丹紅注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

李龍珠，劉家軍，李賢玉，吳勝英*，郭俐宏

丹紅注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響

李龍珠1a，劉家軍1b，李賢玉2，吳勝英2*，郭俐宏3

目的 研究丹紅注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達(dá)的影響。方法 90只大鼠中，選擇12只為假手術(shù)組，另78只經(jīng)右側(cè)翼腭動脈線栓willis環(huán)阻塞60 min后再灌注60 min，反復(fù)3次，建立大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的動物模型。術(shù)后7 d選擇其中36只造模成功大鼠，隨機分為模型組、丹紅A組、丹紅B組。四組大鼠均采用尾靜脈注射給藥治療，并于治療前及治療14 d后分別檢測各組動物血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)蛋白質(zhì)及VEGF mRNA、缺氧誘導(dǎo)因子-1a (HIF-1a)、HIF-1a mRNA、受體胎肝激酶1(FLK-1)、FLK-1 mRNA，腦組織TTC染色并測定腦梗死范圍。結(jié)果 治療14 d后，丹紅組VEGF蛋白質(zhì)及VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA明顯增高；TTC組織學(xué)檢查顯示，部分腦組織神經(jīng)細(xì)胞溶合且排列紊亂，但腦梗死范圍明顯縮小。與模型組比較，各指標(biāo)差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；丹紅A組、B組各指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 丹紅注射液可減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注后血管內(nèi)皮炎癥反應(yīng)程度，其作用機制可能與其促進VEGF分泌、拮抗Ca2+內(nèi)流、松弛腦血管平滑肌、增加血管通透性、促進血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)缺血部位血管新生有關(guān)。

局灶性腦缺血再灌注損傷；丹紅注射液；血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子

0 引言

急性腦梗死(Acute cerebral infarction，ACI)又稱急性缺血性腦卒中，其起病急驟，病死率及致殘率達(dá)50%以上，是臨床常見的嚴(yán)重威脅人類健康的心腦血管疾病。臨床表現(xiàn)多以局灶性腦缺血梗死所致腦血管急性血流障礙及急性腦功能缺損為主[1]。流行病學(xué)資料顯示，每年新發(fā)病例200萬，死亡率達(dá)30%～50%[2]。近年來，丹紅注射液常用于治療此類心腦血管疾病，臨床效果可靠。目前，其對局灶性腦缺血再灌注損傷致血管內(nèi)皮再生的影響及其機制鮮有報道。本研究制備大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷模型，經(jīng)尾靜脈注射丹紅注射液，系統(tǒng)觀察丹紅注射液對局灶性腦缺血再灌注損傷模型大鼠VEGF表達(dá)的影響，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠90只，鼠齡6～8周，體重(200±20) g，雌雄兼用，由湖北醫(yī)藥學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(鄂)2014-0008，實驗動物設(shè)施使用許可證編號：SYXK(鄂)2014-0031。

1.2 藥品試劑及儀器 BL-420F生物機能實驗系統(tǒng)(成都泰盟電子有限公司)。精密電子天平(上海精密電子天平醫(yī)療儀器公司，F(xiàn)A-1004)。丹紅注射液(菏澤步長制藥有限公司，國藥準(zhǔn)字：Z20026866)；VEGF、FLK-1試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)，HIF-1 (北京博奧生生物技術(shù)公司)，提取mRNA試劑及反轉(zhuǎn)錄試劑(美國Invitrogen公司)。自制栓線(將釣魚線剪成長約50 mm，并在18 mm處作標(biāo)記，酒精消毒后置于生理鹽水中備用)。

1.3 大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷動物模型制備 參照文獻[3]，選擇78只大鼠用10%水合氯醛(300 mg/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉，仰臥固定，頸正中切口，分離右側(cè)頸總動脈并找到翼腭動脈起始部置一微動脈夾，同時夾閉頸總動脈及頸內(nèi)動脈主干近端。在頸外動脈剪一V型小口，將制備好的栓線插入，此時將頸外動脈殘端處絲線的松結(jié)拉緊，除去頸內(nèi)動脈的微動脈夾，繼續(xù)將絲線沿頸內(nèi)動脈插入18 mm或有阻力感為止，保持60 min后即可抽出絲線并除去微動脈夾再通60 min，反復(fù)3次。術(shù)后以左側(cè)前肢內(nèi)收、提尾懸空不能伸展左側(cè)前爪、行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈為入選標(biāo)準(zhǔn)。本次動物模型制備術(shù)后有51只大鼠存活且符合局灶性腦缺血再灌注損傷動物模型入選標(biāo)準(zhǔn)，模型成功率達(dá)65% (51/78)。選擇其中36只大鼠，采用隨機數(shù)字表法隨機均分為模型組及丹紅A組、B組，另選12只為假手術(shù)組(假手術(shù)組手術(shù)同上但不插入栓線)進行對照。采用經(jīng)尾靜脈注射給藥治療的方法，丹紅大劑量組給予丹紅注射液4 mL/kg，小劑量組減半(2 mL/kg)，假手術(shù)組及模型組注射等量生理鹽水，四組動物連續(xù)注射治療14 d。

1.4 檢測指標(biāo) 參照文獻[4]，在經(jīng)尾靜脈注射丹紅注射液治療前，四組大鼠各選6只斷頭處死，迅速分離出腦組織后放入液態(tài)氮中暫存，2 h內(nèi)轉(zhuǎn)移至-70 ℃低溫冰箱保存以備VEGF蛋白分析。治療14 d后，同上步驟取各組大鼠腦組織，研磨并2 000轉(zhuǎn)離心，嚴(yán)格按SP試劑盒說明操作，采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和免疫組織化學(xué)檢測腦組織治療前后各組腦組織標(biāo)本中VEGF、VEGF mRNA、HIF-la、HIF-la mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA表達(dá)。

1.5 大鼠腦梗死范圍 在治療14 d后斷頭處死4組大鼠，并迅速分離腦組織后濾紙吸干稱重，-20 ℃冰凍20 min，冠狀面均勻切成2 mm厚腦片，并迅速放入1% TTC溶液中，37 ℃避光染色30 min，4%多聚甲醛固定，此時梗死區(qū)著色加深，剝離著色梗死部位，用精密電子天平精確稱量，計算腦梗死范圍，腦梗死范圍(%)=梗死部位質(zhì)量/腦總質(zhì)量×100%。

2 結(jié)果

2.1 丹紅注射液對局灶性腦缺血大鼠VEGF等指標(biāo)的影響 治療后14 d，模型組VEGF蛋白質(zhì)、VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA的表達(dá)呈上調(diào)趨勢，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=57.37～75.86，q=8.30～121.21，P<0.05)，提示局灶性腦缺血造模成功。缺血、缺氧是促進VEGF分泌的最主要因素，此時血管內(nèi)皮損傷嚴(yán)重。丹紅A、B組VEGF蛋白質(zhì)、VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1、FLK-1 mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)，與本組用藥前及模型組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=52.02～72.33，q=8.97～102.54，P<0.05)，但A、B組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 丹紅注射液對腦梗死范圍的影響 丹紅A、B組腦梗死范圍分別為12.36%±1.58%、12.60%±1.67%，明顯低于模型組(31.65%±2.72%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(q=7.58～87.98，P<0.05)，A、B組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.3 組織學(xué)檢查 見圖1。腦組織TTC圖片顯示，假手術(shù)組腦組織神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，著色均勻，無壞死現(xiàn)象；模型組梗死區(qū)著色加深，腦組織神經(jīng)細(xì)胞溶合排列紊亂，出現(xiàn)明顯壞死現(xiàn)象；丹紅A、B組TTC染色相似，梗死區(qū)著色均加深，梗死區(qū)明顯減少，有部分腦組織神經(jīng)細(xì)胞溶合且排列紊亂，但少于模型組。

表1 丹紅注射液對局灶性腦缺血大鼠血管內(nèi)皮VEGF各項指標(biāo)的影響

注：與治療前比較，*P<0.05；與假手術(shù)組比較，#P<0.05；與模型組比較，&P<0.05

圖1 不同組別大鼠腦缺血梗死區(qū)病理圖片

3 討論

丹紅注射液是由丹參和紅花兩味中藥采用現(xiàn)代特殊工藝科學(xué)配方提取的復(fù)方注射液。丹參味辛性涼，“治心腦腹痛”(《吳普本草》)；紅花味辛性溫，“善通利經(jīng)脈”(《藥品化義》)[5]。丹紅注射液具有活血化瘀通經(jīng)、祛瘀止痛之功效[6]，能有效降低血液粘稠度，改善微循環(huán)，擴張血管，防治缺血再灌注損傷，進而改善心、腦供血不足，營養(yǎng)腦組織[7-8]，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于心腦血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)等疾病的治療[9]。

VEGF是一種高度特異性的促血管生長因子，參與動脈側(cè)支循環(huán)形成的調(diào)節(jié)，VEGF的高低常作為血管內(nèi)皮功能及側(cè)支循環(huán)建立情況的重要指標(biāo)[10]。正常情況下，氧自由基的生成與清除維持著動態(tài)平衡，血管內(nèi)皮保持其完整性。在急性腦梗死時，由于腦血管急性血流障礙，腦組織局部缺血缺氧，細(xì)胞Na+-K+-ATP酶大量釋放，Ca2+內(nèi)流并造成鈣超載，鈣超載可使線粒體受到破壞而導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，此時機體會產(chǎn)生大量的氧自由基，且機體清除氧自由基能力下降，血管內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重受損[11]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，丹參具有拮抗Ca2+內(nèi)流、改善ATP酶活性、松弛血管平滑肌改善微循環(huán)、提高組織耐缺氧的作用[12]。

本研究結(jié)果顯示，治療14 d后，丹紅注射液大小劑量組VEGF、VEGF mRNA、HIF-1a、HIF-1a mRNA、FLK-1及 FLK-1 mRNA表達(dá)均有不同程度的上調(diào)，說明丹紅注射液亦具有促進VEGF分泌、誘導(dǎo)血管再生、促進受損血管內(nèi)皮修復(fù)的功能[13]。推測其原因：丹紅注射液促進Ca2+-ATP酶活性恢復(fù)，增強Na+-K+-ATP酶活力，減少細(xì)胞內(nèi)鈣超載，并通過Na+-K+-ATP酶調(diào)節(jié)鈉氫交換抑制鈉鈣交換，阻止Ca2+內(nèi)流，改善心肌組織能量代謝[14]，起到活血化瘀、改善微循環(huán)、增加腦組織供氧的作用。急性缺血性腦卒中的臨床癥狀和預(yù)后有賴于動脈側(cè)支循環(huán)重建，因此，積極尋找具有促進缺血血管新生的臨床常用藥物對缺血性疾病的治療具有重大意義。側(cè)支循環(huán)的形成和開放能夠減輕心腦組織缺血缺氧，防止腦組織細(xì)胞壞死而改善臨床癥狀。VEGF是血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性促有絲分裂原[15]，可促進心腦等缺血組織的血管生成，促進側(cè)支循環(huán)血管重塑并建立有效的側(cè)支循環(huán)[16]。

本研究證實丹紅注射液具有增加血管內(nèi)皮VEGF分泌的作用，對血管內(nèi)皮細(xì)胞可能具有趨化反應(yīng)，誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，參與維持成熟血管的完整性，促進腦血管損傷后血管再生內(nèi)皮化，進而促使腦血管重塑的作用。但缺血再灌注損傷機制是一個多因素參與的復(fù)雜的病理改變過程，丹紅注射液如何在各個環(huán)節(jié)發(fā)揮調(diào)節(jié)和干預(yù)作用并阻斷其發(fā)生，還有待于深入研究。

綜上所述，丹紅注射液能夠增加缺血腦組織VEGF的表達(dá)，縮小腦梗死范圍，促進缺血部位新生血管的生成，對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷有一定的保護作用。

[1] Felberg RA,Burgin WS,Grotta JC,et al.Neuroprotection and the is Chemic cascade[J].CNS Spectrums,2000,5(3):52-58.

[2] 王婷,閆詠梅,曹影,等.丹紅注射液治療中風(fēng)(恢復(fù)期)瘀血閉阻證的臨床研究[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2014,12(2):148-149.

[3] 徐艷煒,孫莉,梁浩,等.腦缺血中12/15-脂氧合酶對過氧化物酶體增殖物激活受體γ調(diào)節(jié)作用的初步探討[J].中華神經(jīng)科雜志,2014,47(2):123-127.

[4] Ozmen S,Ayhan S,Demir Y,et al.Impact of gradual blood flow increase on ischemia-reperfusion injury in the rat cremaster microcirculationmodel[J].J Plast Reconstr Aesthet Surg,2008,61(8):939-948.

[5] 周松,陳騰,王青麗,等.丹紅注射液的藥理作用與臨床應(yīng)用概述[J].中國藥師,2008,11(8):987-989.

[6] Garcia JH,Yoshide Y,Chen H,et al.Progression from is-chemic injury to infarct following middle cerrebral artery oculusin in the rat[J].Am Pathol,1993,50(142):623-625.

[7] 楊光,曾紅,曾國明,等.丹紅注射液對局灶性腦缺血再灌注損傷的保護效應(yīng)[J].國外醫(yī)藥,2005,26(3):158-159.

[8] 尹宏斌.紅花化學(xué)成分的研究[J].中草藥,2001,32(9):776.

[9] 金波,劉安東,李剛,等.丹紅注射液對大鼠腦缺血再灌注后損傷的保護作用及機制研究[J].實用心腦肺血管病雜志,2009,17(1):35.

[10]王曉娟.丹參多酚酸鹽對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖及血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響[J].環(huán)球中醫(yī)藥雜志,2013,(7):492.

[11]王志丹,陳少玫.失眠癥中西醫(yī)治療的研究進展[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管雜志,2013,11(3):355-356.

[12]張莉,劉海燕.通心絡(luò)膠囊聯(lián)合美托洛爾治療冠心病心力衰竭92例[J].國際中醫(yī)中藥雜志,2014,36(1):57-58.

[13]溫曉競,朱秀燕,張敏,等.丹紅注射液對大鼠心肌缺血再灌注中一氧化氮、一氧化氮合酶和內(nèi)皮素的影響[J].陜西中醫(yī),2009,30(12):1680-1681.

[14]賈鳳玖,姚衛(wèi)華,趙青山,等.丹紅注射液和丹紅注射液聯(lián)合應(yīng)用對急性局灶性腦缺血患者肌鈣蛋白T的影響[J].中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志,2013,11(11):1385-1386.

[15]Komowski R,Fuch S,Leon MB,et al.Delivery strategies to achieve therapeutic myocardial angiogenesis[J].Circulation,2000,101(4):454-456.

[16]王鑫焱,盧國玲,李子王,等.復(fù)方丹參飲對急性心肌缺血大鼠心肌血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)的影響[J].中國中醫(yī)藥科技,2014,2(2):149-151.

Effect of danhong injection on vascular endothelial growth factor in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury

LI Long-zhu1a,LIU Jia-jun1b,LI Xian-yu2,WU Sheng-ying2*,GUO Li-hong3

(1.a.Department of Gynaecology and Obstetrics,b.Department of Gastroenterology,Shiyan Hospital of Traditional Chinese Medicine,Shiyan 442000,China;2.Department of Pathophysiology,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China;3.Department of Acupuncture,Taihe Hospital,Hubei University of Medicine,Shiyan 442000,China)

Objective To study the effects of danhong injection on vascular endothelial growth factor (VEGF) expression in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.Methods Twelve rats were selected as sham operated group(control group),78 rats received right pterygopalatine artery willis ring obstruction for 60 min and reperfusion for 60 min,the operation repeated for 3 times to establish the model of rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.Thirty-six successful model rats at 7 d after IR were randomly divided into model group,danhong A group and danhong B group.Rats in the 4 groups were medicated via tail vein injection.The protein content and mRNA expression of VEGF,hypoxia inducible factor-1a (HIF-1a) and receptor in fetal liver kinase 1 (FLK-1) were measured before treatment and at 14 d after treatment.The size of cerebral infarction was determined by brain tissue TTC staining.Results Compared with model group,the protein content and mRNA expression of VEGF,HIF-1a and FLK-1 in danhong groups were significantly higher at 14 d after treatment (P<0.05),the size of cerebral infarction reduced significantly (P<0.05).There was no significant difference in the above indexes between the two danhong groups (P>0.05).Conclusion Danhong injection can reduce the vascular endothelial cell inflammatory reaction in rats with focal cerebral ischemia reperfusion injury.The mechanism may be related to the promotion of VEGF secretary,antagonism of Ca2+inner flow,relaxation of vascular smooth muscle and increasing vascular permeability etc.

Focal cerebral ischemia reperfusion injury;Danhong injection;Vascular endothelial growth factor

2014-11-21

1.湖北省十堰市中醫(yī)醫(yī)院a.婦產(chǎn)科，b.消化科，湖北 十堰 442000；2.湖北醫(yī)藥學(xué)院病理生理室，湖北 十堰 442000；3.十堰市太和醫(yī)院(附屬湖北醫(yī)藥學(xué)院)針灸科，湖北 十堰 442000

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201508005