來制備細(xì)胞玻片,可較好地防止細(xì)胞在后續(xù)處理過程中脫落。此外,還可適當(dāng)增加聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)破膜的時間,本研究采用1% Triton X-100 通透軟骨細(xì)胞7 min效果較好。研究中也可配制含0.1% Triton X-100的PBS作為洗液并適當(dāng)增加洗滌次數(shù)和時間,可有效防止雜質(zhì)對研究結(jié)果的影響[17]。

    綜上所述,本研究利用SNP誘導(dǎo)建立軟骨細(xì)胞凋亡模型,比較了不同嚴(yán)重程度的凋亡模型,為篩選潛在治療不同嚴(yán)重程度OA的藥物提供合適的模型,便于進一步判定和探討藥物對OA的療效及藥物降低OA導(dǎo)致疼痛機制的研究。但本研究僅針對家兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞進行考察,其他種屬來源的膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞尚未進行研究,而不同種屬間存在一定差異,故仍需在今后進行深入探討。

    [1]Lee AS,Ellman MB,Yan D,et al.A current review of molecular mechanisms regarding osteoarthritis and pain[J].Gene,2013,527(2):440-447.

    [2]van der Kraan PM,van den Berg WB.Chondrocyte hypertrophy and osteoarthritis:role in initiation and progression of cartilage degeneration[J].Osteoarthritis Cartilage,2012,20(3):223-232.

    [3]Ma J,Li A,Zhu S,et al.Response toTNF/TNFR signal transduction pathway-mediated anti-apoptosis and anti-inflammatory effects of sodium ferulate on IL-1beta-induced rat osteoarthritis chondrocytes in vitro[J].Arthritis Res Ther,2013,15 (3):408-409.

    [4]Chen Q,Liu SQ,Du YM,et al.Carboxymethyl chitosan protects rabbit chondrocytes from interleukin-1β-induced apoptosis[J].Eur J Pharmacol,2006,541 (1/2):1-8.

    [5]Wang H,Wang Z,Chen J,et al.Apoptosis induced by NO via phosphorylation of p38 MAPK that stimulates NF-kB,p53 and caspase-3 activation in rabbit articular chondrocytes[J].Cell Biol Int,2007,31(9):1027-1035.

    [6]Bhatti FU,Mehmood A,Wajid N,et al.Vitamin E protects chondrocytes against hydrogen peroxideinduced oxidative stress in vitro[J].Inflamm Res,2013,62(8):781-789.

    [7]Abramson SB,Attur M,Yazici Y.Prospects for disease modification in osteoarthritis[J].Nat Clin Pract Rheumatol,2006,2(6):304-312.

    [8]寧德花,朱瑜琪.膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎應(yīng)用透明質(zhì)酸鈉注射配合中藥熏洗治療的療效觀察與護理[J].中國全科醫(yī)學(xué),2005,8(22):1892-1893.

    [9]Chen LX.Diagnesis and treatment of ostarthritis of knee joints[J].Chinese General Practice,2009,12(4):297-298.(in Chinese) 陳臨新.膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的診療[J].中國全科醫(yī)學(xué),2009,12(4):297-298.

    [10]Eo SH,Cho H,Kim SJ.Resveratrol inhibits nitric oxide-induced apoptosis via the NF-Kappa B pathway in rabbit articular chondrocytes[J].Biomol Ther (Seoul),2013,21(5):364-370.

    [11]Todd Allen R,Robertson CM,Harwood FL,et al.Characterization of mature vs aged rabbit articular cartilage:analysis of cell density,apoptosis-related gene expression and mechanisms controlling chondrocyte apoptosis[J].Osteoarthritis Cartilage,2004,12 (11):917-923.

    [12]Wu W,Gao X,Xu X,et al.Saponin-rich fraction from Clematis chinensis Osbeck roots protects rabbit chondrocytes against nitric oxide-induced apoptosis via preventing mitochondria impairment and caspase-3 activation[J].Cytotechnology,2013,65(2):287-295.

    [13]Terauchi R,Takahashi KA,Arai Y,et al.Hsp70 prevents nitric oxide-induced apoptosis in articular chondrocytes[J].Arthritis Rheum,2003,48 (6):1562-1568.

    [14]Tonomura H,Takahashi KA,Mazda O,et al.Glutamine protects articular chondrocytes from heat stress and NO-induced apoptosis with HSP70 expression[J].Osteoarthritis Cartilage,2006,14(6):545-553.

    [15]Kim HA,Lee KB,Bae SC.The mechanism of low-concentration sodium nitroprusside mediated protection of chondrocyte death[J].Arthritis Res Ther,2005,7(3):R526-535.

    [16]Ryu JS,Jung YH,Cho MY,et al.Co-culture with human synovium-derived mesenchymal stem cells inhibits in?ammatory activity and increases cell proliferation of sodium nitroprusside-stimulated chondrocytes[J].Biochem Biophys Res Commun,2014,447 (4):715-720.

    [17]Han G,Shao H,Zhu X,et al.The protective effect of xanthan gum on interleukin-1β induced rabbit chondrocytes[J].Carbohydr Polym,2012,89 (3):870-875.

    (本文編輯:李婷婷)

    Rabbit Chondrocytes Apoptosis Models Induced by Different Concentrations of SNP

    CHENQi-xin,HANGuan-ying,GUOBin,etal.

    CollegeofPharmacy,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China

    Objective To compare the chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of sodium nitroprusside (SNP),in order to provide theoretical support for the further investigation of the regulating effect of drugs on chondrocytes apoptosis.Methods Eight 4-week-old healthy New Zealand male rabbits (weight,200-250 g) were selected from September to December in 2014.Rabbit chondrocytes were cultured and researched in vitro.Different concentrations of SNP (0.062 5,0.125,0.25,0.5,1,2 mmol/L) were used to induce rabbit chondrocytes.At 12,24 and 48 h,MTT method and TUNEL method were employed to evaluate the chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP.The OD value and apoptosis rate of rabbit chondrocytes were recorded.Results At different time points,chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP were significantly different (P<0.05) in OD value.At 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.062 5 mmol/L and 0.125 mmol/L of SNP were higher (P<0.05) than the chondrocytes apoptosis model induced by 0 mmol/L of SNP in OD value;at 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.25,0.5,1 and 2 mmol/L of SNP were lower (P<0.05) than the chondrocytes apoptosis model induced by 0 mmol/L of SNP in OD value;at 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.25,0.5,1 and 2 mmol/L of SNP were significantly different (P<0.05) in OD value.At different time points,chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP were significantly different (P<0.05) in apoptosis rate.At 12,24 and 48 h,chondrocytes apoptosis models induced by 0.25,0.5,1 and 2 mmol/L of SNP were higher (P<0.05) than the chondrocytes apoptosis model induced by 0 mmol/L of SNP in apoptosis rate;chondrocytes apoptosis models induced by different concentrations of SNP were significantly different (P<0.05) in apoptosis rate.Conclusion Chondrocytes apoptosis models of different severity degrees can be build by SNP with the concentration ranging from 0.25 mmol/L to 2 mmol/L,which provides theoretical support for the regulating effect of drugs on chondrocytes apoptosis.

    Nitroprusside;Chondrocytes;Apoptosis

    國家自然科學(xué)基金資助項目(81302681);國家“十二五”重大新藥創(chuàng)制基金(2012ZX093016-002);遼寧省自然科學(xué)基金資助項目(2013022051);遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金-奧鴻博澤基金(XZJJ20130106-02);遼寧醫(yī)學(xué)院校長基金-全民口腔研究生科研創(chuàng)新基金(QM2014007)

    121001遼寧省錦州市,遼寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院(陳啟鑫);遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院(韓冠英,郭斌);中國科學(xué)院上海藥物研究所(韓冠英,郭躍偉)

    韓冠英,121001 遼寧省錦州市,遼寧醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院,中國科學(xué)院上海藥物研究所;E-mail:hgy19800223@163.com

    R 963

    A

    10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.y01

    2015-02-21;

    2015-06-13)

    猜你喜歡
    硝普鈉軟骨染色
    鞍區(qū)軟骨黏液纖維瘤1例
    平面圖的3-hued 染色
    簡單圖mC4的點可區(qū)別V-全染色
    原發(fā)肺軟骨瘤1例報告并文獻復(fù)習(xí)
    油紅O染色在斑馬魚體內(nèi)脂質(zhì)染色中的應(yīng)用
    硝普鈉聯(lián)合多巴胺治療心衰合并低血壓的療效
    分析硝普鈉治療高血壓急性心力衰竭的護理干預(yù)
    硝普鈉與多巴胺和呋塞米合用治療頑固性心衰療效觀察
    兩類冪圖的強邊染色
    注射用硝普鈉與葡萄糖注射液配伍穩(wěn)定性研究
    亚洲,欧美,日韩| av国产久精品久网站免费入址| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 国产精品欧美亚洲77777| 中文字幕亚洲精品专区| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频 | 亚洲国产成人一精品久久久| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 丰满少妇做爰视频| 亚洲av.av天堂| av天堂中文字幕网| 久久久久久久大尺度免费视频| 日本av手机在线免费观看| 我的女老师完整版在线观看| 99国产精品免费福利视频| 色视频www国产| av国产久精品久网站免费入址| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 自拍偷自拍亚洲精品老妇| 中文字幕制服av| 99九九在线精品视频 | 午夜免费鲁丝| 免费观看a级毛片全部| 插逼视频在线观看| 日韩欧美一区视频在线观看 | 尾随美女入室| 亚洲av成人精品一区久久| av在线老鸭窝| 在线观看www视频免费| 性色av一级| 久久狼人影院| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日日啪夜夜撸| 久久久久人妻精品一区果冻| 99九九在线精品视频 | 黄色日韩在线| 91午夜精品亚洲一区二区三区| 久久国产乱子免费精品| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国产男人的电影天堂91| 麻豆成人午夜福利视频| 一区二区三区精品91| 精品视频人人做人人爽| 亚洲精品一区蜜桃| 熟女人妻精品中文字幕| av卡一久久| 日韩强制内射视频| 亚洲熟女精品中文字幕| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 国产精品蜜桃在线观看| 国产黄片视频在线免费观看| 啦啦啦在线观看免费高清www| 少妇人妻一区二区三区视频| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 欧美另类一区| 91久久精品国产一区二区成人| 91在线精品国自产拍蜜月| a级毛片在线看网站| 久热久热在线精品观看| 日韩强制内射视频| 日韩三级伦理在线观看| 国产真实伦视频高清在线观看| 色网站视频免费| 一个人看视频在线观看www免费| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产爽快片一区二区三区| 精品人妻熟女av久视频| 热re99久久国产66热| a级毛片免费高清观看在线播放| 又粗又硬又长又爽又黄的视频| 欧美bdsm另类| 少妇精品久久久久久久| 97在线视频观看| 成年人免费黄色播放视频 | 丰满迷人的少妇在线观看| 大码成人一级视频| 日韩av不卡免费在线播放| 久久久久久久久久成人| 国产深夜福利视频在线观看| 亚洲欧美一区二区三区国产| 性色av一级| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 永久免费av网站大全| 免费观看av网站的网址| 七月丁香在线播放| 久久韩国三级中文字幕| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 纯流量卡能插随身wifi吗| 日韩精品免费视频一区二区三区 | av.在线天堂| 亚洲伊人久久精品综合| 久久精品久久精品一区二区三区| a 毛片基地| 99热全是精品| 水蜜桃什么品种好| 亚洲精品乱久久久久久| 中国国产av一级| 国产一区二区三区av在线| 九九在线视频观看精品| 久久热精品热| 少妇的逼水好多| 国产免费福利视频在线观看| 狂野欧美激情性bbbbbb| 一级毛片 在线播放| 一级二级三级毛片免费看| 久久鲁丝午夜福利片| 韩国高清视频一区二区三区| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 成年人免费黄色播放视频 | 欧美精品亚洲一区二区| 欧美3d第一页| a级片在线免费高清观看视频| 国产高清国产精品国产三级| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 我要看日韩黄色一级片| 日韩亚洲欧美综合| 久久久国产欧美日韩av| 内射极品少妇av片p| 午夜福利网站1000一区二区三区| 日本wwww免费看| 成人漫画全彩无遮挡| 亚洲欧美清纯卡通| 亚洲国产成人一精品久久久| 欧美高清成人免费视频www| 插逼视频在线观看| 精品国产一区二区久久| 免费观看性生交大片5| 卡戴珊不雅视频在线播放| 午夜激情福利司机影院| 亚洲人成网站在线观看播放| 少妇熟女欧美另类| 一级,二级,三级黄色视频| 成年女人在线观看亚洲视频| 99久国产av精品国产电影| 日日摸夜夜添夜夜爱| 91在线精品国自产拍蜜月| 国产日韩一区二区三区精品不卡 | 午夜91福利影院| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久99热这里只频精品6学生| av国产久精品久网站免费入址| 国产精品一二三区在线看| 99久久人妻综合| 成人午夜精彩视频在线观看| 熟女电影av网| 七月丁香在线播放| 能在线免费看毛片的网站| 一级av片app| 男女无遮挡免费网站观看| 国产精品一区二区在线观看99| 精品熟女少妇av免费看| 精品国产乱码久久久久久小说| 一级a做视频免费观看| 最近中文字幕高清免费大全6| 欧美xxxx性猛交bbbb| 中文在线观看免费www的网站| 亚洲在久久综合| 久久久午夜欧美精品| 在线观看三级黄色| 国产精品久久久久成人av| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 熟女av电影| 免费观看av网站的网址| 日本wwww免费看| 日本av手机在线免费观看| 亚洲欧美中文字幕日韩二区| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 国产精品久久久久久久电影| 五月伊人婷婷丁香| 校园人妻丝袜中文字幕| 亚洲成人一二三区av| 成人美女网站在线观看视频| a级毛片在线看网站| av又黄又爽大尺度在线免费看| 99久久综合免费| 久久久国产欧美日韩av| 欧美三级亚洲精品| 一级片'在线观看视频| 99热全是精品| 免费看不卡的av| 国产成人精品无人区| 99久久中文字幕三级久久日本| 亚洲,一卡二卡三卡| 亚洲国产精品成人久久小说| 久久这里有精品视频免费| 麻豆成人av视频| av视频免费观看在线观看| 女人精品久久久久毛片| 国产精品99久久久久久久久| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产在线男女| 日韩成人伦理影院| 不卡视频在线观看欧美| 夫妻性生交免费视频一级片| 亚洲av二区三区四区| 女性生殖器流出的白浆| 大香蕉久久网| av.在线天堂| a级毛片在线看网站| 国产欧美日韩综合在线一区二区 | 女人久久www免费人成看片| 一级,二级,三级黄色视频| 少妇人妻久久综合中文| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 国产熟女欧美一区二区| 亚洲国产精品专区欧美| 色婷婷久久久亚洲欧美| 极品教师在线视频| 在线精品无人区一区二区三| 日韩一本色道免费dvd| 精品久久久久久久久av| 色婷婷久久久亚洲欧美| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 黄片无遮挡物在线观看| 人妻人人澡人人爽人人| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 亚洲av二区三区四区| 日韩免费高清中文字幕av| 日本-黄色视频高清免费观看| 日韩一区二区视频免费看| 精品人妻熟女av久视频| 久久人人爽人人片av| 91精品国产九色| 国产乱人偷精品视频| 一级毛片aaaaaa免费看小| 国产又色又爽无遮挡免| 伊人久久精品亚洲午夜| 欧美日韩综合久久久久久| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 三级国产精品欧美在线观看| freevideosex欧美| 看非洲黑人一级黄片| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 亚洲怡红院男人天堂| 欧美国产精品一级二级三级 | 九九爱精品视频在线观看| 国产亚洲精品久久久com| 亚洲,一卡二卡三卡| 好男人视频免费观看在线| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 天美传媒精品一区二区| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 国产日韩欧美视频二区| 黑人巨大精品欧美一区二区蜜桃 | 久久精品久久精品一区二区三区| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久久网色| 久久久久久久大尺度免费视频| 青春草视频在线免费观看| 亚洲在久久综合| 永久网站在线| 日本与韩国留学比较| 极品人妻少妇av视频| 亚洲精品国产色婷婷电影| 男男h啪啪无遮挡| 久久精品久久久久久久性| 日本黄色日本黄色录像| 最新中文字幕久久久久| 人妻少妇偷人精品九色| 亚洲国产精品999| 亚洲熟女精品中文字幕| 一区二区三区乱码不卡18| 国产伦理片在线播放av一区| 日本色播在线视频| 免费在线观看成人毛片| 成人免费观看视频高清| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91 | 免费av不卡在线播放| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 国产熟女午夜一区二区三区 | 国产高清三级在线| 熟女av电影| 五月开心婷婷网| 日韩av在线免费看完整版不卡| 一区二区av电影网| 黑人猛操日本美女一级片| 最后的刺客免费高清国语| 嘟嘟电影网在线观看| 久热这里只有精品99| 在线看a的网站| 亚洲美女视频黄频| 免费高清在线观看视频在线观看| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 日日爽夜夜爽网站| 中国国产av一级| 精品一区二区三区视频在线| 国产日韩欧美亚洲二区| 午夜福利,免费看| 我的老师免费观看完整版| 男女国产视频网站| 国产淫片久久久久久久久| 一级爰片在线观看| 成人亚洲欧美一区二区av| 五月伊人婷婷丁香| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国内精品宾馆在线| 超碰97精品在线观看| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 97在线视频观看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产色婷婷99| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 精品一区二区免费观看| 亚洲高清免费不卡视频| 丝瓜视频免费看黄片| 看免费成人av毛片| 国产精品偷伦视频观看了| 国产伦精品一区二区三区视频9| 欧美少妇被猛烈插入视频| 国产亚洲精品久久久com| 精品99又大又爽又粗少妇毛片| 欧美高清成人免费视频www| 亚洲一区二区三区欧美精品| 一级毛片 在线播放| 国产精品女同一区二区软件| 中文乱码字字幕精品一区二区三区| 性色av一级| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产伦精品一区二区三区四那| 国产男女超爽视频在线观看| 日本与韩国留学比较| 国产男女内射视频| 在线免费观看不下载黄p国产| 在线亚洲精品国产二区图片欧美 | 美女大奶头黄色视频| 黄色一级大片看看| 亚洲精品日韩在线中文字幕| 精品一区二区免费观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 女性被躁到高潮视频| 人妻系列 视频| 精品久久久噜噜| 女人久久www免费人成看片| av在线观看视频网站免费| 黑人高潮一二区| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 国产亚洲一区二区精品| 乱码一卡2卡4卡精品| 天天操日日干夜夜撸| av免费在线看不卡| 国产成人a∨麻豆精品| 婷婷色av中文字幕| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 天天操日日干夜夜撸| 五月玫瑰六月丁香| 国产在视频线精品| 亚洲精品一区蜜桃| 成人亚洲精品一区在线观看| 精华霜和精华液先用哪个| 只有这里有精品99| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 亚洲精品乱久久久久久| 久久国产亚洲av麻豆专区| 国产精品久久久久久久久免| 国产熟女欧美一区二区| 国产伦精品一区二区三区视频9| 男女边吃奶边做爰视频| 亚洲欧美日韩卡通动漫| a 毛片基地| 久久久a久久爽久久v久久| 国产毛片在线视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 视频区图区小说| 精品少妇久久久久久888优播| 亚洲人与动物交配视频| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 欧美最新免费一区二区三区| 亚洲欧洲国产日韩| av在线播放精品| 三级国产精品片| kizo精华| 中文欧美无线码| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 国产 精品1| 精品一品国产午夜福利视频| 欧美xxⅹ黑人| 国产高清国产精品国产三级| 精品亚洲成a人片在线观看| 久久99一区二区三区| 能在线免费看毛片的网站| 尾随美女入室| 大码成人一级视频| 极品教师在线视频| 国产熟女午夜一区二区三区 | 人妻 亚洲 视频| 免费黄色在线免费观看| 免费人成在线观看视频色| 国产成人精品福利久久| 汤姆久久久久久久影院中文字幕| 日韩精品有码人妻一区| 777米奇影视久久| 大片电影免费在线观看免费| 91精品国产国语对白视频| 国产色婷婷99| 色网站视频免费| 中国国产av一级| 老女人水多毛片| 亚洲美女黄色视频免费看| 一本久久精品| 国产又色又爽无遮挡免| 又大又黄又爽视频免费| 国产黄色视频一区二区在线观看| 少妇的逼水好多| 亚洲精品乱久久久久久| 在线观看人妻少妇| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| 日韩电影二区| 五月玫瑰六月丁香| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 少妇丰满av| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 国产精品久久久久久久电影| av免费在线看不卡| 99精国产麻豆久久婷婷| a级毛片在线看网站| 免费播放大片免费观看视频在线观看| 国产亚洲91精品色在线| 在线观看美女被高潮喷水网站| 在线免费观看不下载黄p国产| 色5月婷婷丁香| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 日韩三级伦理在线观看| 国产精品三级大全| 国模一区二区三区四区视频| 欧美成人午夜免费资源| 另类精品久久| 97超碰精品成人国产| 91aial.com中文字幕在线观看| 日本vs欧美在线观看视频 | 亚洲av免费高清在线观看| 日韩成人av中文字幕在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 婷婷色综合大香蕉| 青春草国产在线视频| 人人妻人人看人人澡| 午夜福利网站1000一区二区三区| 国产亚洲欧美精品永久| 欧美丝袜亚洲另类| 深夜a级毛片| 亚洲国产欧美日韩在线播放 | 26uuu在线亚洲综合色| 五月天丁香电影| 三级国产精品片| 免费观看在线日韩| 美女福利国产在线| 国产午夜精品一二区理论片| 亚洲情色 制服丝袜| 国产探花极品一区二区| av天堂久久9| 大片免费播放器 马上看| 欧美高清成人免费视频www| 在线观看三级黄色| 91成人精品电影| 国产亚洲欧美精品永久| 国产色爽女视频免费观看| 69精品国产乱码久久久| 丰满人妻一区二区三区视频av| 国产淫片久久久久久久久| 久久热精品热| 国产在视频线精品| 精品国产露脸久久av麻豆| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲精品第二区| 2022亚洲国产成人精品| 欧美精品亚洲一区二区| 亚洲经典国产精华液单| 国产精品久久久久成人av| 久久亚洲国产成人精品v| 观看av在线不卡| 熟女人妻精品中文字幕| 少妇高潮的动态图| 成人无遮挡网站| 99re6热这里在线精品视频| 国产成人精品婷婷| 精品亚洲成a人片在线观看| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| a级毛色黄片| freevideosex欧美| 国产成人a∨麻豆精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 国产男女内射视频| 亚洲久久久国产精品| 亚洲高清免费不卡视频| 人妻夜夜爽99麻豆av| 春色校园在线视频观看| 亚洲av国产av综合av卡| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 久久久久久久精品精品| 看十八女毛片水多多多| 嫩草影院新地址| 国产av精品麻豆| 国产老妇伦熟女老妇高清| 国产成人精品福利久久| 人人澡人人妻人| 波野结衣二区三区在线| 高清不卡的av网站| 肉色欧美久久久久久久蜜桃| 成人影院久久| 久久久久久久亚洲中文字幕| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 精品卡一卡二卡四卡免费| 人人妻人人看人人澡| 黑人猛操日本美女一级片| 国产免费一区二区三区四区乱码| 亚洲久久久国产精品| 午夜91福利影院| 日韩电影二区| av又黄又爽大尺度在线免费看| 国产精品久久久久久久久免| 久久精品国产亚洲av涩爱| 亚洲精品日韩av片在线观看| 国产精品蜜桃在线观看| 日本午夜av视频| tube8黄色片| 亚洲熟女精品中文字幕| 亚洲精品成人av观看孕妇| 国产一区二区三区av在线| 啦啦啦中文免费视频观看日本| 精品亚洲乱码少妇综合久久| 欧美bdsm另类| 中文字幕免费在线视频6| 国产免费又黄又爽又色| 国产一区亚洲一区在线观看| 免费黄频网站在线观看国产| 久久热精品热| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 成人亚洲欧美一区二区av| 七月丁香在线播放| 日日撸夜夜添| 国产亚洲91精品色在线| 极品教师在线视频| 中文字幕人妻丝袜制服| 国产亚洲最大av| 久久久久久久大尺度免费视频| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 中国三级夫妇交换| 日韩亚洲欧美综合| 18+在线观看网站| 人人妻人人澡人人爽人人夜夜| 黑人高潮一二区| 免费黄色在线免费观看| 国产在线免费精品| 婷婷色麻豆天堂久久| 久久韩国三级中文字幕| 国产伦精品一区二区三区四那| 久久久久精品久久久久真实原创| 日韩亚洲欧美综合| 亚洲精品中文字幕在线视频 | 纵有疾风起免费观看全集完整版| 国产在视频线精品| 国产黄频视频在线观看| 亚洲av综合色区一区| 亚洲精品乱久久久久久| 精品久久久噜噜| 观看美女的网站| 国产伦理片在线播放av一区| 免费大片18禁| 国产精品不卡视频一区二区| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 中文字幕久久专区| 亚洲经典国产精华液单| 免费av不卡在线播放| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 777米奇影视久久| 国产精品久久久久久久久免| 欧美xxⅹ黑人| 一级毛片久久久久久久久女| 丰满饥渴人妻一区二区三| 大话2 男鬼变身卡| 亚洲精品色激情综合| 女性生殖器流出的白浆| 永久免费av网站大全| 纵有疾风起免费观看全集完整版| av在线播放精品| 自线自在国产av| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 黑人猛操日本美女一级片| 亚洲精品456在线播放app| 麻豆成人av视频| 久久久国产精品麻豆| 久久热精品热| 欧美国产精品一级二级三级 | 久久人妻熟女aⅴ| 午夜久久久在线观看| 欧美丝袜亚洲另类| 老熟女久久久| 成人毛片a级毛片在线播放| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲av福利一区| 国产91av在线免费观看| 亚洲欧美成人综合另类久久久| 黄色视频在线播放观看不卡| 久久热精品热| 一级黄片播放器| 一区二区三区精品91| 国产精品一区二区在线不卡| 欧美激情国产日韩精品一区| 9色porny在线观看| 少妇人妻精品综合一区二区| 三级国产精品欧美在线观看| 欧美日韩av久久| 日韩一区二区视频免费看| 亚洲国产欧美在线一区| 国产日韩欧美视频二区| 我的女老师完整版在线观看| 亚洲三级黄色毛片| 精品一区在线观看国产| 久久精品熟女亚洲av麻豆精品| 男男h啪啪无遮挡| 亚洲电影在线观看av| 久久人人爽av亚洲精品天堂|