基于SYBR GreenⅠ的莖-環(huán)Real-time PCR定量檢測miRNA-7方法的建立

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技術與方法

基于SYBR GreenⅠ的莖-環(huán)Real-time PCR定量檢測miRNA-7方法的建立

趙娟娟1,2，徐華林1,2，陶弋婧1,2，郭萌萌1,2，周涯3，陳超1,2，秦娜琳1,2，鄭靜1,2，田丹1,2，徐林1,2

(1. 遵義醫(yī)學院 免疫學教研室暨貴州省生物治療人才基地，貴州 遵義563099；2.貴州省普通高等學校特色藥物腫瘤防治特色重點實驗室，貴州 遵義563099；3. 遵義醫(yī)學院 醫(yī)學物理學教研室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 本研究旨在利用常規(guī)熒光燃料SYBR GreenⅠ，通過莖-環(huán)法設計原理，建立有效檢測微小RNA-7(miR-7)的Real-time PCR方法。方法 利用miRBase數(shù)據(jù)庫獲得miR-7的成熟體序列，分別設計1條miR-7特異性反轉錄引物，以及Real-time PCR上游和下游引物；觀察不同退火溫度和不同引物濃度對擴增miR-7的Ct值影響，選擇最優(yōu)的退火溫度和引物濃度；測定不同稀釋度RNA下Real-time PCR擴增 miR-7的效果；并利用該方法檢測小鼠4個器官中miR-7的靈敏性和特異性。結果 在基于SYBR GreenⅠ的莖-環(huán)Real-time PCR檢測法中，miR-7擴增的最優(yōu)退火溫度為60 ℃，最優(yōu)引物濃度為10 μmol/L；在不同稀釋度RNA下miR-7的Ct值線性關系較好，且在模板RNA低于100 pg的條件下，該方法仍可有效檢測miR-7分子；最后有效檢測出小鼠4個不同器官中miR-7的差異性表達。結論 成功建立基于SYBR GreenⅠ的莖-環(huán)Real-time PCR定量檢測miRNA-7的方法，可為后續(xù)研究miR-7的生物學功能提供了重要工作基礎。

[關鍵詞]莖-環(huán)Real-time PCR法；SYBR GreenⅠ；微小RNA-7；表達

微小RNAs(miRNA)是一類內源性長18~25個核苷酸的單鏈非編碼RNA分子，主要通過結合靶基因的3’非翻譯區(qū)抑制靶基因的翻譯或誘導靶基因降解，從而調控真核基因的表達。大量研究顯示特定miRNAs分子參與多種臨床疾病的發(fā)生過程，特定miRNAs表達水平的變化與包括腫瘤、自身免疫性疾病等臨床疾病的預后密切相關，因此，其表達水平的檢測也逐漸發(fā)展為相關臨床疾病診斷的重要輔助手段。

微小RNA-7(miR-7)作為miRNA家族成員之一，已有研究顯示其不僅在多個機體組織、器官及細胞中存在表達[1-2]，且在組織器官的發(fā)育、分化及病理損傷過程中發(fā)揮重要作用[3-5]。我們課題組新近研究結果也顯示miR-7不僅在肺臟、脾臟等器官中高表達，且該基因敲減后小鼠的心、肝及肺等多個重要器官發(fā)生明顯的病理學損傷[6-7]。此外，miR-7在包括肺癌、乳腺癌等多種腫瘤中存在較低表達，并可通過對包括PIK3R3、CGGBP1和EGFR等靶基因的調控來調節(jié)腫瘤細胞的生長和侵襲轉移[8-11]，提示其是重要的腫瘤潛在生物治療靶標。因此，對特定組織或細胞中miR-7表達水平的檢查不僅對于闡明其生物學功能，且對于相關臨床疾病發(fā)生機制的認識，以及臨床診治均具有積極意義。因此，本研究中，我們擬在前期工作基礎上，利用莖-環(huán)法引物設計的原理，建立基于熒光染料SYBR GreenⅠ的Real-time PCR檢測miR-7方法，并初步觀察其檢測不同器官中miR-7表達的靈敏性和特異性，以期為后續(xù)相關工作提供重要的實驗技術平臺。

1材料與方法

1.1材料FVB背景的雌性小鼠(南京大學模式動物研究所)，總RNA抽提試劑Trizol、PrimeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)(RR037A)和SYBR Premix Ex Taq II (2×)(RR820A)均為TAKARA公司產(chǎn)品，miR-7和U6均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，其中U6為商品化引物(擴增長度為106 bp)，作為檢測miR-7表達的內參，miR-7探針(000386)和U6探針(001973)引物購買于Life Technologies公司。

1.2方法

1.2.1MiR-7成熟序列的獲得在miRBase數(shù)據(jù)庫(http://www.mirbase.org/)中獲得miR-7成熟序列(MI0000728)：5' -UGGAAGACUAGUGA UUUUGUUGU-3'。

1.2.2莖-環(huán)法miR-7引物序列的設計對于miR-7，我們設計了1對半引物：1條特異性反向引物用于反轉錄，另外1對用于miR-7的實時定量PCR擴增的正向引物和反向引物。特異性反轉錄引物帶有1段固定的序列，可以形成1個莖環(huán)，其5' 端的44個核苷酸序列是固定的，固定的序列為：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC-3'(劃線部分為互補的核苷酸環(huán))，其形成一個14核苷酸環(huán)和16核苷酸莖的結構，其3' 端的6個核苷酸與miR-7反向互補(見表1)。

表1反轉錄引物及實時熒光定量PCR 的引物

基因目錄堿基序列擴增長度(bp)MiR-7miRNA的成熟體序列UGGAAGACUAGUGAUUUUGUUGU反轉錄引物GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT-TCGCACTGGATACGACAACAReal-timePCR上游CGGCGGTGGAAGACTAGTGATTReal-timePCR下游ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG63

正向引物長25~32個核苷酸，除了miR-7成熟序列3' 端6個堿基的剩余部分作為上游引物5'-TGGAAGACTAGTGATT-3'(見表1)，為了保證Tm接近65 ℃，在5' 端添加了懸垂堿基CGGCGG；通用的反向引物中15個左右核苷酸對應特異反轉錄引物的莖環(huán)結構部分，為了與正向引物的Tm趨于一致，可以根據(jù)反轉錄引物序列調整，或者在5'端加上懸垂堿基。MiR-7的整個莖-環(huán)設計原理流程見圖1。

圖中紅色區(qū)域為引入44個核苷酸固定序列，橫線標注位置為Real time PCR上下游結合區(qū)域，小圓點為SYBR GreenⅠ染料與DNA結合區(qū)域。圖1　基于SYBR GreenⅠ的莖-環(huán)Real-time PCR 檢測法示意圖

1.2.3總RNA提取及質量檢測取小鼠的心、肝、腦、肺4個器官，根據(jù)TAKARA公司的使用說明，采用Trizol法提取細胞總RNA，所得RNA溶于0.1%DEPC水中?？俁NA樣品經(jīng)過1%瓊脂糖電泳檢測RNA完整性，再用分光光度計測定RNA的濃度，讀取在260 nm和280 nm波長處光吸收值的比值。

1.2.4RNA特異性反轉錄在進行反轉錄時用的引物不再是Oligo dT和Random primer，而是改用miRNA對應的特異性莖-環(huán)反向引物。取小鼠心、肝、腦、肺4個組織器官RNA，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑說明操作合成cDNA。miR-7特異性反轉錄體系為(總體系10 μL)：5×PrimerScript Buffer 2 μL，Primer Script Enzyme Mix 0.5 μL，miR-7特異性反轉錄引物(10 μmol/L)1 μL或U6特異性反轉錄引物(10 μmol/L)1 μL，RNA 1 μg，加水(無RNA酶)補至10 μL體系；同時用RNase-free水10倍梯度稀釋RNA，使10 μL反轉錄體系分別含有RNA 1 000 ng、100 ng、10 ng、1 ng、100 pg(RNase-free水溶解)，即以miR-7為引物特異性反轉錄5個體系，使其各體系中分別反轉錄RNA 1 000 ng、100 ng、10 ng、1 ng、100 pg。U6同上進行反轉錄。反應條件均為：42 ℃溫育15 min，85 ℃ 5 s滅活逆轉錄酶，4 ℃保存。

1.2.5退火溫度及莖-環(huán)引物濃度對莖-環(huán)Real-time PCR法檢測表達水平的影響以U6為內參，miR-7及U6的Real-time PCR反應體系均為25 μL：SYBR Premix Ex Taq II (2×) 12.5 μL，模板cDNA 1 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，補充雙蒸水至25 μL。Real-time PCR檢測時，上游引物為特異性引物序列，下游為通用引物(各有5個溫度梯度)。反應條件為：95 ℃變性30 s，95 ℃ 5 s，6 ℃ 30 s，45個循環(huán)，循環(huán)結束后從65 ℃開始每10 s上升0.5 ℃，取熒光值繪制溶解曲線，并在2.5%的瓊脂糖凝膠下觀察，確定擴增產(chǎn)物的特異性。

1.2.6RNA濃度對莖-環(huán)引物的影響將1.2.4中獲得的不同濃度的RNA反轉錄產(chǎn)物cDNA，在最優(yōu)反應條件下進行Real-time PCR，擴增產(chǎn)物在2.5%的瓊脂糖凝膠下觀察，并取Ct值繪制標準曲線，確定擴增產(chǎn)物的特異性及線性關系。

1.2.7莖-環(huán)法Real-time PCR檢測小鼠4個組織器官miR-7的表達水平采用Trizol法提取小鼠心、肝、腦、肺4個組織器官RNA。反轉錄方法同上，并采用上述最優(yōu)條件，進行Real-time PCR檢測小鼠4個組織中miR-7的表達水平，用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)結果。

1.2.8對比TaqMan探針法，觀察莖-環(huán)Real-time PCR法檢測miR-7的特異性和靈敏性采用Trizol法提取小鼠心、肝、腦、肺4個組織器官RNA。按照Life Technologies公司標準操作說明書，進行反轉錄及Real-time PCR檢測小鼠4個組織中miR-7的表達水平，用2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)結果。

2結果

2.1RNA質量的檢測提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測和紫外分光光度計測定OD260/OD280的比值，將沒有降解、OD260/OD280的比值為1.8~2.1之間的RNA樣品進行反轉錄。反轉錄條件為： 42 ℃溫育15 min，85 ℃ 5 s滅活逆轉錄酶。逆轉錄產(chǎn)物置于4 ℃保存。

2.2退火溫度及莖-環(huán)引物濃度對miR-7擴增的影響我們首先在不同濃度的莖-環(huán)引物(5 μmol/L和10 μmol/L)在不同的退火溫度(57.3、60.0、62.2 ℃)下分別進行miR-7的擴增。如圖2所示，目的基因miR-7得到了有效的特異性擴增，條帶為63 bp。此外，退火溫度為60.0 ℃，且引物濃度為10 μmol/L時，特異性及產(chǎn)物豐度是最佳的(見圖2B，P<0.05)。

A：不同退火溫度和不同引物濃度下miR-7的擴增曲線；B：溶解曲線；C：瓊脂糖凝膠電泳圖。1~6分別為不同的退火溫度和不同引物濃度，其中1為10 μmol/L，60.0 ℃；2為5 μmol/L，60.0 ℃；3為5 μmol/L，57.2 ℃；4為5 μmol/L，60.0 ℃；5為5 μmol/L，57.2 ℃；6為5 μmol/L，62.2 ℃；M為Maker。圖2　退火溫度及莖-環(huán)引物濃度對miR-7 Ct值的影響

2.3RNA濃度對miR-7擴增的影響本研究進一步利用上述最優(yōu)擴增條件(擴增引物10 μmol/L、退火溫度60 ℃)，觀察不同的RNA濃度條件下，逆轉錄后對miR-7擴增的可能影響。結果顯示，隨著RNA濃度的降低，miR-7的Ct值也逐漸增大(見圖3A)，瓊脂糖凝膠電泳圖呈現(xiàn)清晰目的條帶(見圖3B)，且其線性相關系數(shù)達到0.993 3(見圖3C，P<0.05)。

A：不同稀釋度的RNA下miR-7的擴增曲線；B：瓊脂糖凝膠電泳圖； C：RNA濃度與熒光信號閾值的線性關系圖。1~5分別代表了1000 ng、100 ng、10 ng、1 ng和100 pg等5個稀釋度RNA下的瓊脂糖凝膠電泳圖；M為Maker。圖3　RNA濃度對miR-7產(chǎn)物的影響

2.4莖-環(huán)法檢測小鼠4個組織器官中miR-7的表達水平如圖3A顯示miR-7和內參基因U6的擴增曲線平滑且Ct值均處于15~30之間，說明對于檢測組織中miR-7的水平有較高靈敏性；圖3B顯示溶解曲線平滑且為獨立單峰，且圖3C、D顯示的目的條帶結果均提示莖-環(huán)法擴增miR-7的特異性好。

A：莖-環(huán)法檢測小鼠4個組織器官中miR-7表達的擴增曲線；B：4個組織器官中miR-7表達溶解曲線；C：進行Real time PCR擴增后的miR-7產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；D：進行Real time PCR擴增后的U6產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖。1~4分別為肺、腦、心、肝4個組織器官；M為Maker。圖4　莖-環(huán)法檢測小鼠4個組織器官中miR-7的表達水平

2.5參照TaqMan探針法，鑒定莖-環(huán)法的準確性為了進一步觀察莖-環(huán)法檢測不同組織中miR-7表達水平的準確性，本實驗對小鼠4個不同組織器官心、腦、肝、肺等分別利用TaqMan探針法和莖-環(huán)法進行擴增。如圖5A所示：TaqMan探針法可有效擴增不同組織器官中miR-7，且在腦組織中miR-7表達水平相對最高(相對水平為5.07±1.1)，而心臟組織中miR-7表達水平相對最低(檢測的小鼠4個器官中其相對表達水平最低，因此將其作為參照，相對水平為0.99±0.15)，這與我們前期結果一致[1]，另外在本次實驗中也測定的肺臟和肝臟中miR-7的相對表達水平分別為1.67±0.61、1.38±0.45。莖-環(huán)法檢測結果顯示在腦組織中miR-7表達水平也最高(見圖5B，相對水平為58.52±5.1)，而心臟組織中miR-7表達水平最低(見圖5B，分析方法同上，作為4個器官相對表達水平的參照，相對水平為0.97±0.35)，同時肺臟與肝臟中miR-7的相對表達水平分別為3.01±0.78、1.65±0.56，與TaqMan探針法的檢測結果高度一致。

A：通過TaqMan探針法檢測肺、腦、心、肝4個器官中miR-7相對水平的結果；B：通過莖-環(huán)法檢測肺、腦、心、肝4個器官中miR-7相對水平的結果?！　D5　莖-環(huán)法與探針法檢測器官中miR-7的表達水平的比較

3討論

目前，定量檢測miRNAs常規(guī)使用的技術有：Northern blotting雜交法、微陣列法、克隆和測序法、Real-time PCR法等。其中Real-time PCR法是較為方便快捷、靈敏，應用十分廣泛，如商品化的miRNA專用定量試劑盒(TaqMan探針法)是研究者大多采用的miRNA 定量方法。由于miRNA的成熟體序列較短，與常規(guī)PCR反應中的引物長度相近，沒有poly(A)，家族成員序列差異小，在物種或組織之間的表達水平普遍較低等，因此常規(guī)利用Oligo dT的mRNA逆轉錄過程難以有效將miRNAs的成熟體逆轉錄，并進行后續(xù)Real-time PCR擴增過程。近年來發(fā)展起來的莖-環(huán)引物反轉錄檢測法則有效解決了該問題，其基本原理是通過人為延長逆轉錄后的miRNA成熟體長度以利于后續(xù)的Real-time PCR擴增，該方法突出優(yōu)點是特異性強、靈敏度高、樣品消耗量少，還能區(qū)分同一miRNA家族的不同變體。在此原理的基礎上還形成了商品化的miRNAs定量探針試劑盒(Taqman探針)等用于特定miRNAs分子表達水平的檢測[12]。然而，由于Taqman探針等序列的設計與合成通常需借助商業(yè)公司，價格比較昂貴，特別在長期進行相關miRNAs表達水平檢測中購買等十分不便。因此，利用莖-環(huán)引物法的基本原理，建立其他相關檢測方法對于長期研究特定miRNA表達及功能來說仍具有積極意義。

SYBR GreenⅠ是常規(guī)Real-time PCR染料，其相關實驗操作流程簡單、設備和試劑要求相對較低、經(jīng)濟實惠，便于一般實驗室開展。本研究中，我們嘗試利用莖-環(huán)引物法的基本原理，結合基于熒光染料SYBR GreenⅠ的Real-time PCR法實驗過程，探討建立利用熒光染料SYBR GreenⅠ的Real-time PCR檢測miR-7表達水平的方法。研究結果顯示，不同的擴增引物濃度(5 μmol/L和10 μmol/L)對miR-7成熟體的擴增影響顯著；然而，擴增條件中，60 ℃條件下，miR-7的擴增產(chǎn)物量最大，提示該擴增溫度對miR-7成熟體的擴增具有重要影響。此外，本實驗還發(fā)現(xiàn)，在低于100 pg 濃度的模板RNA情況下，基于SYBR GreenⅠ的Real-time PCR法仍可以有效擴增miR-7片段，顯示出該方法具有較好的靈敏度。類似地，Wu等[13]研究顯示，濃度為20 pg RNA進行反轉錄時也可檢測到目的miRNA的存在。為了進一步觀察該方法的靈敏度，我們利用該方法檢測了包括心、肝等4個小鼠組織器官中的miR-7表達水平。結果顯示，本方法可以有效檢測出這4個不同組織器官中的miR-7表達水平。更為重要的是，本方法的檢測結果與當前標準商品化的miR-7的Real-time PCR探針試劑盒檢測結果保持高度一致，小鼠4個組織器官miR-7的Ct值，均處于20~30之間，提示本方法具有高度特異性。類似地，趙麗等[14]也利用莖-環(huán)引物反轉錄檢測法建立了檢測miR-421的技術方法，體現(xiàn)了基于莖-環(huán)引物反轉錄原理的特定miRNA分子檢測方法的潛在推廣應用價值。此外，本方法設計的Real-time PCR擴增引物能用SYBR GreenⅠ預混液所推薦的反應條件：即95 ℃變性30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃30 s來對miR-7成熟體進行擴增，提示其可與其他基因同時進行Real-time PCR擴增，因此，簡單方便易于開展。綜上實驗結果表明，莖-環(huán)法和常用染料結合可較好地檢測miR-7的相對表達水平，為今后miR-7的定量檢測奠定了基礎，也可為其它miRNA此類方法的檢測提供基礎數(shù)據(jù)。

總之，本研究中我們成功建立了基于SYBR Green Ⅰ 的Real-time PCR定量檢測miR-7方法，可為后續(xù)進一步開展miR-7在特定組織和細胞中表達水平檢測和功能研究提供了重要的工作基礎。

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[收稿2015-10-06;修回2015-11-06]

(編輯：王福軍)

Stem-loop real-time PCR assay for quantitative detection of miRNA-7 by specific primers using SYBR Green I

ZhaoJuanjuan1,2,XuHualin1,2,TaoYijing1,2,GuoMengmeng1,2,ZhouYa3,ChenChao1,2,QinNalin1,2,ZhengJing1,2,TianDan1,2,XuLin1,2

(1.Department of Immunology, Zunyi Medical University, Talent Base of Biological Therapy of Guizhou Province, Zunyi Guizhou 563099, China; 2.Guizhou Provincial College-based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China; 3. Department of Medical Physics, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To establish an effective method of Real-time PCR quantitative detection of microRNA-7 (miR-7), based on the principles of stem-loop theory using conventional fluorochrome SYBR GreenⅠ.Methods Mature sequences of miR-7 were obtained from miRBase database, and then 3 primers were designed, including a specific reverse transcription primer, as well as one forward and one reverse primer for Real-time PCR. Next, different annealing temperatures and distinct concentrations of primer were performed for the analysis of optimal Ct values of miR-7 in Real-time PCR assay. Furthermore, different concentrations of RNA were used for the detection of miR-7 expression level in the condition of optimal annealing temperature and primer concentration. Finally, the distinct expression level of miR-7 in murine four different organs was analyzed.Results In stem-loop Real-time PCR assay, the optimal annealing temperature and primer concentration for the amplification of miR-7 were 60 ℃ and 10 μmol/l, respectively. Moreover, Ct values of miR-7 showed good linear relationship detection, and the level of miR-7 could be also detected in samples with 100 pg RNAs. Finally, the distinct level of miR-7 expression in murine four different organs could be determined by stem-loop Real-time PCR assay.Conclusion The stem-loop Real-time PCR using SYBR GreenⅠcould be well used for the quantitative analysis of miR-7, which provided the bases for the successive research work on the biological function of miR-7.

[Key words]Stem-Loop Real-Time PCR; SYBR GreenⅠ; microRNA-7; expression

[中圖法分類號]R392-33

[文獻標志碼]A

[文章編號]1000-2715(2015)06-0636-06

[通信作者]徐林，男，博士，教授，博士生導師，研究方向：腫瘤免疫學和分子免疫學，E-mail:xulinzhouya@163.com。

[基金項目]國家自然科學基金資助項目(NO：31370918)；教育部“新世紀優(yōu)秀人才計劃”資助項目(NO：NCET-12-0661)；貴州省教育廳特色重點實驗室建設項目(NO：黔教合KY字[2014]212)。