天然油脂和表面活性劑對(duì)發(fā)酵性絲孢酵母產(chǎn)油脂及脂肪酶的影響

張 毅，孫 曉 璐，侯 英 敏，孫 玉 梅

（大連工業(yè)大學(xué) 生物工程學(xué)院，遼寧 大連 116034）

0 引 言

脂肪酶（EC 3.1.1.3）是一類能在油水界面上催化長(zhǎng)鏈甘油酯水解和合成的羧酸酯酶［1］。在微生物合成油脂過程中，脂肪酶的可逆作用即脂質(zhì)合成對(duì)生長(zhǎng)、繁殖、積累養(yǎng)分有重要作用［2］。目前對(duì)于發(fā)酵過程中細(xì)胞內(nèi)脂肪酶活力變化與油脂積累關(guān)系的報(bào)道很少，有研究表明酵母細(xì)胞內(nèi)脂肪酶活力增加有利于細(xì)胞油脂積累［3］。

天然油脂中含有大量合成脂肪酸的中間物質(zhì)，對(duì)微生物產(chǎn)油有促進(jìn)作用［4］。大多數(shù)微生物只有在油類或者與油類相關(guān)物質(zhì)存在時(shí)才能產(chǎn)生脂肪酶［5］。許多研究表明發(fā)酵培養(yǎng)基中添加一定量的油脂如花生油、豆油、橄欖油等可以不同程度地促進(jìn)菌體產(chǎn)油和產(chǎn)酶［6－8］。表面活性劑可解除油脂存在使發(fā)酵系統(tǒng)供氧不足而抑制微生物生長(zhǎng)和代謝，增加微生物和酶與油脂的接觸機(jī)會(huì)［9］，使微生物充分利用油脂進(jìn)行發(fā)酵。陽離子型表面活性劑CTAB、非離子表面活性劑Tween 80 和陰離子表面活性劑SDS，可促進(jìn)微生物生產(chǎn)油脂［10］。此外，表面活性劑對(duì)菌體產(chǎn)脂肪酶也有比較明顯的影響，一般來說，非離子表面活性劑有促進(jìn)作用，陰離子表面活性劑主要起抑制作用［11］。

因此，研究油脂和表面活性劑對(duì)微生物產(chǎn)油脂的影響，對(duì)微生物合成油脂的代謝調(diào)節(jié)具有重要的意義。本文考察了天然油脂和表面活性劑對(duì)發(fā)酵性絲孢酵母產(chǎn)油脂及脂肪酶的影響，并初步探討酵母細(xì)胞內(nèi)脂肪酶活力與油脂產(chǎn)量的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌 種

發(fā)酵性絲孢酵母（Trichosporonfermentans）：CICC1256，購(gòu)自中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院。

1.2 主要儀器、試劑

儀 器：JB－4A 磁力攪拌器、RZ－UVA2000－CC07組織搗碎機(jī)、LDZX－40數(shù)顯恒溫水浴鍋等。

試劑：大豆油，食用級(jí)；豬油，食用級(jí)；香河溢達(dá)油脂有限公司生產(chǎn)；Tween 80，分析純，石家莊海森化工有限公司生產(chǎn)；洗潔精，廣州奧奇麗有限公司生產(chǎn)；其余試劑均為分析純或生物試劑。

1.3 培養(yǎng)基

固體斜面培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖20.0，酵母粉10.0，蛋白胨10.0，瓊脂20%，pH 自然，于1.0×105Pa滅菌15min。

液體種子培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖100.0，蛋白胨5.3，酵母膏2.0，MgSO40.5，pH 自然，于0.8×105Pa 滅菌20 min，尿素2.0，于0.5×105Pa滅菌15min。

發(fā)酵培養(yǎng)基（g／L）：葡萄糖100.0，蛋白胨1.8，酵母膏0.5，KH2PO42.0，pH 自然，于0.8×105Pa滅菌20min。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 培養(yǎng)方法

將4 ℃保存的酵母菌種接種于固體斜面上，在30 ℃下活化培養(yǎng)3d后轉(zhuǎn)接至液體種子培養(yǎng)基中，于30 ℃、160r／min搖床中培養(yǎng)，待種子長(zhǎng)好后，接入發(fā)酵培養(yǎng)基，于30 ℃、160r／min搖床中進(jìn)行發(fā)酵。

1.4.2 天然油脂對(duì)發(fā)酵的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基滅菌前加入不同濃度大豆油和體積分?jǐn)?shù)為1.0%的豬油，發(fā)酵過程中定期取樣檢測(cè)細(xì)胞油脂含量和胞內(nèi)脂肪酶活力。

1.4.3 表面活性劑對(duì)發(fā)酵的影響

在發(fā)酵培養(yǎng)基中滅菌前加入1.0%大豆油，并分別添加0.5%、1.0% Tween 80，0.5%、1.0%洗潔精，發(fā)酵過程中定期取樣檢測(cè)細(xì)胞油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)和胞內(nèi)脂肪酶活力。

1.4.4 生物量測(cè)定

采用細(xì)胞干重法［12］。

1.4.5 細(xì)胞油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

采用酸熱法［13］。

1.4.5.2 細(xì)胞油脂提取

采用乙醚－石油醚法［14］。用定量無水乙醇將破碎的細(xì)胞移入100mL具塞量筒中，加入15mL乙醚，充分混勻，靜置分層，用移液管吸取醚液層放入燒杯，在水浴上蒸出醚，得到油脂，于80℃干燥2h，冷卻后稱重。

w（油脂）＝油脂質(zhì)量／干菌體質(zhì)量×100%

1.4.6 粗酶液制備

在發(fā)酵過程中，定時(shí)取發(fā)酵液，于6 000r／min離心10min，收集菌體，稱取2g菌體與50mL磷酸緩沖溶液混合，在冰水浴中超聲破碎（破碎功率1 200 W，破碎時(shí)間30min，間隔時(shí)間10s），收集細(xì)胞破碎液，離心取上清液，即為粗酶液。

1.4.7 酶活力測(cè)定

臀肌攣縮癥在我國(guó)發(fā)病率比較高，但是其發(fā)病機(jī)制還不十分明確。常見原因是由于臀部注射了含有苯甲醇作為溶劑的青霉素形成臀部肌肉表面的攣縮帶所致［4］。患者往往不能并腿下蹲、不能蹺二郎腿，并且髖部常出現(xiàn)彈響。臀肌攣縮癥給廣大患者造成了很大的身心壓力。既往多采用切開松解攣縮帶的方法治療臀肌攣縮癥。但是手術(shù)的切口大，不美觀。近年由于關(guān)節(jié)鏡微創(chuàng)手術(shù)的逐步普及，我國(guó)劉玉杰教授等率先開始采用關(guān)節(jié)鏡進(jìn)行關(guān)節(jié)外應(yīng)用［5］。關(guān)節(jié)鏡微創(chuàng)手術(shù)治療臀肌攣縮癥就是關(guān)節(jié)鏡關(guān)節(jié)外應(yīng)用的一大創(chuàng)舉［5～8］。

采用酸堿滴定法定量測(cè)定［14］。

脂肪酶活力定義：在測(cè)定條件下，每分鐘釋放1μmol脂肪酸所需的酶量為一個(gè)酶活力單位（U）。

2 結(jié)果與討論

2.1 天然油脂對(duì)發(fā)酵性絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂及脂肪酶活力的影響

2.1.1 天然油脂對(duì)細(xì)胞油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖1可知，在添加不同天然油脂的條件下，細(xì)胞油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸增大，發(fā)酵72h達(dá)到最大。發(fā)酵過程中以培養(yǎng)基中加入體積分?jǐn)?shù)為1.0%大豆油時(shí)細(xì)胞油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大，最大值為30.7%；加入豬油時(shí)，細(xì)胞油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)最大值僅為21.6%。

2.1.2 天然油脂對(duì)胞內(nèi)脂肪酶活力的影響

由圖2可知，各條件下的細(xì)胞內(nèi)脂肪酶活力變化無明顯規(guī)律；整個(gè)發(fā)酵過程中幾乎均以加入體積分?jǐn)?shù)為1.0%大豆油時(shí)脂肪酶活力最高，發(fā)酵60h達(dá)到峰值347.5U／mL；加入體積分?jǐn)?shù)為1.0%豬油發(fā)酵72h 脂肪酶活力才有最大值247.5U／mL，比添加大豆油時(shí)脂肪酶活力低，達(dá)到最大脂肪酶活力所需時(shí)間長(zhǎng)。

圖1 天然油脂對(duì)細(xì)胞油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響Fig.1 Effects of natural oils on lipid content in cells

圖2 天然油脂對(duì)菌體脂肪酶活力的影響Fig.2 Effects of natural oils on intracellular lipase activity

實(shí)驗(yàn)表明，添加適量大豆油更有利于細(xì)胞產(chǎn)油和產(chǎn)酶。這是因?yàn)榇蠖褂椭泻写罅緾12～C18等不同鏈長(zhǎng)的脂肪酸［15］，其中部分脂肪酸組成與菌體油脂中脂肪酸組成有一定的相似性［16］，可被菌體吸收作為合成油脂的中間物，有利于細(xì)胞積累油脂［17］，但過多加入會(huì)影響溶解氧以至于影響菌體產(chǎn)脂和產(chǎn)酶［18］。豬油對(duì)細(xì)胞產(chǎn)油脂及產(chǎn)酶的提高效果不如大豆油。

2.2 表面活性劑對(duì)發(fā)酵性絲孢酵母產(chǎn)油脂及脂肪酶活力的影響

2.2.1 表面活性劑對(duì)細(xì)胞油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

由圖3可知，在添加不同表面活性劑的條件下，細(xì)胞油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，發(fā)酵72h達(dá)到最大。Tween 80 對(duì)細(xì)胞產(chǎn)油提升效果強(qiáng)于洗潔精。添加低濃度Tween 80對(duì)細(xì)胞產(chǎn)油有利，最適添加量為0.5%（體積分?jǐn)?shù)），細(xì)胞最大油脂產(chǎn)量為30%；加入洗潔精時(shí)細(xì)胞最大油脂產(chǎn)量?jī)H為14.3%。

圖3 表面活性劑對(duì)細(xì)胞油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)量的影響Fig.3 Effect of surfactant on lipid content in cells

2.2.2 表面活性劑對(duì)胞內(nèi)脂肪酶活力的影響

由圖4可知，發(fā)酵培養(yǎng)基中加入Tween 80對(duì)細(xì)胞產(chǎn)酶促進(jìn)效果比洗潔精好。加入低濃度表面活性劑可在較短時(shí)間內(nèi)達(dá)最大產(chǎn)酶活力。Tween 80最適添加量為0.5%（體積分?jǐn)?shù)），發(fā)酵24h脂肪酶活力即達(dá)最大值297U／mL。加入洗潔精后最高脂肪酶活力僅為148.5U／mL。

圖4 表面活性劑對(duì)菌體脂肪酶活力的影響Fig.4 Effect of surfactant on intracellular lipase activity

以上結(jié)果表明，培養(yǎng)基中應(yīng)加入體積分?jǐn)?shù)為0.5%的Tween 80 可促進(jìn)細(xì)胞油脂積累和產(chǎn)胞內(nèi)脂肪酶。這是由于Tween 80可使大豆油與發(fā)酵液能更均勻混合，可增強(qiáng)脂肪酶活力以及菌體發(fā)酵產(chǎn)油脂的正效應(yīng)［9］；同時(shí)能增加細(xì)胞膜的通透性，有助于菌體對(duì)大豆油的吸收，使油脂積累效果更明顯［8，16］。低濃度表面活性劑有利于細(xì)胞較快積累油脂和產(chǎn)酶，可能高濃度表面活性劑對(duì)微生物代謝有一定的抑制作用。

2.3 酵母細(xì)胞脂肪酶活力與油脂產(chǎn)量關(guān)系的研究

通過對(duì)比圖1和圖2，加入體積分?jǐn)?shù)為1.0%大豆油的培養(yǎng)基，細(xì)胞油脂產(chǎn)量與胞內(nèi)脂肪酶活力均為最大；在發(fā)酵48～72h期間，脂肪酶活力提高最快，細(xì)胞油脂積累也最大，說明胞內(nèi)脂肪酶活力增加對(duì)細(xì)胞積累油脂有促進(jìn)作用。由圖3和圖4可得，培養(yǎng)基中加入Tween 80 時(shí)細(xì)胞中最大油脂產(chǎn)量和最高產(chǎn)酶活力均比加入洗潔精時(shí)高，表明細(xì)胞油脂含量與胞內(nèi)脂肪酶活力呈現(xiàn)出一定正相關(guān)性。

3 結(jié) 論

（1）發(fā)酵培養(yǎng)基加入體積分?jǐn)?shù)為1.0%的大豆油或0.5%的Tween80 對(duì)發(fā)酵性絲孢酵母產(chǎn)油和產(chǎn)酶有促進(jìn)作用，最大油脂質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為30.7%，30%，最大脂肪酶活力分別為347.5，297U／mL。

（2）低濃度表面活性劑對(duì)菌體產(chǎn)油和脂肪酶更有利。

（3）發(fā)酵性絲孢酵母細(xì)胞中脂肪酶活力增加對(duì)細(xì)胞油脂積累有促進(jìn)作用。

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