bcl-2小分子干擾RNA對(duì)人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞阿霉素敏感性的影響

周夫群，黃章騫，何 堯

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·論著·

bcl-2小分子干擾RNA對(duì)人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞阿霉素敏感性的影響

周夫群，黃章騫，何 堯

目的 研究靶向bcl-2小分子干擾RNA(siRNA)干擾序列對(duì)人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞阿霉素(DOX)敏感性的影響及相關(guān)作用機(jī)制。方法 2014年5—8月，將siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞，設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：空白對(duì)照組、bcl-2 siRNA干擾組(轉(zhuǎn)染bcl-2 siRNA干擾序列)及陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染siRNA空載序列)，檢測(cè)bcl-2 siRNA干擾組的轉(zhuǎn)染效率和3組bcl-2表達(dá)水平。將細(xì)胞隨機(jī)分成5組，分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染siRNA空載序列)、干擾組(轉(zhuǎn)染bcl-2 siRNA干擾序列)、DOX組(加入5 μg/ml DOX)、聯(lián)合組(轉(zhuǎn)染siRNA干擾序列并加入5 μg/ml DOX)，檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡率、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9活性及細(xì)胞色素C水平。結(jié)果 siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為(94.6±12.5)%。3組bcl-2表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.75，P<0.05)。bcl-2 siRNA干擾組bcl-2表達(dá)水平低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(q=3.99、2.87，P<0.01)。5組細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.52，P<0.05)。干擾組、DOX組、聯(lián)合組細(xì)胞活力低于空白對(duì)照組(q=7.66、8.64、6.89，P<0.05)；聯(lián)合組細(xì)胞活力低于DOX組(q=6.76，P<0.01)。5組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=112.34，P<0.05)。干擾組、DOX組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組(q=5.78、4.99、6.21，P<0.05)；聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率高于DOX組(q=4.89，P<0.01)。5組Caspase-3、Caspase-9活性及細(xì)胞色素C水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干擾組、DOX組、聯(lián)合組Caspase-3、Caspase-9活性及細(xì)胞色素C水平高于空白對(duì)照組(P<0.05)；DOX組、聯(lián)合組Caspase-3活性高于陰性對(duì)照組，干擾組、DOX組、聯(lián)合組Caspase-9活性高于陰性對(duì)照組(P<0.05)；聯(lián)合組Caspase-3活性高于干擾組，DOX組、聯(lián)合組Caspase-9活性高于干擾組(P<0.05)；聯(lián)合組Caspase-3、Caspase-9活性及細(xì)胞色素C水平高于DOX組(P<0.05)。結(jié)論 靶向bcl-2 siRNA干擾序列可以增強(qiáng)人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞的DOX敏感性，bcl-2可作為人子宮內(nèi)膜癌基因治療的候選靶點(diǎn)。

子宮內(nèi)膜腫瘤；基因,bcl-2；RNA,小分子干擾；阿霉素；半胱氨酸蛋白酶類

周夫群，黃章騫，何堯.bcl-2小分子干擾RNA對(duì)人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞阿霉素敏感性的影響[J].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2015，18(24)：2917-2921.[www.chinagp.net]

Zhou FQ,Huang ZQ,He Y.Influence of bcl-2 small interference RNA on the sensibility of endometrial carcinoma RL-952 cells to doxorubicin[J].Chinese General Practice，2015，18(24)：2917-2921.

子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma)是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤，好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后女性。子宮內(nèi)膜癌是最常見(jiàn)的女性生殖系統(tǒng)腫瘤之一，每年有接近20萬(wàn)的新發(fā)病例，是導(dǎo)致死亡的第3位常見(jiàn)婦科惡性腫瘤(僅次于卵巢癌和宮頸癌)[1-2]。目前，我國(guó)已進(jìn)入了老齡化社會(huì)，隨著老年人口數(shù)量的增加，子宮內(nèi)膜癌患者中老年人比例也隨之增加。由于老年患者多伴有并發(fā)癥，加之一些重要器官如：肝臟、腎臟、骨髓生理功能減弱，進(jìn)而耐受放療、化療的能力也隨之減弱，因此，開(kāi)辟新的治療途徑迫在眉睫。

小分子干擾RNA(small interference RNA，siRNA)技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展的一種特異性抑制基因表達(dá)的新方法，通過(guò)具有同源性的雙鏈RNA(dsRNA)迅速阻斷mRNA表達(dá)活性，誘導(dǎo)序列特異的靶基因沉默，是分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室中一種強(qiáng)大的實(shí)驗(yàn)工具[3-5]。本研究通過(guò)siRNA技術(shù)抑制人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞中bcl-2基因的表達(dá)，同時(shí)聯(lián)合化療藥物阿霉素(doxorubicin，DOX)，以觀察其聯(lián)合作用對(duì)人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞活力及凋亡的影響，初步探討相關(guān)作用機(jī)制，為臨床治療子宮內(nèi)膜癌提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和試劑 人子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞株RL-952購(gòu)買于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)和RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自HyClone公司。DOX購(gòu)自武漢三洹醫(yī)藥化工有限公司。bcl-2 siRNA干擾序列及轉(zhuǎn)染試劑盒由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成。細(xì)胞裂解液、半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3、Caspase-9和細(xì)胞色素C活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。BCA蛋白定量試劑盒、鼠抗人β-actin一抗、鼠抗人bcl-2一抗和羊抗鼠二抗均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司。Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。四甲基氮唑藍(lán)(methylthiaLzolyItetraLzolium，MTT)粉末購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 研究方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 2014年5—8月，人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基中，經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化傳代后置于37 ℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天傳代。

1.2.2 siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞并檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液(3.0×105/ml)接種在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2.0 ml細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，參照脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染操作。設(shè)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組：空白對(duì)照組、bcl-2 siRNA干擾組(轉(zhuǎn)染bcl-2 siRNA干擾序列)及陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染siRNA空載序列)。孵育4 h后更換常規(guī)新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)20 h，收集細(xì)胞驗(yàn)證bcl-2 siRNA干擾組轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3 檢測(cè)bcl-2表達(dá)水平 用2 ml預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)淋洗3組細(xì)胞后，每孔加入500 μl細(xì)胞裂解液，按照說(shuō)明書(shū)步驟提取蛋白，采用BCA蛋白定量試劑盒調(diào)整蛋白水平，制作聚丙烯酰胺濃縮膠和分離膠，每組取40 μg蛋白樣品進(jìn)行電泳，經(jīng)轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗(鼠抗人β-actin一抗、鼠抗人bcl-2一抗)和二抗(羊抗鼠二抗)孵育和洗滌(一抗稀釋比為1∶500；二抗稀釋比為1∶3 000)。ECL顯色后，經(jīng)全自動(dòng)電泳凝膠分析系統(tǒng)掃描曝光并通過(guò)Gene Tool軟件分析各組bcl-2表達(dá)水平。

1.2.4 檢測(cè)細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，以每孔5.0×103個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中。隨機(jī)分成5組，分別為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組(轉(zhuǎn)染siRNA空載序列)、干擾組(轉(zhuǎn)染bcl-2 siRNA干擾序列)、DOX組(加入5 μg/ml DOX)、聯(lián)合組(轉(zhuǎn)染siRNA干擾序列并加入5 μg/ml DOX)，每組設(shè)8個(gè)復(fù)孔，DOX濃度參照本實(shí)驗(yàn)室前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。處理24 h后，2 000 r/min離心10 min(離心半徑3 cm)，棄上清液，每孔加入100 μl MTT溶液(終濃度為0.05 mg/ml)，37 ℃避光繼續(xù)孵育4 h，2 000 r/min離心10 min(離心半徑3 cm)，棄上清液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)溶解結(jié)晶，酶標(biāo)儀讀取吸光度(A540值)。

1.2.5 檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以每孔6.0×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板中。分組方法同上，人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞按細(xì)胞活力檢測(cè)方法處理24 h后，預(yù)冷PBS洗滌2次，0.25%胰酶消化，以1 500 r/min離心10 min(離心半徑3 cm)，收集細(xì)胞，制備成濃度為5.0×106/ml的單細(xì)胞懸液；取100 μl細(xì)胞懸液，加入400 μl 1×Binding Buffer重懸細(xì)胞，分別加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI溶液混勻，室溫避光孵育20 min，流式細(xì)胞儀上檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.6 檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9活性及細(xì)胞色素C水平 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，將2.0×107個(gè)細(xì)胞接種于25 ml細(xì)胞培養(yǎng)瓶中。分組方法同上，人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞按細(xì)胞活力檢測(cè)方法處理24 h后，制備成單細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度至1.0×107/ml，每107個(gè)細(xì)胞加入1 ml細(xì)胞裂解液，參照試劑盒方法分別提取總蛋白和胞質(zhì)蛋白，其中，總蛋白用于檢測(cè)Caspase-3、Caspase-9活性，胞質(zhì)蛋白用于檢測(cè)胞質(zhì)細(xì)胞色素C水平，檢測(cè)步驟按ELISA試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染效率 bcl-2 siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為(94.6±12.5)%。

2.2 bcl-2表達(dá)水平比較 空白對(duì)照組bcl-2表達(dá)水平為(1.109±0.002)，bcl-2 siRNA干擾組為(0.447±0.001)，陰性對(duì)照組為(1.126±0.004)。各組bcl-2 表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.75，P<0.05)。bcl-2 siRNA干擾組bcl-2 表達(dá)水平低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=3.99、2.87，P<0.01，見(jiàn)圖1)。

注：siRNA=小分子干擾RNA

圖1 bcl-2表達(dá)水平

Figure 1 Expression level of bcl-2

2.3 細(xì)胞活力比較 空白對(duì)照組細(xì)胞活力為(100.0±0.2)%，陰性對(duì)照組為(99.5±1.8)%，干擾組為(83.0±3.6)%，DOX組為(79.0±0.7)%，聯(lián)合組為(63.0±1.6)%。5組細(xì)胞活力比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=42.52，P<0.05)。干擾組、DOX組、聯(lián)合組細(xì)胞活力低于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=7.66、8.64、6.89，P<0.05)；聯(lián)合組細(xì)胞活力低于DOX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=6.76，P<0.01)。

2.4 細(xì)胞凋亡率比較 空白對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為(2.3±0.2)%，陰性對(duì)照組為(3.4±0.4)%，干擾組為(18.4±1.2)%，DOX組為(22.3±4.2)%，聯(lián)合組為(39.2±3.7)%。5組細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=112.34，P<0.05)。干擾組、DOX組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=5.78、4.99、6.21，P<0.05)；聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率高于DOX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(q=4.89，P<0.01)。

2.5 Caspase-3、Caspase-9活性及細(xì)胞色素C水平比較 各組Caspase-3、Caspase-9活性及細(xì)胞色素C水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。干擾組、DOX組、聯(lián)合組Caspase-3、Caspase-9活性及細(xì)胞色素C水平高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；DOX組、聯(lián)合組Caspase-3活性高于陰性對(duì)照組，干擾組、DOX組、聯(lián)合組Caspase-9活性高于陰性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組Caspase-3活性高于干擾組，DOX組、聯(lián)合組Caspase-9活性高于干擾組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；聯(lián)合組Caspase-3、Caspase-9活性及細(xì)胞色素C水平高于DOX組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見(jiàn)表1)。

Table 1 Comparison of the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level among different groups

組別Caspase-3(μmolpNA/109cell)Caspase-9(μmolpNA/109cell)細(xì)胞色素C(μmol/mg)空白對(duì)照組4.14±2.973.12±1.270.13±0.06陰性對(duì)照組5.68±1.084.27±1.990.18±0.01干擾組9.25±1.54b8.25±1.25bc3.61±1.42bDOX組12.53±3.12bc10.97±2.02bcd5.33±2.00b聯(lián)合組21.45±4.22bcde15.65±2.24bcde10.13±2.54beF(u)值35.5648.1010.60aP值0.0430.0380.029

注：a為u值；與空白對(duì)照組比較，bP<0.05；與陰性對(duì)照組比較，cP<0.05；與干擾組比較，dP<0.05；與DOX組比較，eP<0.05；Caspase=半胱氨酸蛋白酶

3 討論

細(xì)胞凋亡是一種細(xì)胞自發(fā)的生理性死亡，與病理性細(xì)胞壞死不同，凋亡是由多基因精確調(diào)控的過(guò)程，對(duì)多細(xì)胞有機(jī)體的正常發(fā)育和自身穩(wěn)定具有極其重要的生物學(xué)作用，細(xì)胞凋亡失衡與許多疾病尤其是與腫瘤的發(fā)生相關(guān)聯(lián)[6]。研究表明，細(xì)胞凋亡在腫瘤發(fā)生發(fā)展中起負(fù)調(diào)控作用，凋亡受抑制，最終可能導(dǎo)致細(xì)胞癌變或腫瘤，而過(guò)度凋亡則與神經(jīng)退行性疾病等有關(guān)[3，7-8]。bcl-2基因家族是目前廣泛研究的一類細(xì)胞凋亡基因，其表達(dá)和調(diào)控是影響細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因素之一。根據(jù)其對(duì)細(xì)胞凋亡的作用特點(diǎn)，可將bcl-2家族分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，其中，促凋亡蛋白與抗凋亡蛋白之間的比例決定著細(xì)胞對(duì)各種凋亡因素(如化療藥物)的敏感性[9-10]。DNA損傷類化療藥物可通過(guò)上調(diào)凋亡相關(guān)基因(Bax)/bcl-2來(lái)改變線粒體外膜完整性，誘發(fā)線粒體膜通道開(kāi)放，導(dǎo)致細(xì)胞色素C等細(xì)胞凋亡執(zhí)行因子釋放入胞質(zhì)，從而啟動(dòng)腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程。雖然放療和化療均可通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡來(lái)發(fā)揮抗癌作用，但腫瘤組織中常會(huì)出現(xiàn)耐受細(xì)胞群，引起化療和放療的治療效率降低，并最終導(dǎo)致惡性腫瘤復(fù)發(fā)和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[11-12]。因此，開(kāi)發(fā)靶向抗凋亡蛋白bcl-2的化療藥物是當(dāng)前研究抗腫瘤藥物的熱點(diǎn)。本研究以人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞為研究對(duì)象，觀察靶向bcl-2 siRNA干擾序列聯(lián)合DOX處理對(duì)人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞增殖的抑制作用，驗(yàn)證通過(guò)醫(yī)療手段抑制bcl-2在子宮內(nèi)膜癌治療中的作用及可行性。

本研究結(jié)果顯示，siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為(94.6±12.5)%，提示轉(zhuǎn)染成功。干擾組、DOX組、聯(lián)合組細(xì)胞活力低于空白對(duì)照組；聯(lián)合組細(xì)胞活力低于DOX組。提示在本實(shí)驗(yàn)體系中，靶向bcl-2 siRNA干擾序列轉(zhuǎn)染和DOX處理兩者聯(lián)合作用在抑制人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞增殖上有明顯的協(xié)同效果。Caspase家族是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中程序性死亡(PCD)的主要介導(dǎo)者和執(zhí)行者，包括以Caspase-9為代表的凋亡啟動(dòng)因子和Caspase-3為代表的凋亡執(zhí)行因子，當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號(hào)后，Caspases家族成員可被級(jí)聯(lián)激活，其中Caspase-9位于級(jí)聯(lián)反應(yīng)最上游，可在其他協(xié)同因子參與下發(fā)生自我活化并激活下游凋亡執(zhí)行因子Caspase-3，后者則作用于特異性底物使細(xì)胞發(fā)生一系列生化及形態(tài)學(xué)改變，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13-16]。線粒體細(xì)胞色素C的釋放是線粒體依賴性細(xì)胞凋亡的標(biāo)志事件[17]。本研究結(jié)果顯示，bcl-2 siRNA干擾組bcl-2 表達(dá)水平低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組；干擾組、DOX組、聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率高于空白對(duì)照組；聯(lián)合組細(xì)胞凋亡率高于DOX組；干擾組、DOX組、聯(lián)合組Caspase-3、Caspase-9活性及細(xì)胞色素C水平高于空白對(duì)照組，DOX組、聯(lián)合組Caspase-3活性高于陰性對(duì)照組，干擾組、DOX組、聯(lián)合組Caspase-9活性高于陰性對(duì)照組，聯(lián)合組Caspase-3活性高于干擾組，DOX組、聯(lián)合組Caspase-9活性高于干擾組，聯(lián)合組Caspase-3、Caspase-9活性及細(xì)胞色素C水平高于DOX組。提示在本實(shí)驗(yàn)體系中，線粒體在bcl-2沉默對(duì)人子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用中發(fā)揮了關(guān)鍵作用。但由于癌細(xì)胞基因突變的多樣性，靶向bcl-2 siRNA干擾序列在其他癌細(xì)胞中的作用仍有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，靶向bcl-2 siRNA干擾序列可以有效增強(qiáng)子宮內(nèi)膜癌RL-952細(xì)胞對(duì)化療藥物DOX的敏感性。因此，bcl-2基因沉默結(jié)合傳統(tǒng)DOX化療可能在人子宮內(nèi)膜癌的治療中具有廣泛的應(yīng)用前景。隨著siRNA相關(guān)技術(shù)研究的深入，siRNA藥物在不久后將會(huì)進(jìn)行臨床試驗(yàn)，從而給腫瘤的臨床治療開(kāi)辟一條新的途徑。

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(本文編輯：崔麗紅)

Influence of bcl-2 Small Interference RNA on the Sensibility of Endometrial Carcinoma RL-952 Cells to Doxorubicin

ZHOUFu-qun,HUANGZhang-qian,HEYao.

DepartmentofGynaecologyandObstetrics,ShaoxingWomen&Children′sHospital,Shaoxing312000,China

Objective To research the influence of bcl-2 targeting siRNA on the sensibility of endometrial carcinoma RL-952 cells to doxorubicin (DOX).Methods From May to August in 2014,siRNA interference sequence were transfected into endometrial carcinoma RL-952 cells.The RL-952 cells were divided into three trial groups: blank control group,bcl-2 siRNA interference group (with transfected bcl-2 siRNA interference sequence) and negative control group (with transfected siRNA empty sequence).The transfection efficiency of bcl-2 siRNA interference group and the protein expression level of bcl-2 of the three groups were tested.The RL-952 cells were divided into five groups: control blank group,negative control group (with transfected siRNA empty sequence),interference group (with transfected bcl-2 siRNA interference sequence),DOC group (added with 5 μg/ml DOX),and combination group (with transfected siRNA interference sequence and 5 μg/ml DOX).Cell viability,cell apoptosis rate,the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level of the five groups were tested.Results The efficiency of transfection from siRNA interference sequence to endometrial carcinoma RL-952 cells was (94.6±12.5)%.The three trial groups were significantly different in the protein expression level of bcl-2 (F=8.75,P<0.05).The bcl-2 siRNA interference group was lower than blank control group and negative control group in the protein expression level (q=3.99,2.87;P<0.01).The five groups were significantly different in cell viability (F=42.52,P<0.05).Interference group,DOC group and combination group were lower than blank control group in cell viability (q=7.66,8.64,6.89;P<0.05);combination group was lower than DOX group in cell viability (q=6.76,P<0.01).The five groups were significantly different in cell apoptosis rate (F=112.34,P<0.05).Interference group,DOX group and combination group were higher than blank control group in cell apoptosis rate (q=5.78,4.99,6.21;P<0.05);combination group was higher than DOX group in cell apoptosis rate (q=4.89,P<0.01).The five groups were significantly different in the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level (P<0.05).Interference group,DOX group and combination group were higher than the blank control group in the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level (P<0.05);DOX group,and combination group were higher than negative control group in the activity of Caspase-3 (P<0.05),and interference group,DOX group and combination group were higher than negative control gorup in the activity of Caspase-9 (P<0.05);combination group was higher than interference group in the activity of Caspase-3 (P<0.05),and DOX group and combination group were higher than interference group in the activity of Caspase-9 (P<0.05);combination group was higher than DOX group in the activity of Caspase-3 and Caspase-9 and cytochrome C level (P<0.05).Conclusion bcl-2 targeting siRNA interference sequence can increase the sensitivity of endometrial carcinoma RL-952 cells to DOX.bcl-2 gene may be a potential target in the gene therapy of endometrial carcinoma.

Endometrial neoplasms;Genes,bcl-2;RNA,small interfering;Doxorubicin;Cysteine proteases

312000 浙江省紹興市婦幼保健院婦產(chǎn)科

周夫群，312000 浙江省紹興市婦幼保健院婦產(chǎn)科；E-mail：zfqyst@163.com

R 737.33

A

10.3969/j.issn.1007-9572.2015.24.010

2014-09-30；

2015-03-25)