羧甲基殼聚糖對鈦顆粒致心臟毒性的保護(hù)作用

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

羧甲基殼聚糖對鈦顆粒致心臟毒性的保護(hù)作用

顏姝1,張重威1,龍文昕1,張楠1,羅艷桃1,董俊2

(1.長沙醫(yī)學(xué)院 臨床學(xué)院2012級臨床醫(yī)學(xué)專業(yè),湖南 長沙410219；2.長沙醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室, 湖南 長沙410219)

[摘要]目的 探討羧甲基殼聚糖對鈦顆粒致心臟毒性的保護(hù)作用。方法 將30只家兔隨機(jī)分為3組，分別開胸后心肌內(nèi)注射等量的生理鹽水、鈦顆粒和生理鹽水、鈦顆粒和羧甲基殼聚糖，術(shù)后1周，利用分光光度計(jì)和紫外分光光度計(jì)分別檢測血清中乳酸脫氫酶(LDH)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)活性來觀察心功能的變化、取心肌組織行HE染色觀察心臟組織病理改變。結(jié)果 鈦顆粒使血清中LDH及CK-MB活性明顯升高(P<0.01)，而羧甲基殼聚糖能夠明顯降低LDH、CK-MB的活性。心肌HE染色結(jié)果顯示，鈦顆粒會使心肌細(xì)胞水樣變性，胞質(zhì)淡染，細(xì)胞核染色不均、細(xì)胞空泡、心肌細(xì)胞排列紊亂，而羧甲基殼聚糖能夠明顯減輕鈦顆粒導(dǎo)致的心肌毒性反應(yīng)。結(jié)論 羧甲基殼聚糖對鈦顆粒致心臟的毒性作用起到一定的保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞]羧甲基殼聚糖；鈦顆粒；心臟毒性

現(xiàn)已發(fā)展成熟的心血管支架用材主要有不銹鋼、鈷鉻合金及鎳鈦合金,但各有不足，而不含毒性元素、具有良好生物相容性及高強(qiáng)度低彈性模量的鈦合金已成為生物醫(yī)用材料領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)?；趦?yōu)異的塑性成形性能和生物力學(xué)相容性，鈦合金有望成為一種新的心血管支架材料。 目前鈦廣泛用于骨科、牙科，并表明鈦比其他金屬更具優(yōu)勢[1-2]。在鈦廣泛應(yīng)用的同時(shí)，其毒理學(xué)作用也越來越受到人們的關(guān)注。早在1992年，潘姜萍等[3]發(fā)現(xiàn)高稀釋度的鈦對肝腎培養(yǎng)細(xì)胞均有毒性作用。中毒后的細(xì)胞出現(xiàn)水腫、邊界模糊和消失;細(xì)胞核水腫、不規(guī)則,胞漿顆粒增多呈衰老現(xiàn)象,提示鈦進(jìn)入人體引起的肝腎慢性蓄積毒作用不容忽視。 但是其機(jī)制并未完全研究清楚。羧甲基殼聚糖是一種具有良好生物相容性，無毒副作用的天然物質(zhì)，有抗凝血、抗炎、協(xié)同抗腫瘤[4]，螯合重金屬離子等功能[5]。其表面結(jié)構(gòu)類似于球狀海綿，有大量的孔隙，可以承載并達(dá)到緩釋藥物的作用，延長藥物治療的時(shí)間[6]，因而作為一種載體被廣泛應(yīng)用。本研究將觀察羧甲基殼聚糖是否能對鈦顆粒導(dǎo)致的心肌毒性作用起到保護(hù)作用，從而為鈦毒性的預(yù)防措施提供一定的理論依據(jù)。

1材料

鈦粉(清河縣佳潤金屬材料有限公司)；羧甲基殼聚糖(德州海利安生物科技股份有限公司)；BD胰島素注射器(Becton dickinson and Company)；乳酸脫氫酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)；肌酸激酶同工酶試劑盒(南京建成生物工程研究所)；紫外分光光度計(jì)(UV757CRT)；可見分光光度計(jì)(722)；恒溫水浴鍋(DU-20G)；顯微鏡(CX21-BIM)；高速離心機(jī)(TGL-10B)。

2方法

2.1鈦懸液的制備將15 mg的鈦粉用95%的醫(yī)用酒精于1.5 mL EP管浸泡消毒，去其表面內(nèi)毒素，離心4 min(10 000轉(zhuǎn)/min)，抽去上層酒精，用無菌PBS緩沖液反復(fù)清洗殘留酒精后抽取1 mL無菌PBS緩沖液于EP管中，制成約為15 mg/mL的鈦懸液。

2.22%羧甲基殼聚糖凝膠的制備稱取羧甲基殼聚糖粉末0.2 g溶于10 g三級超純水中于恒溫水浴鍋中加熱充分混勻，制成濃度為2%的羧甲基殼聚糖凝膠，高溫高壓滅菌備用。

2.3實(shí)驗(yàn)分組取健康家兔30只，隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為空白對照組、鈦中毒組、羧甲基殼聚糖組。25%烏拉坦(4 mL/kg)經(jīng)耳緣靜脈將兔子麻醉后，仰臥固定于手術(shù)臺，備皮，鋪無菌孔巾，沿胸骨體左緣切開皮膚，鈍性分離第3、4肋肋間肌，暴露縱隔及心臟，剪開心包，于左室前壁心肌選取8點(diǎn)，空白對照組用胰島素注射器緩慢注射生理鹽水，每點(diǎn)注射0.1 mL。鈦中毒組注射鈦懸液和生理鹽水，每點(diǎn)注射0.1 mL。羧甲基殼聚糖組注射鈦懸液及2%羧甲基殼聚糖，每點(diǎn)注射0.1 mL。消毒縫合關(guān)閉胸腔。術(shù)后肌肉注射80萬個(gè)單位的青霉素防感染。

2.4LDH、CK-MB檢測家兔心功能術(shù)后1周心臟取血分離血清，嚴(yán)格按照測試盒說明書，用分光光度計(jì)在波長為460 nm處檢測乳酸脫氫酶(LDH)活力，紫外分光光度計(jì)在波長為340 nm處檢測肌酸激酶同工酶(CK-MB)活力。

2.5HE染色觀察家兔的心肌結(jié)構(gòu)變化取血完畢后，剖開胸腔，取心臟用生理鹽水沖洗，10%甲醛溶液固定、修樣、脫水，石蠟包理切成5 μm厚的心臟組織切片，HE染色后光鏡下觀察。

3結(jié)果

3.1血清心肌LDH、CK-MB活力的檢測結(jié)果給藥1周后結(jié)果表示，鈦中毒組與空白對照組相比較，心肌酶LDH、CK-MB均明顯上升(P<0.01)。羧甲基殼聚糖組LDH、CK-MB較鈦中毒組均明顯下降(P<0.01，見表1)。

組別LDH(U/L)CK-MB(U/L)A2275.36±131.701265.88±234.03B5075.10±288.88*2304.96±165.60*C3763.20±249.58*#1621.85±95.63*#

A：空白對照組；B：鈦中毒組；C：羧甲基殼聚糖組。*：P<0.01, B組與A組比較；#：P<0.01, C組與B組比較。

3.2心肌HE染色結(jié)果術(shù)后1周取家兔心臟行HE染色，均在400倍下觀察，空白對照組心肌組織基本正常(見圖1A)，鈦中毒組的心肌細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞水腫，胞質(zhì)淡染，細(xì)胞核染色不均、細(xì)胞空泡、心肌細(xì)胞排列紊亂(見圖1B)，羧甲基殼聚糖組心肌細(xì)胞水腫明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)、心肌排列基本正常(見圖1C)。

A：空白對照組；B：鈦中毒組； C：羧甲基殼聚糖組。圖1　各組心肌HE染色結(jié)果的比較(HE×400)

4討論

對于各種原因造成血管重度狹窄的患者，植入血管支架是目前主要治療手段。鈦雖然被認(rèn)可為最安全的材料之一，其抗腐蝕性能在逐步提高，但在機(jī)體復(fù)雜的內(nèi)環(huán)境下，其表面仍會被腐蝕，不斷釋放出鈦顆粒，導(dǎo)致組織細(xì)胞的變性、壞死、非特異性炎癥、過敏反應(yīng)，甚至腫瘤的形成。國內(nèi)外均有案例報(bào)告在基本無磨損交互運(yùn)動的耳部和腹部，鈦周圍散布著鈦顆粒，并出現(xiàn)了周圍組織的炎癥和異物肉芽腫[7-8]，提示我們血管支架植入后所致的再狹窄、心室顫動等并發(fā)癥可能也與鈦顆粒損傷有關(guān)。

殼聚糖具有抗炎、抑菌、抗胃潰瘍、抗心律失常等作用，目前在臨床上廣泛用作止血敷料、抗菌敷料，藥物基因載體等。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)羧甲基殼聚糖可以明顯減輕心肌組織受損程度，表明其對心臟具有一定的保護(hù)作用，并且能顯著降低血清中心肌酶 LDH、CK-MB的水平，表明其能有效防止鈦顆粒對家兔心肌細(xì)胞的損傷和破壞。研究表明殼聚糖對氧自由基具有一定清除效果，隨著濃度遞增抗氧化損傷越顯著[9]，一定程度上能夠減輕鈦顆粒誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放H202導(dǎo)致的氧化損傷。在骨組織的研究中，鈦顆粒能夠通過激活NF-κB信號通路，上調(diào)MIF、TNFα、COX-2等炎癥因子的表達(dá)，促進(jìn)植入體周圍炎癥反應(yīng)[10]，還可以通過p38絲裂原活化蛋白激酶(p38MAPK)信號傳導(dǎo)通路引發(fā)炎癥反應(yīng)[11]。而羧甲基殼聚糖具有抑制p38MAPK和NF-κB信號傳導(dǎo)通路[12-14]的雙重效應(yīng)，通過抑制一氧化氮的產(chǎn)生減輕炎癥反應(yīng)。也有研究表明殼聚糖可以抑制TNFα、cox-2等炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，但是羧甲基殼聚糖是否具有共性并不清楚。Shu等[15]的研究表明殼聚糖能夠激活A(yù)kt和與細(xì)胞存活/增殖相關(guān)的ERK1/2信號通路，提高缺氧條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞生存率，可能也與此有關(guān)。魏雅楠[16]在鈷鉻合金上做了羥丁基殼聚糖的涂層，其在體液模擬的條件下表現(xiàn)出良好的血液相容性和細(xì)胞相容性，有望作為新型的涂層支架。

雖然本實(shí)驗(yàn)觀察到心肌酶結(jié)果顯示出羧甲基殼聚糖干預(yù)后較鈦染毒后LDH,CK-MB活性明顯降低但仍然比對照組高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能原因有以下幾點(diǎn)：①血清中的藥物的效果往往與劑量成正比，可能是羧甲基殼聚糖濃度太低的原因；②實(shí)驗(yàn)時(shí)間太短，而羧甲基殼聚糖作用效果緩慢，時(shí)程長，在未達(dá)到預(yù)期效果時(shí)便終止實(shí)驗(yàn)而導(dǎo)致結(jié)果不明顯；③本實(shí)驗(yàn)因?yàn)橛^測指標(biāo)較少，具有一定的局限性；④實(shí)驗(yàn)動物數(shù)量可能不夠，個(gè)體差異性導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不理想；⑤因?yàn)閷?shí)驗(yàn)操作要求高，手術(shù)過程中的誤差不可避免。接下來我們將會通過增加心電圖、檢測其他心肌特異性標(biāo)志物等方法來觀察羧甲基殼聚糖的保護(hù)作用能否隨濃度遞增而增強(qiáng)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 張玉東. 微型鈦板治療口腔頜面骨折的臨床效果[J]. 中國醫(yī)藥科學(xué),2014,4(16):23-25.

[2] 張媛媛. pH值與Cl-濃度對純鈦及鈷鉻合金耐腐蝕性能的影響[D].長沙：中南大學(xué),2012.

[3] 潘姜萍,董勝璋,陳成章. 鈦對體外培養(yǎng)的大鼠及人肝、腎細(xì)胞的毒性初探[J]. 環(huán)境與健康雜志,1992,9(2):78-79.

[4] Jain A,Jain S,Jain R, et al.Coated chitosan nanoparticles encapsulating caspase 3 activator for effective treatment of colorectral cancer[J].Drug Deliv Transl Res，2015，5(6):596-610.

[5] 王林.EDTA-殼聚糖的制備及對Cd2+、Pb2+的吸附研究[D]. 湛江：廣東海洋大學(xué),2013.

[6] Kim J,Lin B,Kim S,et al.TGF-β1 conjugated chitosan collagen hydrogels induce chondrogenic differentiation of human synovium-derived stem cells[J].J Biol Eng， 2015，doi: 10.1186/1754-1611-9-1.

[7] 張華.英研究稱體內(nèi)植入鈦合金仍存被腐蝕風(fēng)險(xiǎn)[J]. 中國鈦業(yè),2012,8(3):52.

[8] 孫萬林.腹腔鏡膽囊切除術(shù)后鈦夾遺留腹壁切口內(nèi)形成異物肉芽腫1例報(bào)告[J].腹腔鏡外科雜志,2006,11(1):64.

[9] 吉晉芳.低分子量殼聚糖對鎘引起的氧化損傷的保護(hù)作用[D]. 太原：山西大學(xué),2008.

[10] 潘孝云,張先龍,毛昕，等.鈦顆粒通過NF-κB信號通路上調(diào)炎癥因子表達(dá)[J].浙江臨床醫(yī)學(xué),2013,15(1):1-3.

[11] Wang W,Wu C,Tian B,et al.The inhibition of RANKL-induced osteoclastogenesis through the suppression of p38 signaling pathway by naringenin and attenuation of titanium-particle-induced osteolysis[J].Int J Mol Sci，2014，15(12):21913-21934.

[12] 賀斌,陶海鷹,衛(wèi)愛林，等.p38絲裂原活化蛋白激酶信號通路在羧甲基殼聚糖保護(hù)一氧化氮誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡中的作用及機(jī)制研究[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2013,17(8):552-556.

[13] Muanprasat C,Wongkrasant P,Satitsri S, et al.Activation of AMPK by chitosan oligosaccharide in intestinal epithelial cells: Mechanism of action and potential applications in intestinal disorders[J].Biochem Pharmacol，2015，96(3):225-236.

[14] 丁萬軍,劉世清,彭昊,等.羧甲基殼聚糖抑制白細(xì)胞介素-1β誘導(dǎo)的大鼠軟骨細(xì)胞核因子-κB活化[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2010,14(9):602-605.

[15] Shu Y,Hao T,Yao F,et al.RoY Peptide-Modified Chitosan-Based Hydrogel to Improve Angiogenesis and Cardiac Repair under Hypoxia[J].ACS Appl Mater Interfaces,2015,7(12):6505-6517.

[16] 魏雅楠. 羥丁基殼聚糖用于心血管支架涂層的研究[D]. 青島：中國海洋大學(xué),2013.

[收稿2015-09-25;修回2015-11-05]

(編輯：王靜)

The protective effect of carboxymethyl chitosan for titanium particle-induced cardiotoxicity

YanZhu1,ZhangChongwei1,LongWenxin1,ZhangNan1,LuoYantao1,DongJun2

(1.Clinical Medical College of Changsha Medical University，Clinical Medicine Major of 2012 Grade Students,Changsha Hunan 410219,China；2. Department of Physiology，Basic Medical College of Changsha Medical University，Changsha Hunan 410219,China)

[Abstract]Objective To discuss the protective effect of carboxymethyl chitosan for titanium particle-induced cardiotoxicity.Methods thirty rabbits were divided into three groups randomly, treated with intramyocardial injection of normal saline, titanium particles and normal saline, titanium particles and carboxymethyl chitosan respectively. Lactate dehydrogenase (LDH) and creatine kinase isoenzyme (CK-MB) activity were detected by spectrophotometer and ultraviolet spectrophotometer to observe changes in cardiac function, HE staining was used to observe pathological changes of heart tissues.Results Titanium particle significantly enhanced activity of LDH and CK-MB in serum(P<0.01) while carboxymethyl chitosan greatly decreased activity of LDH and CK-MB in serum (P<0.01).HE staining of cardiac muscle shows that titanium particles cause hydropic degeneration, lightly stained cytoplasm, unevenly stained nucleus, cell vacuoles and derangement of myocardial cells. Carboxymethyl chitosan greatly decreased titanium particles-induced cardiotoxicity.Conclusion Carboxymethyl chitosan did take effect in alleviating titanium particle-induced cardiotoxity to a certain extent.

[Key words]carboxymethyl chitosan；titanium particle；cardiotoxicity

[中圖法分類號]R965

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1000-2715(2015)06-0607-03

[通信作者]董俊，女，講師，研究方向：藥物對白血病增殖和分化的調(diào)控，E-mail:561463066@qq.com。

[基金項(xiàng)目]湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目(NO：湘教通[2014]98-539)。