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    孕二烯酮緩釋微針給藥形式的處方前研究

    2017-04-19 08:40:30馬佳男寧美英段雪艷
    中國計劃生育學雜志 2017年12期
    關鍵詞:透皮微針原料藥

    馬佳男 寧美英 段雪艷

    1.國家衛(wèi)生計生委科學技術研究所藥物和醫(yī)用材料研究中心(北京,100081);2 北京協(xié)和醫(yī)學院研究生院

    孕二烯酮(GEST)為第三代孕激素,1977年由德國先令公司制備發(fā)明[1],臨床試驗表明GEST具有很強的孕激素活性,無需代謝就能發(fā)揮作用[2],較少劑量就能達到良好的避孕效果。GEST的上市產(chǎn)品主要為口服給藥,如美國惠氏公司研發(fā)上市的“敏定偶”是GEST與炔雌醇的復方避孕片劑,另一個為Tri-Gynera三相片[3]。除口服給藥途徑外,含GEST的陰道環(huán)、透皮貼劑、宮內(nèi)節(jié)育器和皮下埋植劑也受到了國內(nèi)外研究者的廣泛關注,相關內(nèi)容正處于研究階段[4-8]。微針給藥系統(tǒng)是一種新型的給藥方式,通過穿過角質層將藥物運送到皮下,幾乎不會觸及痛覺神經(jīng),所以不會產(chǎn)生痛感及對皮膚的損傷,同時避免了首過效應和對胃腸道的刺激。溶解微針選用水溶性可降解高分子材料為基質材料,安全環(huán)保,人們比較容易接受。本課題組擬將GEST制備成緩釋溶解微針。GEST的體外溶出速率緩慢,提高難溶性藥物溶解度和溶出速率的有效方法之一就是將藥物制備成固體分散體[9],因此本研究選用固體分散體制備技術,以聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)為載體,采用溶劑法制備GEST固體分散體,以期提高GEST的體外溶出速率[10]。同時將固體分散體制備成溶解微針,初步測定了GEST原料藥和固體分散體微針的體外透皮釋放效果,為GEST緩釋避孕微針處方的進一步研究提供基礎。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與試劑

    GEST原料藥(秦皇島紫竹藥業(yè)有限公司,批號:92801510001)、PVPK30(博愛新開源制藥股份有限公司,批號:P160307002-1)、PVPK90(博愛新開源制藥股份有限公司,批號:P160305001-1)、無水乙醇(北京化工廠,批號:20151008)、磷酸二氫鉀(北京化工廠,批號:20160225)、氫氧化鈉(北京化工廠,批號:20160619)、溴化鉀(天津市光復科技發(fā)展有限公司,批號:20160517)。實驗用水為自制純凈水,其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器

    BT 224 S 電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)、lGJO.5-Ⅱ冷凍干燥機(軍事醫(yī)學科學院實驗儀器廠) 、SHZ-ST-A 恒溫振蕩水浴(金壇市朱林盛唐儀器制造廠)、DZF-6050 真空干燥箱(上海一恒科技有限公司)、ZRS-8G 智能溶出試驗儀(天津天大天發(fā)科技有限公司)、Lambda 35 紫外可見分光光度計(美國Perkin Elmer公司);、差示掃描量熱儀(美國Perkin Elmer公司)、D8 Advance 多晶X-射線衍射儀(德國Bruker公司)、Nexus 670傅立葉紅外光譜儀(美國Thermo公司)、K-24BL型透皮擴散試驗儀(上海鍇凱科技貿(mào)易有限公司)。

    1.3 GEST分析方法的建立與評價

    1.3.1最大吸收波長的確定配制10 μg/ml GEST乙醇溶液,進行紫外-可見分光光度法掃描,掃描范圍為200-500 nm。配制10 μg/ml PVPK30乙醇溶液,同法進行紫外分光光度法掃描。

    1.3.2標準曲線的建立精密稱量0.0400 g GEST置于100 ml量瓶中,用乙醇溶解并定容、搖勻,得400 μg/ml的對照品儲備液。精密移取上述儲備液0.5,1,1.5,2,2.5,3,3.5,4 ml于100 ml量瓶中,加入乙醇稀釋至刻度,搖勻,配制成2,4,6,8,10,12,14,16 μg/ml系列濃度的GEST標準溶液。在239 nm處測定吸光度。

    1.3.3穩(wěn)定性試驗取6 μg/ml的GEST標準溶液,于0,2,4,8,12,24,48 h在239 nm處測定吸光度進行穩(wěn)定性考察。

    1.3.4精密度試驗取高、中、低3個濃度(14,8,4 μg/ml)的GEST標準溶液,在239 nm波長處用紫外分光光度法分別在1 d內(nèi)連續(xù)測定3次,計算日內(nèi)精密度;同法每天測定1次,連續(xù)測定3 d,計算日間精密度。

    1.3.5回收率試驗按輔料最高比例(1:4)的固體分散體的處方組成進行回收率試驗。精密稱量高、中、低3種質量的GEST各3份,分別置于100 ml量瓶中,加入相應比例(1:4)的PVPK30,加無水乙醇溶解并定容,搖勻,精密移取1 ml于50 ml量瓶中,用無水乙醇稀釋定容,搖勻,測定紫外分光光度計,計算平均回收率。

    1.4 固體分散體和物理混合物的制備

    選用PVPK30為分散載體,溶劑法制備固體分散體,按質量比1:0.5,1:1,1:2,1:4稱量GEST和PVPK30,加入適量無水乙醇至GEST和PVPK30全部溶解,不斷加熱攪拌蒸發(fā)乙醇至粘稠狀態(tài),于-40℃真空冷凍干燥3 h,然后在80℃干燥2 h,粉碎,過120目篩,得白色固體分散體粉末,置于干燥處保存?zhèn)溆肹11]。將GEST和PVPK30按比例稱取適量,混合均勻,即得物理混合物。

    1.5 固體分散體溶解度的測定

    根據(jù)2015年版《中華人民共和國藥典》緩沖液指導方法[12],配制pH 7.4磷酸鹽緩沖液,稱取過量的原料藥、物理混合物和固體分散體,分別置于錐形瓶中,加入100 ml磷酸鹽緩沖液,置于恒溫水浴振蕩器中,溫度設定為37℃,分別于2,4,8,12,24 h處取樣,經(jīng)0.45 μm濾膜過濾,取續(xù)濾液于239 nm處測定吸光度,計算其溶解度。

    1.6 固體分散體的鑒別

    1.6.1體外溶出度的考察采用2015年版《中華人民共和國藥典》溶出度與釋放度測定法[13],溶出介質為pH 7.4磷酸鹽緩沖液,精密稱取GEST原料藥、物理混合物、固體分散體(含有等量的GEST)分別置于裝有900 ml溶出介質的溶出杯中,轉速50 r/min ,溫度37 ℃,分別于5,10,20,30,40,50,60,90 min處取樣10 ml,同時補充同溫同體積的新鮮溶出介質,樣品用0.45 μm的微孔濾膜過濾,取續(xù)濾液于239 nm波長處進行紫外檢測,記錄吸光度,計算濃度,并換算成累積溶出百分率。

    1.6.2紅外光譜(IR)分析采用溴化鉀壓片法制備樣品,掃描范圍為500~4000 /cm,依次對GEST原料藥、PVPK30、物理混合物(1:4,w/w)、固體分散體(1:4,w/w)進行IR分析。

    1.6.3 X-射線粉末衍射(XRD)分析Cu靶,鎳濾色片,管電壓40 kV,管電流40 mA,分別對GEST原料藥、PVPK30、物理混合物(1:4,w/w)、固體分散體(1:4,w/w)進行XRD分析。

    1.6.4差示掃描熱量法(DSC)分析以空鋁鉗為參比物,另一鋁鉗中放入適量樣品,升溫速度為10 ℃/min ,氮氣流速為20 ml/min ,掃描范圍為50~250 ℃,分別對GEST原料藥、PVPK30、物理混合物(1:4,w/w)、固體分散體(1:4,w/w)進行DSC分析。

    1.7 微針的制備和體外透皮釋放試驗

    1.7.1微針的制備取適量的PVPK90置于純水中,靜置溶脹,待溶脹結束后分別加入含等質量GEST的原料藥和固體分散體(1:4,w/w),攪拌均勻,得到基質溶液,將基質溶液加入至微針模具,抽真空,待微針干燥后脫模,即得載藥微針。

    1.7.2微針的體外透皮釋放試驗取于- 20℃保存的約800 μm厚的幼豬皮膚,經(jīng)pH 7.4的PBS緩沖介質浸泡30 min后,將上述制備的GEST原料藥和固體分散體微針按壓于皮膚上,持續(xù)30 s[14]。將皮膚固定在體積為20 ml的擴散池上,角質層向上,以pH 7.4的PBS緩沖介質為接收液,擴散池內(nèi)置磁力攪拌子,轉速約為160 r/min,恒溫水浴溫度為37 ℃,每天同一時間取樣,將接收液全部取出后加入等量的新鮮介質繼續(xù)進行釋放試驗,連續(xù)試驗7 d。取出的樣品經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過后進行高效液相色譜(HPLC)測定,計算累積釋放量。

    2 結果

    2.1 GEST分析方法的建立與評價

    2.1.1最大吸收波長的確定由全波長掃描圖譜圖1可以得出,原料藥GEST乙醇溶液的最大吸收波長為239 nm,輔料PVPK30在239 nm處沒有吸收,表明PVPK30對GEST的紫外吸收測定沒有影響,因此選擇239 nm為測定波長。

    2.1.2標準曲線的建立在239 nm處,采用紫外分光光度法測定系列標準溶液的吸光度,以吸光度(A)對濃度(C, μg/ml)進行線性回歸,得到標準曲線方程為y=0.057x+0.0039,r=0.9999,線性范圍為2.0 ~ 16.0 μg/ml,標準曲線如圖2。

    圖1GEST/PVPK30的紫外掃描圖譜圖2孕二烯酮乙醇溶液的標準曲線

    2.1.3穩(wěn)定性試驗于239 nm波長處,采用紫外分光光度法在48 h內(nèi)連續(xù)測定同一樣品,計算得到平均A,RSD值為1.67%(< 2%),表明標準溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    2.1.4精密度試驗高、中、低3個濃度(14,8,4 μg/ml)的GEST標準溶液的日內(nèi)精密度分別為0.12%,0.45%,0.71%,日間精密度分別為0.58%,0.64%,1.54%。數(shù)據(jù)表明,GEST標準溶液的精密度良好。

    2.1.5回收率試驗GEST-PVPK30固體分散體的各組回收率平均為102.05%,RSD為1.23%,數(shù)據(jù)表明本法準確度高,符合藥典測定要求。

    2.2 固體分散體溶解度的測定

    GEST原料藥和固體分散體(1:0.5,1:1,1:2,1:4)在pH 7.4磷酸鹽緩沖液中的溶解度分別為6.91,7.95,7.69,8.44,9.39 μg/ml。結果表明,固體分散體能夠提高GEST的溶解度,并且隨著PVPK30比例的增加,溶解度有上升的趨勢。

    2.3 固體分散體的鑒別

    2.3.1體外溶出度的考察體外溶出試驗中,90 min時GEST原料藥和物理混合物(1:0.5,1:1,1:2,1:4)的累積溶出百分率都低于10%,而固體分散體(1:0.5,1:1,1:2,1:4)的累積溶出百分率分別為40.45%,37.00%,52.09%,69.56%。結果表明,固體分散體能顯著提高GEST在pH 7.4磷酸鹽緩沖液中的溶出速率,且隨著PVPK30載體比例的增加,溶出速率加快,見圖3。

    2.3.2 IR分析采用溴化鉀(KBr)壓片法制備樣品,掃描范圍為500~4000 /cm,根據(jù)圖譜可得:GEST原料藥在波數(shù)3380/cm(-OH)和3280/cm(≡C-H)處有強吸收峰[15],在物理混合物色譜中其強吸收峰還存在,但是在固體分散體中GEST的強吸收峰消失,且PVPK30的特征峰峰變寬,表明GEST中的羥基與PVPK30中的羰基可能發(fā)生了氫鍵作用。

    圖3 GEST / PVPK30體系的溶出曲線

    a:GESTb:PVPK30c:固體分散體(1:4)d:物理混合物(1:4)

    圖4GEST / PVPK30體系的紅外光譜圖

    2.3.3 XRD分析如圖5所示,GEST原料藥作為晶體,圖譜中出現(xiàn)多個衍射峰;載體PVPK30是無定形物,因此未檢測到特征衍射峰;藥物與載體的物理混合物中清晰地出現(xiàn)了藥物的衍射峰,但有不同程度的減弱,表明大部分藥物仍以晶體形態(tài)存在于混合物中。而在固體分散體(1:4)中,藥物的衍射峰消失,表明在形成固體分散體后,PVPK30對藥物產(chǎn)生抑晶作用,使藥物以無定形狀態(tài)或分子狀態(tài)高度分散在載體材料中,形成固體分散體。

    2.3.4 DSC分析GEST原料藥在205.32℃處有一個吸熱峰,PVPK30 無吸熱峰,物理混合物和固體分散體都沒有顯示特征的吸熱峰,但依據(jù)紅外測試和粉末衍射測試可知,固體分散體(1:4)中藥物的晶型狀態(tài)消失,表明DSC出現(xiàn)的情況可能由于物理混合物中GEST的含量較少,DSC不能靈敏的測出GEST的吸熱峰,見圖6。

    圖5 GEST / PVPK30體系的X-射線衍射圖譜

    圖6 GEST / PVPK30體系差示掃描量熱分析圖譜

    2.4 微針的體外透皮釋放試驗

    如圖7所示,在含等量GEST劑量的條件下,固體分散體微針的釋放速率明顯高于GEST原料藥微針,固體分散體微針的最小透皮速率為第7 d的10.56 μg/d,最大透皮速率為第3 d的32.03 μg/d,GEST原料藥微針的最小透皮速率為第4 d的2.95 μg/d,最大透皮速率為第1 d的9.52 μg/d。結果表明,將GEST制備成固體分散體能顯著促進藥物的釋放。

    圖7 GEST微針體外透皮累積釋放曲線

    3 討論

    本研究建立了紫外-可見光譜分析方法,該方法具有操作簡單、重復性好、測量精密度高和檢測快速等優(yōu)點,適合GEST的溶解度和體外溶出度的分析檢測。建立GEST的檢測方法時,建立的標準曲線中藥物濃度必須具有一定的線性范圍,而GEST在PBS溶液中的溶解度較低,其濃度范圍較窄,不符合要求;而GEST在乙醇和甲醇等有機溶劑中溶解度較大,具有較大濃度范圍,綜合環(huán)保角度和經(jīng)濟方面考慮,所以本研究采用乙醇作為溶劑。采用PBS作為藥物溶解度和溶出度測試溶液的溶劑是為了考察藥物在模擬體內(nèi)環(huán)境的條件下的釋放結果,且試驗初期的結果也顯示PBS溶劑對藥物含量的測定結果無干擾。初步試驗考察中,我們也比較了GEST醇質體的給藥形式,結果顯示其并不能增加藥物的溶出速率。

    在制備固體分散體時,考慮到微針的基質為PVPK90,比較了分別以PVPK30和PVPK90為載體材料制備的固體分散體,結果表明,PVPK90制備的樣品干燥性后變硬,不易粉碎,且難以過篩;PVPK30制備的樣品易于處理。分析原因是PVPK90制備的樣品粘度較大,因此選擇了PVPK30為載體制備固體分散體。后期處方研究也表明,以PVPK30為載體的固體分散體制備的微針的性質并未因此而發(fā)生改變。

    此外,本研究比較了GEST原料藥、不同比例物理混合物和固體分散體的體外溶出速率,結果表明,固體分散體的溶出速率均大于原料藥和物理混合物的溶出速率,其中GEST-PVPK30(1:0.5)固體分散體在溶解度和溶出度試驗中所得數(shù)據(jù)稍低于GEST-PVPK30(1:1)固體分散體,分析原因為實驗誤差所得,在總體看來,隨著PVPK30比例的增加,溶出速率逐漸增加;物理混合物的溶出速率和原料藥的溶出速率并無顯著性差異。分析原因:在固體分散體中,藥物以無定形狀態(tài)存在于載體中,加速了藥物的溶出。

    經(jīng)過紅外光譜分析、X-射線粉末衍射分析和DSC分析,表明成功制備固體分散體。GEST-PVPK30(1:4)物理混合物DSC分析結果中無GEST的吸熱峰,但是在GEST-PVPK30(1:0.5,1:1,1:2)物理混合物中均有GEST吸熱峰的出現(xiàn),分析原因為GEST-PVPK30(1:4)物理混合物中PVPK30比例較大,而藥物量較小,低于儀器的檢測靈敏度,因此未顯示出藥物的吸熱峰。結合固體分散體的溶解度和溶出速率,本研究采用GEST-PVPK30(1:4)固體分散體做為藥物前處理的最佳選擇。

    由此可見,固體分散體中,藥物以無定形形式存在于載體中[16],改善了藥物的分散狀態(tài),大大加快了藥物的溶出速率,且初步的含藥微針體外透皮釋放試驗也表明了固體分散技術能顯著促進藥物的釋放速率,因此我們選擇固體分散體的給藥形式制備GEST緩釋微針,為GEST緩釋避孕微針的進一步研究奠定了技術基礎。

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