蛇床子素通過下調(diào)TGF-β1/Smad2信號通路抗野百合堿所致大鼠肺動脈高壓

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基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

蛇床子素通過下調(diào)TGF-β1/Smad2信號通路抗野百合堿所致大鼠肺動脈高壓

李葉麗，王穎婉，錢志強(qiáng)，朱玲，楊丹莉

(遵義醫(yī)學(xué)院 藥理學(xué)教研室暨基礎(chǔ)藥理省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 遵義563099)

[摘要]目的 觀察蛇床子素(Ost)對野百合堿所致大鼠肺動脈高壓(PAH)的干預(yù)作用，并探討其可能機(jī)制。方法 200~220 g清潔級雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對照組(n=8)，模型組(n=12)，Ost低、高劑量組(10、20 mg/kg，n=8)。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，模型組和Ost低、高劑量組大鼠經(jīng)頸背部一次性皮下注射野百合堿 50 mg/kg建立PAH模型，Ost低、高劑量組于造模后第1天開始給藥(ig，qd)，正常對照組和模型組給予等量溶媒。給藥期間觀察大鼠一般狀況，給藥28 d后采用右心導(dǎo)管術(shù)檢測肺動脈壓；通過HE染色觀察肺小動脈病理學(xué)變化；Western blot檢測肺組織轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1蛋白的表達(dá)及Smad2的磷酸化水平。結(jié)果 與正常對照組相比，模型組大鼠肺動脈壓升高(P<0.05)；肺小動脈中膜明顯增厚、管腔狹窄；TGF-β1蛋白的表達(dá)及Smad2的磷酸化水平均明顯上調(diào)(P<0.05)。與模型組相比，Ost低、高劑量組大鼠肺動脈壓降低(P<0.05)；肺小動脈中膜變?。籘GF-β1蛋白的表達(dá)及Smad2的磷酸化水平均明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)論 Ost具有抗野百合堿所致大鼠PAH的作用，其機(jī)制可能與下調(diào)TGF-β1/Smad2信號通路有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]蛇床子素；野百合堿；SD大鼠；肺動脈高壓；轉(zhuǎn)化生長因子β1/Smad2

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是以肺小動脈血管重構(gòu)、肺血管阻力升高并進(jìn)行性加重為主要特征，最終導(dǎo)致右心衰竭,甚至死亡的病理生理綜合征[1]。該病發(fā)病隱匿、治療棘手、預(yù)后惡劣。PAH的發(fā)生與肺動脈重構(gòu)密切相關(guān)，肺動脈重構(gòu)是內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及成纖維細(xì)胞的增殖與凋亡速率失衡所致，主要表現(xiàn)為肺動脈內(nèi)皮功能障礙，中膜平滑肌細(xì)胞異常增殖、并向內(nèi)膜遷移，血管外膜膠原沉積，順應(yīng)性降低等[1-2]。研究表明，在野百合堿誘導(dǎo)的PAH中，轉(zhuǎn)化生長因子(transforming growth factor，TGF)-β1蛋白的表達(dá)及Smad2的磷酸化水平均明顯上調(diào)，從而促進(jìn)了肺動脈重構(gòu)和肺血管阻力的增加，最終加速PAH的發(fā)生與發(fā)展[3-4]。因此，抑制TGF-β1/Smad2信號通路的活化是防治肺動脈重構(gòu)、治療PAH的關(guān)鍵。

蛇床子素(Osthole，Ost)又名甲氧基歐芩酚、歐芹酚甲醚、喔斯腦，是從傘形科蛇床屬植物蛇床Cnidiummonnier(L.) Cusson的果實(shí)中提取的一種香豆素類化合物，其化學(xué)名為7-甲氧基-8-異戊烯基香豆素，是蛇床子中含量最高的一種烴基香豆素類有效化學(xué)成分[5]。已有研究表明，Ost具有抗炎、抗氧化、抗增殖、擴(kuò)張血管、抑制血栓形成、抗血小板聚集、調(diào)血脂等藥理作用，可用于高血壓、心絞痛、冠心病、腦動脈硬化等疾病的治療[6-8]。野百合堿誘導(dǎo)的PAH模型是目前公認(rèn)較為理想的PAH模型之一，其不僅適用于闡明PAH的發(fā)病機(jī)制，還可用于新的治療藥物的測試[9]。因此，本研究擬采用野百合堿誘導(dǎo)的PAH模型，觀察Ost對野百合堿誘導(dǎo)的PAH的作用，并探討其相關(guān)機(jī)制，為Ost的開發(fā)利用提供基礎(chǔ)藥理學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1藥品及試劑Ost(純度≥98%，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司)；野百合堿(Sigma公司)；TGF-β1兔抗大鼠抗體(美國Abcam公司)；p-Smad2兔抗大鼠抗體(美國Abcam公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的β-actin小鼠抗大鼠抗體(上?？党缮锛夹g(shù)有限公司)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(英國CST公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)；ECL+發(fā)光劑(江蘇碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.2實(shí)驗(yàn)動物200~220 g清潔級雄性SD大鼠，由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號：SCXK(渝)2012-0005。

1.3主要儀器和設(shè)備PowerLab/8SP生物監(jiān)測儀(澳大利亞AD instruments公司)；Leica光學(xué)顯微鏡及照相系統(tǒng)(德國Leica Microsystems Ltd)；Mini-PROTEAN3電泳儀、Mini Trans-Blot轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、CCD成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)。

1.4分組、造模及給藥所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)抽取8只經(jīng)頸背部一次性皮下注射生理鹽水5 mL/kg作為正常對照組，其余大鼠均經(jīng)頸背部一次性皮下注射野百合堿 50 mg/kg建立PAH模型，造模大鼠隨機(jī)分為3組。其中，Ost低、高劑量組于造模后第1天開始給藥(ig，qd)，模型組和正常對照組給予等量溶媒(ig，qd)，分組情況如下:正常對照組(n=8)，模型組(n=12)，Ost低、高劑量組(10、20 mg/kg，n=8)。

1.5血流動力學(xué)檢測給藥28 d后，稱大鼠體重，予7%水合氯醛5 mL/kg腹腔注射麻醉成功后，采用右心導(dǎo)管術(shù)從大鼠右側(cè)鎖骨下外靜脈插入導(dǎo)管，經(jīng)右上腔靜脈進(jìn)入右心房，再到右心室，最后轉(zhuǎn)入肺動脈，根據(jù)壓力波形變化判斷導(dǎo)管是否進(jìn)入相應(yīng)部位，并采集肺動脈壓力波形。

1.6肺小動脈病理學(xué)檢查取左肺遠(yuǎn)離肺門處5 mm左右組織塊，置于4%甲醛溶液中固定48 h后，脫水、包埋、行HE染色，光鏡下觀察肺小動脈病理學(xué)變化。

1.7肺組織TGF-β1蛋白和Smad2磷酸化水平的檢測取各組大鼠冰凍肺組織約100 mg，剪碎后置于含有蛋白酶抑制劑和原釩酸鈉的蛋白裂解液中，冰上勻漿提取總蛋白，BCA法對蛋白進(jìn)行定量。10%的SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白后，TGF-β1、p-Smad2和β-actin蛋白分別采用恒流220 mA 濕轉(zhuǎn)88、120和86 min至PVDF膜上，室溫封閉2 h(封閉液為含有5%脫脂奶粉的TBST)，分別放入相應(yīng)的一抗稀釋液中4 ℃過夜(TGF-β1按1∶400稀釋，p-Smad2按1∶500稀釋，β-actin按1∶5 000稀釋)，室溫孵育二抗(1∶2 000)1 h，暗室曝光，采用Quantity One定量分析軟件進(jìn)行灰度分析。

2結(jié)果

2.1Ost對大鼠一般狀況的影響與正常對照組相比，模型組大鼠在造模7 d后，毛發(fā)晦暗、呼吸急促、活動減少、進(jìn)食減少，并分別于造模后第14、20、24、27天各自發(fā)性死亡1只。與模型組比較，Ost低、高劑量組大鼠毛發(fā)較為光澤、呼吸較為平穩(wěn)、活動增加、食欲增強(qiáng)，且無死亡。

2.2Ost對大鼠肺動脈壓的影響與正常對照組

相比，模型組大鼠肺動脈最大壓明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，Ost低、高劑量組大鼠肺動脈最大壓均降低(P<0.05)。結(jié)果(見圖1)。

與正常對照組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05。圖1　Ost對大鼠肺動脈最大壓的影響(n=6)

A：正常對照組；B：模型組；C：Ost低劑量組；D：Ost高劑量組。圖2　Ost對大鼠肺小動脈形態(tài)學(xué)的影響(HE×200)

2.3Ost對大鼠肺小動脈形態(tài)學(xué)的影響與正常對照組相比，模型組大鼠肺小動脈中膜明顯增厚、管腔狹窄。與模型組相比，Ost低、高劑量組大鼠肺小動脈中膜變薄、管腔增寬(見圖2)。2.4Ost對大鼠肺組織TGF-β1蛋白表達(dá)及Smad2磷酸化水平的影響與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織TGF-β1蛋白的表達(dá)和Smad2的磷酸化水平明顯上調(diào)(P<0.05)。與模型組相比，Ost低、高劑量組大鼠肺組織TGF-β1蛋白的表達(dá)及Smad2的磷酸化水平均明顯下調(diào)(P<0.05)。結(jié)果(見圖3)。

與正常對照組相比，#P<0.05；與模型組相比，*P<0.05?！　D3　Ost對大鼠肺組織TGF-β1和p-Smad2的影響(n=3)

3討論

野百合堿誘導(dǎo)的PAH是目前學(xué)術(shù)界公認(rèn)的制備PAH的模型，野百合堿經(jīng)肝代謝后生成野百合堿吡咯，后者選擇性作用于肺血管床，使肺動脈內(nèi)皮細(xì)胞受損，進(jìn)而引起肺動脈高壓。該模型具有操作簡單、模型穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠肺動脈壓升高，肺小動脈中膜明顯增厚、管腔狹窄，表明造模成功。與模型組相比，Ost低、高劑量組肺動脈壓降低，肺小動脈中膜變薄，提示Ost可能具有抗野百合堿所致大鼠PAH的作用。

TGF-β具有調(diào)控組織修復(fù)、刺激結(jié)締組織生長、促使某些細(xì)胞因子生成，以及抑制血管形成等重要作用。在哺乳動物中有TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3三種亞型，其中以TGF-β1活性最強(qiáng)，在體細(xì)胞系中所占比例最高，也是TGF-β中研究最多的一個亞型。TGF-β1最初以無活性的前體蛋白存在，當(dāng)受到炎性因子TNF-α及其他因素刺激后在體內(nèi)酶解為活化型TGF-β1，并以自分泌和旁分泌的方式發(fā)揮調(diào)控作用。已有研究表明，TGF-β1是調(diào)控細(xì)胞增殖與分化的重要因子，能促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等增殖及表型轉(zhuǎn)化，參與多種心血管疾病的發(fā)生[3]。

Smad家族是最早被證實(shí)的TGF-β1下游因子，TGF-β1/Smad2信號通路在肺動脈重構(gòu)的發(fā)生與發(fā)展中扮演著重要角色。在靜息狀態(tài)下Smad2以單體形式存在，當(dāng)TGF-β1與其受體結(jié)合后，會使聚集在受體復(fù)合物周圍的Smad2，發(fā)生磷酸化并轉(zhuǎn)移至胞核[10]。TGF-β1通過Smad蛋白信號轉(zhuǎn)導(dǎo)刺激血管平滑肌細(xì)胞的增殖、遷移及纖連蛋白的合成，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積、血管增生，加重肺動脈重構(gòu)的發(fā)生[11-12]。

已有研究表明，在野百合堿誘導(dǎo)的PAH中，TGF-β1蛋白的表達(dá)及Smad2的磷酸化水平均明顯上調(diào)，從而促進(jìn)了肺動脈重構(gòu)和肺血管阻力的增加，最終導(dǎo)致PAH的形成[3-4,13]。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠肺組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)和Smad2的磷酸化水平均明顯上調(diào)，說明在野百合堿誘導(dǎo)的PAH模型中TGF-β1/Smad2信號通路被激活。與模型組相比，Ost低、高劑量組大鼠肺組織中TGF-β1蛋白的表達(dá)和Smad2的磷酸化水平均下調(diào)，提示Ost可能通過抑制TGF-β1/Smad2信號通路發(fā)揮抗肺動脈高壓的作用。

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[收稿2015-09-25;修回2015-11-05]

(編輯：王靜)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究

Osthole reverses the pulmonary arterial hypertension in monocrotaline-treated rats through decreasing the TGF-β1/Smad2 pathways

LiYeli,WangYingwan,QianZhiqiang,ZhuLing,YangDanli

(Department of Pharmacology, Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education, Zunyi Medical University, Zunyi Guizhou 563099, China)

[Abstract]Objective To investigate the effect of Osthole (Ost) on pulmonary arterial hypertension (PAH) in monocrotaline-treated rats, and to explore the mechanisms.Methods 200~220 g male Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group (n=8), model group (n=12), low dose of Ost treatment group (10 mg/kg, n=8) and high dose of Ost treatment group (20 mg/kg, n=8). All rats were given a single dose of monocrotaline 50 mg/kg subcutaneously to establish the PAH model except normal control group. Then the rats in the Ost treatment group were gavaged once daily from 1 day to 28 days. The other rats in the model group and normal control group were given the same amount of menstruum. After 28 days of administration, the pulmonary arterial pressure was measured by right heart catheterization. The morphological changes of the pulmonary artery were observed by HE staining. The protein expression of transforming growth factor (TGF)-β1 and the phosphorylation levels of Smad2 were detected by western blot.Results Compared with the control group, the pulmonary arterial pressure was increased (P<0.05), and the thickening of pulmonary artery was observed significantly in model group. The protein expression of TGF-β1 and the phosphorylation levels of Smad2 were up-regulated obviously in model group (P<0.05). Compared with the model group, the pulmonary arterial pressure was decreased (P<0.05), and the thickening of pulmonary artery was improved in Ost treatment group. The protein expression of TGF-β1 and the phosphorylation levels of Smad2 were down-regulated in Ost treatment group (P<0.05).Conclusion Ost can resist PAH in monocrotaline-treated rats, and the mechanism may be associated with decrease the levels of TGF-β1/Smad2 pathways.

[Key words]Osthole; monocrotaline; SD rats; pulmonary arterial hypertension; TGF-β1/Smad2

[中圖法分類號]R961

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號]1000-2715(2015)06-0567-04

[通信作者]楊丹莉，女，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：心血管藥理、抗炎免疫藥理，E-mail:zmuyangdanli@foxmail.com。

[基金項(xiàng)目]國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(NO：81360498)；貴州省教育廳基金資助項(xiàng)目(NO：黔省專合字[201293)。